專利名稱：鵝毛玉鳳花的組織培養(yǎng)繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鵝毛玉鳳花的組織培養(yǎng)繁殖方法和所使用 培養(yǎng)基。
二背景技術(shù)：
鵝毛玉鳳花(/^^"^^^加加")系蘭科玉鳳花屬植物，屬地生草本，其塊莖具有溫腎壯陽、 散寒祛風、燥濕殺蟲等藥用功效。
鵝毛玉鳳花生長的生態(tài)環(huán)境較為特殊，且植株生長緩慢；主要以地下塊莖進行繁殖，一 株苗一年只發(fā)生一個新的塊莖， 一個塊莖僅萌發(fā)生長形成一植株，繁殖系數(shù)極低；植株開花 結(jié)實率低，且多數(shù)發(fā)育不良，在自然條件下極難萌發(fā)形成新的植株。長期以來民間均依靠采 挖野生資源作為藥用，造成資源的枯竭。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以為人工栽培鵝毛玉鳳花提供 所需要的種苗，從而解決藥源短缺和物種的瀕危等問題。雖然目前許多蘭科名貴花丼和藥用 植物的組培技術(shù)已較為成熟，但目前在國內(nèi)外尚未見鵝毛玉鳳花組培技術(shù)的報道。
本發(fā)明提供了一種鵝毛玉鳳花的組織培養(yǎng)方法，解決其繁殖和物種保存問題，填補了國 內(nèi)外這方面的空白，對促進鵝毛玉鳳花種質(zhì)資源的保護及可持續(xù)利用具有重要的現(xiàn)實意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種鵝毛玉鳳花的組織培養(yǎng)繁殖方法，以解決鵝毛玉鳳花繁殖困難和種苗 缺乏的問題。在無菌條件下，將采集的成熟蒴果消毒后切開果皮，將種子均勻地撒播于培養(yǎng) 基表面，種子萌發(fā)形成原球莖，然后通過原球莖的增殖、分化，形成叢生苗，從而獲得生產(chǎn) 上所需的種苗。
本發(fā)明利用鵝毛玉鳳花種子進行無菌播種，成功實現(xiàn)了種子萌發(fā)、原球莖的獲得、原球 莖的增殖及分化成苗、苗的增殖和組培苗的煉苗移栽等。
(一) 本發(fā)明中的應用材料
鵝毛玉鳳花[//"^脂〃& ^"toto (Sw.) Schltr]種子，采自貴州省荔波縣。
(二) 本發(fā)明的技術(shù)方案
1. 鵝毛玉鳳花原球莖的誘導培養(yǎng)
將采集的野生鵝毛玉鳳花蒴果進行消毒處理，后用無菌水沖洗，然后用無菌濾紙吸干水 分。將其內(nèi)部的種子均勻地撒播于固體培養(yǎng)基1/2MS + NAA(萘乙酸)0.5mg/L + 3%蔗糖+0. 2% 活性炭，培養(yǎng)基pH5.8-6.0。種子培養(yǎng)10d后，發(fā)育良好的種子開始膨大，形成白色的原球 莖，后逐漸長大，表面出現(xiàn)白色的細絨毛。
2. 原球莖的增殖分化及其苗的增殖生根
將白色原球莖轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基1/2MS + NAA 0.2 mg/L + ZT(玉米素)5.0 mg/L + 3%蔗
糖+0.2%活性炭+0.75%瓊脂粉上，pH5. 8-6.0。培養(yǎng)約20d，白色小原球莖分化出葉原基， 后長出第一片真葉，形成小苗；培養(yǎng)30d左右，在小苗基部增殖新生成叢生形原球莖，后產(chǎn) 生分化，最后分化出叢生苗。將叢生的小苗分成單株轉(zhuǎn)接在苗增殖培養(yǎng)基上，單株苗繼續(xù)增 殖成叢生苗，同時發(fā)生根的同步生長，每株苗長有2-3條新根。 3.組培苗的煉苗移栽
將生長有根和葉的小苗先在室溫條件下，后用清水沖洗干凈苗基部的培養(yǎng)基，栽種到準 備好的基質(zhì)上，澆淋透水，精心管理，40d后即可移栽。
具體實施例方式
1. 種子的采集
將在野外采集鵝毛玉鳳花成熟種子的蒴果，帶回實驗室后，用75%的酒精棉球表面消 毒處理后置4'C的冰箱保存。
2. 種子的無菌播種及原球莖的誘導
(1) 外植體的消毒處理
將采集保存的野生鵝毛玉鳳花未開裂蒴果，先用75%的酒精消毒處理20-30 s，再用0.1% 的升汞消毒滅菌15min左右，然后用無菌水沖洗5-6次，用滅菌過的濾紙吸干表面水分待用。
(2) 種子的無菌播種和培養(yǎng)
用無菌的解剖刀將消毒處理好的蒴果縱向切開，將其內(nèi)部的細小種子均勻地撒播于在 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+3。/。蔗糖+0.2。/?；钚蕴康墓腆w培養(yǎng)基上，pH 5.8-6.0。置于光照強度為 1 500-2 000 Lx,光照時間12h/d，溫度為(25土2)'C的條件下培養(yǎng)。
(3) 原球莖的獲得
種子培養(yǎng)10d后，發(fā)育良好的種子開始膨大，形成白色的原球莖，后逐漸長大，表面出 現(xiàn)白色的細絨毛。種子的萌發(fā)是不同步的，種子萌發(fā)形成的原球莖需要分步轉(zhuǎn)接進行增殖。
3. 原球莖的增殖、分化
將誘導所得的白色原球莖轉(zhuǎn)接到1/2MS + NAA 0.2 mg/L + ZT 5.0 mg/L + 3%蔗糖+ 0.2% 活性炭的固體培養(yǎng)基上，pH5.8-6.0，培養(yǎng)約20d，白色小原球莖開始分化出葉原基，后長出 第一片真葉，形成小苗；培養(yǎng)30d左右，在小苗基部增殖新生成叢生形原球莖，后產(chǎn)生分化， 最后分化出叢生苗，達3-6株。培養(yǎng)條件為光照強度1 500-2 000 Lx，光照時間12h/d,溫度 (25士2)。C。
4. 試管苗的增殖生根
在無菌條件下，將叢生的小苗分成單株轉(zhuǎn)接在固體培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1mg/L + 6-BA 3.0mg/L + 3。/。蔗糖+0.2%活性炭上，pH5.5-5.8，單株苗繼續(xù)增殖成叢生苗，增殖倍數(shù)達3-5 倍；同時發(fā)生根的同步生長，每株苗長有2-3條新根。培養(yǎng)條件為光照強度l 500-2 OOOLx， 光照時間12 h/d，溫度(25士2)。C。
5.組培苗的煉苗移栽
將生長有2-3片葉和新根的小苗的培養(yǎng)瓶置室溫條件煉苗2-3 d，然后揭開封口膜煉苗2 d，后用清水沖洗干凈苗基部的培養(yǎng)基，栽種(2-3株苗種1窩)到準備好的基質(zhì)蛭石+腐殖土(2:l) 上，澆淋透水，保濕1星期，后按常規(guī)管理(噴藥和營養(yǎng)液)，成活率達80%左右。40d后即 可以移栽。
權(quán)利要求
1.利用鵝毛玉鳳花成熟種子作為外植體，經(jīng)消毒處理后，播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，誘導萌發(fā)形成原球莖，再進行原球莖增殖、分化及試管苗的增殖。鵝毛玉鳳花組織培養(yǎng)繁殖的方法主要包括以下步驟(1)原球莖的誘導(2)原球莖的增殖、分化(3)苗的增殖生根(4)組培苗的煉苗移栽
2. 按照權(quán)利要求1所述鵝毛玉鳳花組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(l):在超凈工作臺上， 將野生鵝毛玉鳳花未開裂蒴果用75%的酒精消毒處理20-30 s,再用0.1%的升汞消毒滅菌15 min左右，然后用無菌水沖洗5-6次，用滅菌過的濾紙吸干表面水分；用無菌的解剖刀縱向切 開果皮，將其內(nèi)部的細小種子均勻地撒播于在1/2MS+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+3。/。蔗糖+0.2。/。 活性炭的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基pH5.8-6.0，置于光照強度為1 500-2 000 Lx，光照時間12h/d， 溫度為(25士2)'C的條件下培養(yǎng)。種子培養(yǎng)10d后，發(fā)育良好的種子開始膨大，形成白色的原 球莖，后逐漸長大，表面出現(xiàn)白色的細絨毛。
3. 按照權(quán)利要求1所述鵝毛玉鳳花組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2):將誘導所得的白色 原球莖轉(zhuǎn)接到1/2MS+NAA 0.2 mg/L +2丁(玉米素)5.0 mg/L+3。/。蔗糖+0.2。/。活性炭固體培養(yǎng)基 上，pH5.8-6.0。培養(yǎng)約20d,白色小原球莖分化出葉原基，后長出第一片真葉，形成小苗； 培養(yǎng)30d左右，在小苗基部增殖新生成叢生形原球莖，后產(chǎn)生分化，最后分化出叢生苗，達 3-6株。培養(yǎng)條件為光照強度1 500-2 000 Lx，光照時間12 h/d，溫度(25士2)'C 。
4. 按照權(quán)利要求1所述鵝毛玉鳳花組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3):在無菌條件下，將 叢生的小苗分成單株轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基1/2MS +NAA O.lmg/L +6-8八(6-芐基氨基嘌呤)3.0 01§/1>3%蔗糖+0.2%活性炭上，單株苗繼續(xù)增殖成叢生苗，增殖倍數(shù)達3-5倍；同時發(fā)生根的 同步生長，每株苗長有2-3條新根。培養(yǎng)條件同上。
5. 按照權(quán)利要求1所述鵝毛玉鳳花組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(4):將生長有2-3片葉 和新根的小苗的培養(yǎng)瓶置室溫條件煉苗2-3 d，然后揭開封口膜煉苗2d,后用清水沖洗干凈 苗基部的培養(yǎng)基，栽種(2-3株苗種1窩)到準備好的基質(zhì)蛭石+腐殖土(2:l)上，澆淋透水，保 濕l星期，后按常規(guī)管理，成活率達80%左右。
全文摘要
本發(fā)明是利用野生鵝毛玉鳳花種子進行無菌播種，通過種子萌發(fā)誘導形成原球莖，然后進行原球莖增殖、分化，最后進行試管苗的增殖。利用非共生萌發(fā)的方式成功地將鵝毛玉鳳花種子無菌萌發(fā)，得出一套鵝毛玉鳳花的組織培養(yǎng)繁殖方法，填補了國內(nèi)外這方面的空白。這對保護鵝毛玉鳳花野生資源，促進鵝毛玉鳳花可持續(xù)發(fā)展和利用及產(chǎn)業(yè)化具有積極作用和現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N5/04GK101099451SQ200710077879
公開日2008年1月9日 申請日期2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日
發(fā)明者劉作易, 毛堂芬, 陳婭婭 申請人:貴州省生物技術(shù)研究所