專利名稱：編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因及其用途，特別是涉及麥芽糖發(fā)酵性優(yōu)異的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子MalRp的基因MALR，特別是通過提高啤酒酵母中特征性的nonScMALR基因的表達(dá)量而提高使麥芽糖發(fā)酵的能力的酵母及使用該酵母的酒精飲料制造方法等。
背景技術(shù)：
啤酒制造中，使浸出物濃度為11％左右的原麥芽汁發(fā)酵，得到酒精濃度為4.5～5％左右的啤酒，為提高啤酒的生產(chǎn)性，有時采用高濃度釀造法。高濃度釀造法(high gravity brewing)是指使浸出物濃度比通常麥芽汁高的麥芽汁發(fā)酵后，用水稀釋，制造所需酒精濃度的啤酒的方法。其具體的方式為(1)采用比通常的發(fā)酵溫度高的溫度，(2)增加向麥芽汁的通氣量，(3)增加酵母的添加量以及這些方式的組合。在制造通常的啤酒時，這些方法中原麥芽汁浸出物濃度為15％左右的高濃度釀造可以說是達(dá)到了的極限。
進(jìn)行原麥芽汁浸出物濃度15％以上的高濃度釀造時，所產(chǎn)生的問題中最大的問題首先是從發(fā)酵中期到后期，發(fā)酵速度顯著降低。麥芽汁中所含有的糖質(zhì)主要是麥芽糖、麥芽三糖、葡萄糖、果糖、蔗糖。酵母先發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖，之后發(fā)酵麥芽糖、麥芽三糖。因此，從發(fā)酵中期到發(fā)酵后期，醪液中的可發(fā)酵性糖只有麥芽糖、麥芽三糖。且其存在比為3∶1，麥芽糖占絕對多數(shù)。
麥芽糖通過酵母的麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝入細(xì)胞內(nèi)后，通過麥芽糖酶水解成2個葡萄糖，再經(jīng)過糖酵解(Embden-Meyerhof)途徑轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇。該2種酶在基因的轉(zhuǎn)錄水平、在麥芽糖的存在下被誘導(dǎo)，在葡萄糖的存在下被抑制。已知在麥芽糖的存在下這些酶的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子MalR有關(guān)，并已知MalR的轉(zhuǎn)錄自身也在葡萄糖的存在下受到抑制(Mol Cell Biol.72477-2483，1987、Curr Genet.28258-266，1995)。
麥芽汁中，因葡萄糖約占可發(fā)酵性糖的17％，酵母的麥芽糖代謝體系基因在發(fā)酵初期階段受葡萄糖抑制，麥芽糖的發(fā)酵大幅度延遲。此現(xiàn)象在高濃度釀造時更為顯著，不僅麥芽糖發(fā)酵延遲，發(fā)酵結(jié)束時作為殘?zhí)堑拇罅康柠溠刻且参幢话l(fā)酵而殘留下來。由于這些問題，高濃度釀造，例如使通常濃度的2倍濃度的麥芽汁發(fā)酵，以往的技術(shù)是不充分的。
日本特開平1-153082號公報中公開了為了改善通過面包酵母而使生面團(tuán)(dough)發(fā)酵，使用導(dǎo)入含有不受葡萄糖抑制的乙醇脫氫酶基因的啟動子和麥芽糖酶基因及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的質(zhì)粒的面包酵母。另外，也有文獻(xiàn)報道，使Saccharomyces cerevisiae的麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MAL6T在釀造用酵母中高表達(dá)，從而實現(xiàn)高濃度釀造的例子(日本特開平06-245750號公報)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述現(xiàn)狀，希望有既不影響發(fā)酵速度和產(chǎn)品質(zhì)量，又可實現(xiàn)高濃度釀造的酵母。
本發(fā)明人等為解決上述課題不斷銳意研究的結(jié)果，從啤酒酵母中成功地鑒定、分離了編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因。且制備了將所得基因?qū)虢湍覆⑹蛊浔磉_(dá)的轉(zhuǎn)化酵母，確認(rèn)了可促進(jìn)麥芽糖發(fā)酵，從而完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明涉及編碼啤酒酵母中存在的麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)了該基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化酵母、通過使用調(diào)節(jié)了該基因表達(dá)的酵母的酒精飲料的制造方法等。具體地說，本發(fā)明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法等。
(1)多核苷酸，其選自由下述(a)～(f)所組成的群組(a)多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d)多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(e)多核苷酸，其含有與序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其選自由下述(g)～(i)所組成的群組(g)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸的氨基酸序列組成且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(h)多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(i)多核苷酸，其含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸或序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)蛋白質(zhì)，其由上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸編碼。
(7)載體，其含有上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)中所述的載體，其包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括下述構(gòu)成要素(x)～(z)(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸，其連接在該啟動子的有義或反義方向；以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷化并在酵母中起作用的信號。
(7b)上述(7)中所述的載體，其包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括下述構(gòu)成要素(x)～(z)(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸，其連接在該啟動子的有義方向；以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷化并在酵母中起作用的信號。
(8)酵母，其中導(dǎo)入了上述(7)～(7b)中任一項所述的載體。
(9)上述(8)中所述的酵母，其通過導(dǎo)入上述(7)～(7b)中任一項所述的載體，提高了使麥芽糖發(fā)酵的能力。
(10)上述(9)中所述的酵母，其通過使上述(6)中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加，提高了使麥芽糖發(fā)酵的能力。
(11)酒精飲料的制造方法，其使用上述(8)～(10)中任一項所述的酵母。
(12)上述(11)中所述的酒精飲料的制造方法，其釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
(13)酒精飲料，其由上述(11)或(12)中所述的方法制造。
(14)評價被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力的方法，其使用根據(jù)具有序列號1的堿基序列且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的堿基序列設(shè)計的引物或探針，對被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力進(jìn)行評價。
(14a)根據(jù)上述(14)中所述的方法，篩選麥芽糖發(fā)酵能力強(qiáng)的酵母的方法。
(14b)酒精飲料使用根據(jù)上述(14a)中所述的方法篩選的酵母制造酒精飲料(例如啤酒)的方法。
(15)評價被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力的方法，其通過培養(yǎng)被檢酵母、測定具有序列號1的堿基序列且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量，對被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力進(jìn)行評價。
(15a)篩選麥芽糖發(fā)酵能力強(qiáng)的酵母的方法，其根據(jù)上述(15)中所述方法，評價被檢酵母，篩選編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量高的酵母。
(15b)酒精飲料使用根據(jù)上述(15a)中所述方法篩選的酵母制造酒精飲料(例如啤酒)的方法。
(16)酵母的選擇方法，其通過培養(yǎng)被檢酵母，對上述(6)中所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量或測定具有序列號1的堿基序列且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量，選擇與目標(biāo)麥芽糖發(fā)酵能力相應(yīng)的上述蛋白質(zhì)的生成量或上述基因的表達(dá)量的被檢酵母。
(17)上述(16)中所述的酵母的選擇方法，其通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比在標(biāo)準(zhǔn)酵母中高表達(dá)的被檢酵母。
(18)上述(16)中所述的酵母的選擇方法，其通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，對各酵母中上述(6)所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，選擇該蛋白質(zhì)的量比在標(biāo)準(zhǔn)酵母中多的被檢酵母。
(19)酒精飲料的制造方法，其特征在于，使用上述(8)～(10)中所述的酵母及通過上述(16)～(18)中所述方法選擇的酵母中的任一種酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵，調(diào)節(jié)發(fā)酵速度。
根據(jù)使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料的制造方法，即使葡萄糖存在麥芽糖的發(fā)酵也不受抑制，此結(jié)果，因不等葡萄糖消失麥芽糖也會進(jìn)行降解發(fā)酵，發(fā)酵速度提高，所以可通過高濃度麥芽汁釀造啤酒。


圖1是表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量經(jīng)時變化的圖形。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示OD660值。
圖2是表示啤酒釀造試驗中浸出物消耗量經(jīng)時變化的圖形。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖3是表示啤酒釀造試驗中酵母的nonScMALR基因的表達(dá)行為的圖形。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示檢測出的信號強(qiáng)度。
具體實施例方式
本發(fā)明人認(rèn)為通過增大酵母的麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性，可使麥芽糖更高效地發(fā)酵?；诖嗽O(shè)想不斷研究的結(jié)果，以用日本特開2004-283169中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎(chǔ)，分離、鑒定了啤酒酵母中特有的編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的non-ScMALR基因。該堿基序列示于序列號1。由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號2。
1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；以及(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作為本發(fā)明對象的多核苷酸，不只限于上述的來自啤酒酵母的編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的多核苷酸，還包含編碼與此蛋白質(zhì)具同等功能的蛋白質(zhì)的其他的多核苷酸。作為功能相同的蛋白質(zhì)，例如，可舉例為(c)具有由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可為由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加例如1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個(1～數(shù)個)、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個氨基酸殘基的氨基酸序列組成且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)。上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/或付加的數(shù)量，一般優(yōu)選較小的數(shù)量。另外，此種蛋白質(zhì)可舉例為(d)具有與序列號2的氨基酸序列有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的氨基酸序列且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)。上述同一性的數(shù)值一般越大越好。
麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性，可根據(jù)對這些基因的轉(zhuǎn)錄量(mRNA)進(jìn)行定量來測定。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR進(jìn)行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons 1994-2003)。
另外，本發(fā)明也包含(e)多核苷酸，其含有與序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
此處的“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸”，是指以序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸或編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。雜交方法，例如可利用MolecularCloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1987-1997等中所述的方法。
本說明書中所述的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”可為低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中嚴(yán)謹(jǐn)條件、高嚴(yán)謹(jǐn)條件中的任一種?！暗蛧?yán)謹(jǐn)條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件?！爸袊?yán)謹(jǐn)條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件?！案邍?yán)謹(jǐn)條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴(yán)謹(jǐn)性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強(qiáng)度、時間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適宜選擇這些因素，可實現(xiàn)同樣的嚴(yán)謹(jǐn)條件。
另外，在雜交中使用市售的試劑盒時，例如，可使用Alkphos DirectLabelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據(jù)試劑盒中附帶的說明書，與標(biāo)記探針進(jìn)行過夜培養(yǎng)后，將膜在55℃的條件下，用含有0.1％(w/v)SDS的1次洗滌緩沖液洗滌后，可檢測出雜交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外可雜交的多核苷酸，通過FASTA、BLAST等同源性檢索軟件，使用默認(rèn)參數(shù)(default parameter)計算時，可為與編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。
另外，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)來決定。已開發(fā)了基于BLAST算法的稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，參數(shù)例如為score＝100、word length＝12。另外，使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score＝50、word length＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明也提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任一個編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)，是由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可舉例為由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述數(shù)量的氨基酸殘基的氨基酸序列組成且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)。此外，此種蛋白質(zhì)，可舉例為具有與序列號2的氨基酸序列具有如上所述的同源性的氨基酸序列，且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可使用《分子克隆》第3版(モレキュラ一クロ一ニング第3版)、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定點(diǎn)誘變法獲得。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個以上的氨基酸殘基，是指在同一序列中任意的且1個或多個氨基酸序列的位置上，缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸殘基，其中，缺失、取代、插入及添加中的2種以上也可同時發(fā)生。
以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C組天冬酰胺、谷酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過Fmoc法[芴甲氧羰基法(fluorenylmethoxycarbonyl)]、tBoc法[叔丁氧羰基法(t-Butyl Oxy Carbonyl)]等的化學(xué)合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司、珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instruments公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、島津制作所(島津製作所社)等制造的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)。本發(fā)明的載體通常如下構(gòu)成，其含有包括以(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子、(y)連接在該啟動子的有義或反義方向的上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)、以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷化的在酵母中起作用的信號作為構(gòu)成因子的表達(dá)盒。
導(dǎo)入酵母時使用的載體，可利用多復(fù)制型(YEp型)、單復(fù)制型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，YEp型載體的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型載體的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型載體的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已為人所知，且易獲得。
用于調(diào)節(jié)酵母中基因表達(dá)的啟動子/終止子，只要能在釀造用酵母中起作用，同時又不受醪液中糖和氨基酸等成分濃度的影響，則可任意組合。例如可利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因已被克隆，例如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中已有詳細(xì)記載，可通過已知方法很容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，所以，轉(zhuǎn)化時使用的選擇性標(biāo)記可利用氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因G418r、銅抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、淺藍(lán)菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分別選自，豬腰淳嗣等，生化學(xué)，64，660，1992；Hussain etal.，gene，101，149，1991)(それぞれ豬腰淳嗣ら，生化學(xué)，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。宿主酵母為可用于釀造的任意的酵母，例如可為啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可舉例為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。還可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如協(xié)會葡萄酒用1號、3號、4號等；清酒酵母，例如協(xié)會酵母清酒用7號、9號等，但并不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母，例如可優(yōu)選使用巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。
酵母的轉(zhuǎn)化方法，可利用通常使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質(zhì)球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實施，但不限于此。
更具體地說，將宿主酵母置于標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基[例如YEPD培養(yǎng)基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等]中培養(yǎng)，使OD600nm值為1～6。將此培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1～2M的堿金屬離子、優(yōu)選鋰離子進(jìn)行預(yù)處理。將此細(xì)胞在約30℃條件下靜置約60分鐘后，與導(dǎo)入的DNA(約1～20μg)同時在約30℃條件下靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4,000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。在約30℃、靜置約30分鐘后，將此細(xì)胞在約42℃條件、加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將此細(xì)胞懸浮液用標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放入規(guī)定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，約30℃、靜置約60分鐘。之后，移植到含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素等的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化體。其他有關(guān)一般性的克隆技術(shù)可參照[《分子克隆》第3版(モレキュラ一クロ一ニング第3版)]、“Methods in Yeast Genetics、A laboratorymanual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發(fā)明的酒精飲料制造方法及根據(jù)該制造方法獲得的酒精飲料將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造所需制造酒精飲料的酵母中，并可通過使用該酵母、使用高濃度麥芽汁在短時間內(nèi)制造酒精飲料。而且通過根據(jù)下述本發(fā)明的酵母的評價方法進(jìn)行的選擇，也可獲得使麥芽糖發(fā)酵能力提高的酵母。作為制造對象的酒精飲料并不限于此，例如可舉例為啤酒、發(fā)泡酒等的啤酒味飲料。
制造這些酒精飲料時，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母代替親株以外，可利用公知的方法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往完全相同，不會因制造縮短了發(fā)酵時間的酒精飲料而增加成本。即根據(jù)本發(fā)明，可在使用已有設(shè)備、不增加成本的情況下，制造麥芽糖發(fā)酵能力等優(yōu)異的酒精飲料。
5.本發(fā)明的酵母的評價方法本發(fā)明涉及使用根據(jù)具有序列號1的堿基序列、且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的堿基序列設(shè)計的引物或探針，對被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力進(jìn)行評價的方法。使用引物或探針的評價方法的一般方法為公知的方法，例如，如WO 01/040514號公報、日本特開平8-205900號公報等中的記載。以下，對該評價方法進(jìn)行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因組為對象，使用根據(jù)編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計的引物或探針，測定被檢酵母的基因組中是否存在該基因或該基因的特異性序列。引物或探針的設(shè)計可使用公知的方法進(jìn)行。
基因或特異性序列的檢測可使用公知的方法進(jìn)行。例如，將含有特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸作為一個引物，將含有該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有與該堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸作為另一個引物，通過PCR法擴(kuò)增酵母的核酸，并測定擴(kuò)增物的有無、擴(kuò)增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數(shù)通常為10bp以上，優(yōu)選為15～25bp。且夾在兩引物間的堿基數(shù)，通常為300～2000bp較適當(dāng)。
PCR法的反應(yīng)條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90～95℃、退火溫度40～60℃、延伸溫度60～75℃、循環(huán)數(shù)10次以上等的條件。所得到的反應(yīng)生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，可測定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。根據(jù)此方法，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量是否是包含特異部分的DNA分子的大小，來預(yù)測、評價其酵母的麥芽糖發(fā)酵能力。另外，可通過分析擴(kuò)增物的堿基序列，更進(jìn)一步正確地預(yù)測、評價上述性能。
本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量，評價被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力。另外，編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量的測定，可通過培養(yǎng)被檢酵母，對編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行定量來進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR法，蛋白質(zhì)的定量例如可通過Western印跡法進(jìn)行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons 1994-2003)。而且，也可通過測定培養(yǎng)被檢酵母時所得到的發(fā)酵液中的麥芽糖濃度，預(yù)測該被檢酵母中的上述基因的表達(dá)量。
而且，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量，選擇與目標(biāo)麥芽糖發(fā)酵能力相應(yīng)的上述基因表達(dá)量的酵母，來選擇適合釀造所需酒精飲料的酵母。另外，也可培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定各酵母中上述基因的表達(dá)量，比較標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母的上述基因的表達(dá)量，來選擇所需的酵母。具體地說，例如可通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比在標(biāo)準(zhǔn)酵母中高表達(dá)的菌株，來選擇適合釀造所需酒精飲料的酵母。
或者可通過培養(yǎng)被檢酵母，選擇麥芽糖發(fā)酵能力強(qiáng)的酵母，來選擇適合釀造所需酒精飲料的被檢酵母。
此時，被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，例如可使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明載體的酵母、實施了突變處理的酵母、自發(fā)突變的酵母等。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等藥劑處理的化學(xué)方法等的任何方法進(jìn)行(例如，參照大嵨泰治編著，生物化學(xué)實驗法39，酵母分子遺傳學(xué)實驗法，p67-75，學(xué)會出版中心等)(大嵨泰治編著、生物化學(xué)実験法39 酵母分子遺伝學(xué)実験法、p67-75、學(xué)會出版センタ一など)。
另外，可作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可舉例為釀造時可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可舉例為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母[例如，巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)、Saccharomyces cerevisiae、及Saccharomyces carlsbergensis)，本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且還可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如協(xié)會葡萄酒用1號、3號、4號等；清酒酵母，例如協(xié)會酵母清酒用7號、9號等，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母，例如可優(yōu)選使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母可從上述酵母群中以任意組合選擇。
以下，通過實施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實施例。
實施例1編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因(nonScMALR)的克隆使用日本特開2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中特有的編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因nonScMALR(序列號1)。以所得到的堿基序列信息為基礎(chǔ)，分別設(shè)計用于擴(kuò)增全長基因的引物nonScMALR_F(序列號3)/nonScMALR_R(序列號4)，以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan34/70株(有時可簡寫為“W34/70株”)的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有nonScMALR全長基因的DNA片段。
將如上所述獲得的nonScMALR基因片段通過TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(invitrogen公司制造)。將nonScMALR基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。
實施例2啤酒釀造試驗中的nonScMALR基因表達(dá)的分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒釀造試驗，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA通過啤酒酵母DNA微陣列進(jìn)行檢測。
麥芽汁浸出物濃度12.69％麥芽汁容量 70L麥芽汁溶解氧濃度8.6ppm發(fā)酵溫度15℃酵母投入量 12.8×106cells/mL對發(fā)酵液經(jīng)時取樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經(jīng)時變化。與此同時對酵母菌體取樣，對制備后的mRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，使其與日本特開2004-283169中所述的啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號檢測使用基因芯片操作系統(tǒng)(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0AFFYMETRIX公司制)進(jìn)行。nonScMALR基因的表達(dá)模式如圖3所示。由此結(jié)果可確認(rèn)，nonScMALR基因在通常的啤酒發(fā)酵中進(jìn)行了表達(dá)。
實施例3nonScMALR高表達(dá)株的制備將實施例1中所述的nonScMALR/pCR2.1-TOPO用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI進(jìn)行酶切，制備包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)域全長的DNA片段。使此片段與用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot連接，構(gòu)建了nonScMALR高表達(dá)載體nonScMALR/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子高表達(dá)。酵母中的選擇性標(biāo)記包含氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大腸桿菌中的選擇性標(biāo)記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的高表達(dá)載體，用日本特開平07-303475中所述的方法轉(zhuǎn)化Saccharomyces pastorianus UPMT3株。UPMT3株是將日本特開平06-245750號公報中所述的麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MAL6T用日本特開2000-316559號公報中所述的YIp型高表達(dá)質(zhì)粒pUP3GLP導(dǎo)入到Saccharomyces pastorianus BH84株的染色體的菌株。用含有氨基糖苷類抗生素300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實施例4使用高濃度麥芽汁的啤酒釀造試驗使用親株及用實施例3獲得的nonScMALR高表達(dá)株用以下條件進(jìn)行發(fā)酵試驗。
麥芽汁浸出物濃度 16.9％(12％麥芽汁中添加5％葡萄糖)麥芽汁容量 20ml發(fā)酵溫度 28℃一定調(diào)整酵母投入量，使發(fā)酵開始時的OD660為1.1。
將從發(fā)酵開始44.5小時后的醪液的浸出物濃度及醪液的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的濃度用液相色譜法測定。
如表1所示，與親株相比，nonScMALR高表達(dá)株在44.5小時后的浸出物濃度比親株低，發(fā)酵度增加4.2％。
且發(fā)酵結(jié)束時醪液的糖分析的結(jié)果，如表2所示，nonScMALR高表達(dá)株與親株相比，麥芽糖、麥芽三糖的發(fā)酵被促進(jìn)了。
表1

表2

工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明的酒精飲料制造方法，因酵母的麥芽糖發(fā)酵能力增大，所以即使在高濃度釀造中也能提高發(fā)酵速度，可在短時間內(nèi)制造酒精飲料。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子基因及其用途(Gene encoding maltase and a maltose transporter transcription factor，and use thereof)<130>G06-0105CN<150>JP2006-055542<151>2006-03-01<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1434<212>DNA<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>1atgagtttcg ttaagcaagc atgcgactgt tgtcgcgttc gccgaataaa gtgtgacggt 60aaaggaccgt gtagtcgctg ccttcagcat gatttgaagt gtacatacct taaacagtta120aagaaaagag gtccaaagtc catcagggct cgaagcttga aaaaaatagc cgatgtacag180aaagctagta atggtggcac tacgatagct actgcggaag aatccacgaa ggttccaaag240aggctaatcg accaatgcct aaggctttac cacaataatc tgtacgttat atggcctctg300
ctctgttacg aagatcttca caggcttctg gaagaaaggt atgatgactg ttatgtgtac360tggtttctgg tagctctctc ggcagccact cttagtgact tgcaaactga aatagaatct420aaggagggag cttccttgac tggaaaacag ctatgtgacc tttgtatgtc attacaccac480cgttttgatg acctcagggg tagcgatgtt tttagaataa tgacgtatta ttatttgcat540cgttgttttg ctcaatcttc tgatacaaga acttcgtaca gactctcttg tgaagccatt600agcctcatca agatcgccgg atttcatcgc gaggaaacgt atgagcgtat ctcgttcaat660gagcagcagc ttagacggaa ggtgtattat ttgcttcttt tgactgaaag atattattcc720gtgtatattt actgcgcaac aagcctggat gccacgatat caccaccgca acctgaagtt780gtaactgacc ctcgactttc cttggatagt ttcctcgaga tgatcagagt atttactgta840gcaggaaaat gtttttttga ttcattagct gccaactccg taaacgtttc ttgtactgaa900gactccctca aaaaaatatg gagggaactt catacaacgt cacttgaaat agagccatgg960tcgtacggat acatagacat ttcattttcc cggcattgga tcagaacact ggcttggaag 1020ctagcgcctc taacaaaagg tatacgaacc ggtttccttt caaacactaa taatgcgctc 1080ataccagtca aaattgccaa agacatgttg gttgatacat ttttaacccc aaaaagcttc 1140tatgaagttc acggccccgg aataccaaca aaggcgctag aagtagcgaa tgcgttggta 1200gacgttgtta tgaatcagtt agaccagaat atgaaattgg aggctttgaa cgttttgcac 1260gatatatcca aatttgtttt ttctttagaa cactgtgata gtcggctgat caagatattt 1320accgctaaat gtcaaactgc ccttatttct atacctattt ctagaccact agaattaagc 1380gatgattctg aagaagacac taataaaatt cttgaagaac atactgataa gtga 1434<210>2<211>477<212>PRT<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>2Met Ser Phe Val Lys Gln Ala Cys Asp Cys Cys Arg Val Arg Arg Ile
1 5 10 15Lys Cys Asp Gly Lys Gly Pro Cys Ser Arg Cys Leu Gln His Asp Leu20 25 30Lys Cys Thr Tyr Leu Lys Gln Leu Lys Lys Arg Gly Pro Lys Ser Ile35 40 45Arg Ala Arg Ser Leu Lys Lys Ile Ala Asp Val Gln Lys Ala Ser Asn50 55 60Gly Gly Thr Thr Ile Ala Thr Ala Glu Glu Ser Thr Lys Val Pro Lys65 70 75 80Arg Leu Ile Asp Gln Cys Leu Arg Leu Tyr His Asn Asn Leu Tyr Val85 90 95Ile Trp Pro Leu Leu Cys Tyr Glu Asp Leu His Arg Leu Leu Glu Glu100 105 110Arg Tyr Asp Asp Cys Tyr Val Tyr Trp Phe Leu Val Ala Leu Ser Ala115 120 125Ala Thr Leu Ser Asp Leu Gln Thr Glu Ile Glu Ser Lys Glu Gly Ala130 135 140Ser Leu Thr Gly Lys Gln Leu Cys Asp Leu Cys Met Ser Leu His His
145 150 155 160Arg Phe Asp Asp Leu Arg Gly Ser Asp Val Phe Arg Ile Met Thr Tyr165 170 175Tyr Tyr Leu His Arg Cys Phe Ala Gln Ser Ser Asp Thr Arg Thr Ser180 185 190Tyr Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ile Ser Leu Ile Lys Ile Ala Gly Phe195 200 205His Arg Glu Glu Thr Tyr Glu Arg Ile Ser Phe Asn Glu Gln Gln Leu210 215 220Arg Arg Lys Val Tyr Tyr Leu Leu Leu Leu Thr Glu Arg Tyr Tyr Ser225 230 235 240Val Tyr Ile Tyr Cys Ala Thr Ser Leu Asp Ala Thr Ile Ser Pro Pro245 250 255Gln Pro Glu Val Val Thr Asp Pro Arg Leu Ser Leu Asp Ser Phe Leu260 265 270Glu Met Ile Arg Val Phe Thr Val Ala Gly Lys Cys Phe Phe Asp Ser275 280 285Leu Ala Ala Asn Ser Val Asn Val Ser Cys Thr Glu Asp Ser Leu Lys
290 295 300Lys Ile Trp Arg Glu Leu His Thr Thr Ser Leu Glu Ile Glu Pro Trp305 310 315 320Ser Tyr Gly Tyr Ile Asp Ile Ser Phe Ser Arg His Trp Ile Arg Thr325 330 335Leu Ala Trp Lys Leu Ala Pro Leu Thr Lys Gly Ile Arg Thr Gly Phe340 345 350Leu Ser Asn Thr Asn Asn Ala Leu Ile Pro Val Lys Ile Ala Lys Asp355 360 365Met Leu Val Asp Thr Phe Leu Thr Pro Lys Ser Phe Tyr Glu Val His370 375 380Gly Pro Gly Ile Pro Thr Lys Ala Leu Glu Val Ala Asn Ala Leu Val385 390 395 400Asp Val Val Met Asn Gln Leu Asp Gln Asn Met Lys Leu Glu Ala Leu405 410 415Asn Val Leu His Asp Ile Ser Lys Phe Val Phe Ser Leu Glu His Cys420 425 430Asp Ser Arg Leu Ile Lys Ile Phe Thr Ala Lys Cys Gln Thr Ala Leu
435 440 445Ile Ser Ile Pro Ile Ser Arg Pro Leu Glu Leu Ser Asp Asp Ser Glu450 455 460Glu Asp Thr Asn Lys Ile Leu Glu Glu His Thr Asp Lys465 470 475<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>3gagctcatag cggccatgag tttcgttaag caagcatgcg 40<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)
<400>4ggatcctatg cggccgcagc aaccaaaaag cttaaaaaac tt 4權(quán)利要求
1. 多核苷酸，其選自由下述(a)～(f)所組成的群組(a)多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的、且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d)多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列、且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(e)多核苷酸，其含有與序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其選自由下述(g)～(i)所組成的群組(g)多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10個氨基酸的氨基酸序列組成的、且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(h)多核苷酸，其含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(i)多核苷酸，其含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
6.蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1～5中任一項所述的多核苷酸編碼。
7.載體，其含有權(quán)利要求1～5中任一項所述的多核苷酸。
8.酵母，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求7中所述的載體。
9.如權(quán)利要求8中所述的酵母，其通過導(dǎo)入權(quán)利要求7中所述的載體，提高了使麥芽糖發(fā)酵的能力。
10.如權(quán)利要求9中所述的酵母，其通過使權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加，提高了使麥芽糖發(fā)酵的能力。
11.酒精飲料的制造方法，其使用權(quán)利要求8～10中任一項所述的酵母。
12.如權(quán)利要求11中所述的酒精飲料的制造方法，其釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
13.酒精飲料，其由權(quán)利要求11或12中所述的方法制造。
14.評價被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力的方法，其使用根據(jù)具有序列號1的堿基序列、且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的堿基序列設(shè)計的引物或探針，對被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力進(jìn)行評價。
15.評價被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力的方法，其通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列、且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量，對被檢酵母的麥芽糖發(fā)酵能力進(jìn)行評價。
16.酵母的選擇方法，其通過培養(yǎng)被檢酵母，對權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量或測定具有序列號1的堿基序列、且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因的表達(dá)量，選擇與目標(biāo)麥芽糖發(fā)酵能力相應(yīng)的上述蛋白質(zhì)的生成量或上述基因的表達(dá)量的被檢酵母。
17.如權(quán)利要求16中所述的酵母的選擇方法，其通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列、且編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比在標(biāo)準(zhǔn)酵母中高表達(dá)的被檢酵母。
18.如權(quán)利要求16中所述的酵母的選擇方法，其通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，對各酵母中權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，選擇該蛋白質(zhì)的量比在標(biāo)準(zhǔn)酵母中多的被檢酵母。
19.酒精飲料的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8～10中所述的酵母及通過權(quán)利要求16～18中所述方法選擇的酵母中的任一種酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵，調(diào)節(jié)發(fā)酵速度。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子的基因及其用途，特別是涉及麥芽糖發(fā)酵性優(yōu)異的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的麥芽糖酶及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子MalRp的基因MALR，特別是通過提高啤酒酵母中特征性的nonScMALR基因的表達(dá)量而提高使麥芽糖發(fā)酵的能力的酵母及使用該酵母的酒精飲料的制造方法等。
文檔編號C12Q1/04GK101045932SQ20071008580
公開日2007年10月3日 申請日期2007年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子, 下永朋子 申請人:三得利株式會社