專利名稱：利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前研究機(jī)理最清楚，應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因方法{吳霞，焦改麗等.棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化機(jī)理及研究進(jìn)展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29(1)27～30；付永彩等.農(nóng)感菌介導(dǎo)的禾本科作物遺傳轉(zhuǎn)化新進(jìn)展[J].生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999，10(3)1～5；Stanton B，Gelvin，Agrobacterium-Mediated Plant Ttansformationthe Biology behind the“Gene-Jockying”Tool[J].Microbiology and Molecular Biology reviews，2003，16-37}。由于其可借助于農(nóng)桿菌及植物的酶系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高頻率的自主轉(zhuǎn)化，因而一直是研究的熱點(diǎn)之一{Michielse CB，et al.Agrobacterium-Mediated Transformation of Aspergillus awamori in the Absence ofFull-Length VirD2，VirC2，or VirE2 Leads to Insert ion of Aberrant T-DNA Structures.JBacteriol.2004，186(7)2038-2045；K Wang，A Herrera-Estrella，and M Van Montagu.Overexpression of virD1 and virD2 genes in Agrobacterium tumefaeiens enhances T-complexformation and plant transformation.J Bacteriol，1990，172(8)4432-4440；Yumin Tao etal.Expression of plant protein phosphatase 2C interferes with nuclear import of theAgrobacterium T-complex protein VirD2[J].PNAS，2004，101(14)5164-5169；G Hansen，A Das，and M D Chilton.Constitutive expression of the virulence genes improves theefficiency of plant transformation by Agrobacterium[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(16)7603-7607；楊清，陳敏，文鋒.T-D N A轉(zhuǎn)移的寄主植物細(xì)胞因子.植物生理學(xué)通訊[J]，2004，40(4)521-526.}。其T-DNA轉(zhuǎn)移和整合過程概述如下在農(nóng)桿菌中，當(dāng)vir區(qū)基因系統(tǒng)激活后，VirD操縱子內(nèi)的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，對(duì)T-DNA進(jìn)行加工剪切。首先有拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性virD1蛋白與Ti質(zhì)粒結(jié)合，使其松馳。virD2作為一種位點(diǎn)特異性的核酸內(nèi)切酶，在T-DNA的25bp邊界序列內(nèi)，對(duì)T-DNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生T-DNA單鏈。virD2蛋白第29位的酪氨酸通過芳香環(huán)上的羥基與切開的DNA的5’端磷酸以共價(jià)鏈結(jié)合，接著以類似于細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移過程的方式將T-DNA與virD2蛋白組成的復(fù)合物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。在這個(gè)過程中，T-DNA與許多的VirE2蛋白分子(DNA單鏈結(jié)合蛋白，無結(jié)合特異性)相結(jié)合，形成T鏈復(fù)合物之后，這一復(fù)合物在VirD2和VirE2雙向核定位信號(hào)(NLS)引導(dǎo)下，以virD2蛋白為先導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入植物的細(xì)胞核。virD2蛋白具有體外連接酶活性，推測(cè)參與了T-DNA 5’端同植物基因組DNA的連接{Tinland B.et al.TheAgrobacterium tumefaciens VirD2 Protein virulence D2 protein is responsible for preciseintegration of T-DNA into the plant genome[J].EEO J.1995.143585_3595}。Shurvinton等{Shurvinton CE et al.Nucleear localization signal and the Cterminal omega sequencein the Agrobacterium tumefaciens VirD2 endonuclease are important for tumorformation[J].Proc Nat Acad Sci USA，1992，8911837-11841}發(fā)現(xiàn)，在VirD2區(qū)的羧基端附近存在一個(gè)保守區(qū)域，稱為ω區(qū)。這個(gè)區(qū)域的缺失或取代突變會(huì)使轉(zhuǎn)化植株數(shù)即穩(wěn)定遺傳的植株數(shù)減少大約兩個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，VirD2在T-DNA向植物基因組整合過程中可能起重要作用。研究表明{方進(jìn)，翟文學(xué)，王文明等.轉(zhuǎn)基因水稻T-DNA側(cè)翼序列的擴(kuò)增與分析[J].遺傳學(xué)報(bào)，2001，28(4)345-351；Hiei Y，el aL，Efficient transformation of rice(Orzu sutivu J)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the Boundaries of the T-DNA[J].The Plant Journal 1994，6(2)271-282；Mysore KS.Nam J.Gelvia SB.An Arabidopsis histore H2A mutantis deficient inAgrobacterium T-DNA integration[J].proc.Natl.Acad.Sci，2000，97948-953.}T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的T-DNA多以單拷貝的形式隨機(jī)整合到植物染色體上，其轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)錄活性相對(duì)也較高。
花粉管通道轉(zhuǎn)化法與它最大不同在于，轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞中的DNA，沒有核定位信號(hào)引導(dǎo)，不能實(shí)現(xiàn)自主整合。由于以裸露形式存在，容易被細(xì)胞內(nèi)外的核酸酶降解，這可能是該方法轉(zhuǎn)化率低，轉(zhuǎn)化效果穩(wěn)定性差，易受環(huán)境條件影響的根本原因。我們的試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在花期溫度較低的年份，棉花的轉(zhuǎn)化效率明顯提高，推測(cè)與核酸酶活性在相對(duì)較低溫度下，活性較低有關(guān)。
Hansen G等人(1996)基于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)理結(jié)合基因槍法創(chuàng)建了“農(nóng)桿槍法”(Agrolistic)，將農(nóng)桿菌中協(xié)助轉(zhuǎn)化的virD1、VirD2基因連同T-DNA上的目的基因一同用基因槍打入植物細(xì)胞中{Hansen G，Chlton M D.“Agrolistic”transformation of plant cellsintegration of T-strands generatedin planta[J].proc Natl Acad sci USA.1996，9314978-14983；劉兆明，劉宗旨，白慶武，方榮祥.Agroinfiltration在植物分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，18，(4)411-414}。表達(dá)的VirD1、VirD2能在植物細(xì)胞內(nèi)切割保守序列的DNA并將T-DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，其頻率在總的轉(zhuǎn)化事件中約占20％。該方法集中了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法中精確切割轉(zhuǎn)移和低拷貝整合等特性以及基因槍法中無宿主范圍限制的優(yōu)點(diǎn)。用玉米原生質(zhì)體直接轉(zhuǎn)化法同樣證明了上述結(jié)論，并且表明另外再加入VirE2基因，可以進(jìn)一步雙倍提高典型T-DNA整合的頻率{G Hansen，et al.T-strand integration inmaize protoplasts after codelivery of a T-DNA substrate and virulence genes[J].Proc Natl Acad Sci U SA，1997，94(21)11726-11730}。
應(yīng)用類似的方法，Ziemienowicz等人在體外構(gòu)建了一個(gè)由農(nóng)桿菌毒性蛋白VirD2、virE2和單鏈DNA組成的復(fù)合體，能夠快速有效地將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物的細(xì)胞核中{A.Ziemienowicz，.Import of DNA into mammalian nuclei by proteins originating from a plantpathogenic bacterium[J]，Proc Natl Acad Sci U S A.1999，96(7)3729-3733}。為我們將農(nóng)桿菌介導(dǎo)與花粉管通道轉(zhuǎn)化法有機(jī)結(jié)合，提供了一種很有發(fā)展前途的新思路。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和花粉管通道轉(zhuǎn)化法，是目前棉花外源基因轉(zhuǎn)化的主要方法。二者的優(yōu)缺點(diǎn)極為明顯，但互補(bǔ)性很強(qiáng)。如何將二者有機(jī)的結(jié)合起來，創(chuàng)造一種操作簡單，不受組織和細(xì)胞再生限制，轉(zhuǎn)化頻率高，遺傳穩(wěn)定性好的棉花轉(zhuǎn)基因方法，對(duì)于進(jìn)行功能基因分析和轉(zhuǎn)基因棉花育種，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法，主要利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化機(jī)理，利用農(nóng)桿菌協(xié)助轉(zhuǎn)化的毒蛋白基因，在體外同需要轉(zhuǎn)化的目的基因(綠色熒光蛋白基因)組裝或混合，經(jīng)脂質(zhì)體包裝后，采用花粉管通道技術(shù)，對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其另一目的則是利用上述的方法對(duì)植物、尤其是對(duì)棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的目的主要是通過以下過程實(shí)現(xiàn)的(1)植物增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)植物表達(dá)載體的構(gòu)建；(2)virD1、virD2和virE2基因克隆、原核表達(dá)分析；原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析將virD1、virD2和virE2基因從克隆載體上切下，將其融合到分泌型原核表達(dá)載體，大腸桿菌周質(zhì)蛋白phoA或外膜ompA蛋白信號(hào)引導(dǎo)肽核酸序列的下游，構(gòu)建成分泌型原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到L型細(xì)胞壁缺陷的大腸桿菌中，產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，進(jìn)行提取純化(備用方案采用常規(guī)的包涵體復(fù)性的方法)，用純化的蛋白加弗氏佐劑免疫新西蘭白兔，抽提血清，制備一抗并測(cè)定效價(jià)，(3)virD1、virD2和virE2基因植物瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建；植物瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的序列圖譜和酶切圖譜，在virD1、virD2和virE2基因編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物，并在引物上加上用于克隆的酶切位點(diǎn)，通過高保真PCR技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的基因擴(kuò)增，將產(chǎn)物直接構(gòu)建到帶有抗卡那霉素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體上，將帶有強(qiáng)植物啟動(dòng)子-毒蛋白基因-終止子的完整的表達(dá)框切下，構(gòu)建到高效克隆載體pUC18的多克隆位點(diǎn)上，獲得不帶左右邊界序列的植物瞬時(shí)表達(dá)載體；(4)virD1、virD2和virE2基因或蛋白與報(bào)告基因(GFP)經(jīng)脂質(zhì)體包裝，對(duì)煙草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化整合頻率研究；T-DNA蛋白復(fù)合物的體外組裝將需要轉(zhuǎn)化的帶有目的基因(本項(xiàng)目使用綠色熒光蛋白，GFP)pBin-EGFP植物表達(dá)載體，加入到植物細(xì)胞提取液中，并按順序加入提取并純化的virD1、virD2蛋白，接著加入DNA聚合酶I，通過缺口平移產(chǎn)生相應(yīng)的T-DNA單鏈，加入virE2蛋白孵育，然后用核酸酶完全消化混合物，凝膠阻滯電泳分析，與此同時(shí)酚氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀、純化DNA，最終通過特異性引物，對(duì)相應(yīng)T-DNA片段進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，評(píng)估virD1、virD2和virE2蛋白活性，研究T-DNA蛋白復(fù)合體最佳組裝方式和濃度配比；脂質(zhì)體包裝將T-DNA蛋白復(fù)合物或virD1、virD2和virE2基因(帶有完整的植物表達(dá)框架)與含有目的基因GFP質(zhì)粒載體按一定比例混合，用陽離子脂質(zhì)體(商品化)進(jìn)行包裝處理，并對(duì)煙草原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究，同時(shí)利用抗生素，對(duì)轉(zhuǎn)化煙草體細(xì)胞系進(jìn)行多代篩選，再生植株并檢測(cè)其整合效率，以此間接推斷毒蛋白在植物體內(nèi)的組裝活性，在此基礎(chǔ)上對(duì)脂質(zhì)體最佳轉(zhuǎn)化條件及緩沖液組成進(jìn)行研究；(5)在virD1、virD2和virE2基因能在植物體內(nèi)正常表達(dá)并具有活性的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的機(jī)理，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化和花粉管通道技術(shù)相結(jié)合，對(duì)棉花轉(zhuǎn)化效率及遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)；(6)改良花粉管通道技術(shù)體系的評(píng)價(jià)在(4)(5)研究的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的機(jī)理，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化和花粉管通道技術(shù)相結(jié)合，田間對(duì)特定的棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化，后代在苗期利用抗生素及長波紫外燈進(jìn)行篩選，同時(shí)進(jìn)行分子驗(yàn)證，確定其轉(zhuǎn)化頻率同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行連續(xù)多代系譜式的跟蹤調(diào)查，研究其遺傳穩(wěn)定性。
上述的過程，按每1×105～5×106個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞分別加濃度為5～25μL pUC-pBin-GFP的質(zhì)粒，濃度為5～15μL pUC-pBin-VirD1，pUC-pBin-VirD2和pUC-pBin-VirE2的協(xié)助基因進(jìn)行組裝。
上述的優(yōu)化組裝是pUC-pBin-VirD1+UC-pBin-VirD2+pUC-pBin-VirE2+pUC-pBin-GFP，pUC-pBin-GFP質(zhì)粒濃度以15～20μL最佳，協(xié)助基因的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響不大。
上述的過程脂質(zhì)體包裝時(shí)，利用農(nóng)桿菌協(xié)助轉(zhuǎn)化的毒蛋白基因，在體外同需要轉(zhuǎn)化的目的基因(綠色熒光蛋白基因)組裝或混合，以質(zhì)粒濃度[GFP]＝3～6ug/ul；[VirD1]＝3～5ug/ul；[VirD2]＝3～5ug/ul；[VirE2]＝3～5ug/ul，按1∶1∶1∶5組裝，經(jīng)脂質(zhì)體包裝后，用花粉管通道技術(shù)，對(duì)棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的效果比對(duì)照明顯提高，提高效率達(dá)4倍以上，如同時(shí)用脂質(zhì)體包裝后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率比對(duì)照提高4.5倍以上，使用含本發(fā)明中的組裝也可轉(zhuǎn)化其他植物材料。
上述花粉管通道的轉(zhuǎn)化方法在棉花種植中的應(yīng)用，選擇第二天即將開放的棉花花蕾用夾子夾住花蕾頂部，進(jìn)行自交，選擇每個(gè)果枝的第一和第二個(gè)果節(jié)位的花朵作為轉(zhuǎn)基因操作的對(duì)象，開花后18～24h左右進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前，不用剝花和分開苞葉，直接用單面刀片在花萼上部橫切，將花柱及切面上部花瓣切除，同時(shí)在子房頂部切出0.3～0.7cm直徑的切面，然后用微量注射器滴加DNA溶液，滴加的量5～10uL，DNA濃度2～5ug/uL。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將農(nóng)桿菌-脂質(zhì)體-花粉管通道技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來，利用農(nóng)桿菌協(xié)助轉(zhuǎn)化的毒蛋白基因(virD1、virD2和virE2)，在體外同需要轉(zhuǎn)化的目的基因(綠色熒光蛋白基因)按一定的比例混合，經(jīng)脂質(zhì)體包裝后，采用花粉管通道技術(shù)轉(zhuǎn)入植物，這對(duì)于提高花粉管通道的轉(zhuǎn)化效率和遺傳穩(wěn)定性是一種極有發(fā)展?jié)摿Φ母牧纪緩健Ｔ诨騐irD1、VirD2、VirE2的共同作用下，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率明顯高于其他的處理，達(dá)到了60～66％。
改進(jìn)后的轉(zhuǎn)化方法利用脂質(zhì)體易入被細(xì)胞膜攝取特性，幫助外源質(zhì)粒從胚囊進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)，然后，帶有核定位信號(hào)的毒蛋白，攜帶目的基因自主穿過核孔進(jìn)入細(xì)胞核。質(zhì)粒不僅在進(jìn)行入胚囊階段，受脂質(zhì)體保護(hù)，而且在進(jìn)入卵細(xì)胞后，能被表達(dá)的毒蛋白包被，提高了外源DNA在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的穩(wěn)定性，能夠精確的在T-DNA區(qū)加工切割，插入基因組的方式多是單拷貝，并且毒蛋白virD1具有促進(jìn)T-DNA與基因組整合，提高轉(zhuǎn)化效率的功能。


圖1是綠色熒光蛋白基因GFP的克隆及原核表達(dá)圖圖2是VirD1基因的克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建的技術(shù)路線流程圖圖3是VirD2與原核表達(dá)載體pET30a的構(gòu)建流程圖圖4是VirE2基因的克隆及原核表達(dá)流程圖圖5是virD1、virD2和virE2基因植物瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建的技術(shù)流程圖圖6是顯微鏡下GFP在原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果圖圖7是顯微鏡下GFP在原生質(zhì)體中培養(yǎng)第28天時(shí)的細(xì)胞團(tuán)表達(dá)結(jié)果圖圖8是轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的PCR檢測(cè)結(jié)果圖圖9棉花花粉管通道法導(dǎo)入時(shí)間實(shí)驗(yàn)PCR檢測(cè)結(jié)果圖圖8中1陽性對(duì)照，2、3陰性對(duì)照，4、6細(xì)胞處理的液體中沉淀的PCR結(jié)果，5、7細(xì)胞處理的液體中上清的PCR結(jié)果，8DNA Marker DL2000。
圖9中1～318小時(shí)導(dǎo)入，4～622小時(shí)導(dǎo)入，7～948小時(shí)導(dǎo)入，10陰性對(duì)照，11DNA Marker，12、1324小時(shí)導(dǎo)入，14、1536小時(shí)導(dǎo)入，16～18黃化苗陰性對(duì)照，19陽性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1植物增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)植物表達(dá)載體的構(gòu)建(參見圖1)。
實(shí)施例2virD1、virD2和virE2基因克隆1、根癌土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒毒性區(qū)VirD1基因的克隆(參見圖2)根據(jù)U.Washington發(fā)表的根癌土壤農(nóng)桿菌C58 VirD1蛋白基因全序列，自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，如下所示P1為<210>1，5’-CGGATATCATGTCGCAAGGCAGTAGG-3’Eco V(下劃線)26bp；P2為<210>2，5’-CGAAGCTTTTACAAGGCGTCTTTCAGCA-3’HindIII(下劃線)28bp，兩條引物之間跨幅459bp，加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基擴(kuò)增后的片段大小為474bp。
2、根癌土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒毒性區(qū)VirD2基因的克隆(參見圖3)根據(jù)U.Washington發(fā)表的根癌土壤農(nóng)桿菌C58 VirD2基因全序列，自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由上海生工生物公司合成，其正向引物基因序列P1為<210>3，5’-CGCCATGGATGCCCGATCGAGCTCAAG-3’；反向引物P2為<210>4，5’-CGGTCGACTGCCATCACTCGGTCCTTC-3’。
引物P1，P2的跨幅為1380bp，其中P1包含有編碼VirD1的起始密碼子ATG和Nco I(下畫線處)酶切位點(diǎn)，P2包括SalI(下畫線處)酶切位點(diǎn)。
3、根癌土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒毒性區(qū)VirE2基因的克隆(參見圖4)根據(jù)U.Washington發(fā)表的根癌土壤農(nóng)桿菌C58 VIRE2基因全序列，自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由上海生工生物公司合成，其正向引物基因序列P1為<210>5，
5’-CGAAGCTTATGGATCCGAAGGCCGA-3’；反向引物P2為<210>6，5’-CGCTCGAGTGACGCGGTATCAGGAA-3’。
引物P1，P2的跨幅為1690bp，其中P1包含有編碼VirE2的起始密碼子ATG和HindIII(下畫線處)酶切位點(diǎn)，P2包括Xho I(下畫線處)酶切位點(diǎn)。
實(shí)施例3virD1、virD2和virE2基因植物瞬時(shí)表達(dá)載體pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2以及pUC-pBin-GFP的構(gòu)建。技術(shù)路線見圖5。
實(shí)施例4煙草原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)1提取質(zhì)粒用堿裂解法小量提取pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2和pUC-pBin-GFP、pBin-GFP、pUC-pBin質(zhì)粒，用0.22μm的濾膜過濾滅菌，后于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2瞬時(shí)表達(dá)2.1設(shè)置以下幾種處理1陰性對(duì)照不加質(zhì)粒；2加載體pUC-pBin質(zhì)粒；3陽性對(duì)照加pUC-pBin-GFP質(zhì)粒；4加載體質(zhì)粒pUC-pBin和pUC-pBin-GFP質(zhì)粒；5加pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2和pUC-pBin-GFP質(zhì)粒；6加pUC-pBin-VirD2和pUC-pBin-GFP質(zhì)粒；7加pUC-pBin-VirE2和pUC-pBin-GFP質(zhì)粒；8加pUC-pBin-VirD1和pUC-pBin-GFP質(zhì)粒；2.2設(shè)置以下幾種質(zhì)粒濃度處理按上述設(shè)計(jì)加入質(zhì)粒。通常用堿裂解法提得的質(zhì)粒濃度大約為0.1mg/mL，按每105個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞分別加pUC-pBin-GFP質(zhì)粒5μL，10μL，15μL，20μL，25μL幾種不同的濃度梯度，協(xié)助基因pUC-pBin-VirD1，pUC-pBin-VirD2和pUC-pBin-VirE2以5μL，10μL，15μL幾種不同的濃度梯度，加入后輕輕混勻，使原生質(zhì)體與質(zhì)粒靜置共同于室溫下暗培養(yǎng)；從培養(yǎng)30min后開始在熒光顯微鏡下觀察。
實(shí)施例5煙草原生質(zhì)體的制備與純化(1)將愈傷組織移入無菌的培養(yǎng)皿中，并切成小塊，加入酶液A，每2g組織加10mL酶液；(2)將培養(yǎng)皿用封口膜封好，于28℃條件下緩慢振蕩7-9hr，在倒置顯微鏡下檢查，直到產(chǎn)生足夠的原生質(zhì)體；(3)將酶解后的原生質(zhì)體懸液用80目不銹鋼網(wǎng)篩(或雙層擦鏡紙)過濾，以除去未酶解完全的組織；(4)將濾液分裝在刻度離心管中，4000rpm離心5min，使原生質(zhì)體沉淀下來；(5)用移液管吸去上清，將沉淀的原生質(zhì)體懸浮在2/3體積0.2M的CaCl2中；(6)用注射器向離心管底部緩慢注入20％的蔗糖溶液0.5mL，4000rpm離心5min；(此步完成以后，在兩相溶液界面之間將出現(xiàn)一層純凈的完整原生質(zhì)體帶，雜質(zhì)和碎片將沉到管底。)(7)用注射器吸去管底的雜質(zhì)和下部的蔗糖溶液以及上部的CaCl2溶液；(此時(shí)離心管中只留下純凈的原生質(zhì)體)(8)用0.2M的CaCl2懸浮，4000rpm離心5min，吸去上清，用DPD液體培養(yǎng)基重復(fù)洗滌2-3次；(9)將收集的原生質(zhì)體懸浮在適量的DPD液體培養(yǎng)基中，分裝，每個(gè)培養(yǎng)皿2mL，原生質(zhì)體平板密度約為1×105～5×106個(gè)/mL；(10)用封口膜封口，26℃條件下暗培養(yǎng)16～20hr。
實(shí)施例6煙草原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析本實(shí)施例設(shè)計(jì)了8種處理(參見實(shí)施例42.1)，在熒光顯微鏡下(參見圖6、圖7)對(duì)發(fā)熒光的細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)每種處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選10個(gè)視野，每個(gè)視野選5個(gè)點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)點(diǎn)200個(gè)細(xì)胞中發(fā)熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后將各組數(shù)據(jù)平均得出以下結(jié)果。由于處理1和加載體pUC-pBin質(zhì)粒的處理2中在波長365nm的紫外光激發(fā)下沒有綠色熒光產(chǎn)生，而且原生質(zhì)體呈黑色，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為0，故沒有列入下表。別的處理在紫外光激發(fā)下都有不同程度的綠色熒光產(chǎn)生。以下是目的基因和協(xié)助基因在各種濃度組合下每連續(xù)200個(gè)細(xì)胞中發(fā)熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)表不同處理下轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)表

從統(tǒng)計(jì)表可以看出，在載體質(zhì)粒pUC-pBin存在的情況下GFP對(duì)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率沒有區(qū)別，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率最低，在0.3％左右，說明載體質(zhì)粒pUC-pBin在GFP轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體時(shí)不起作用。
在VirD1、VirD2、VirE2分別介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)化率與陽性對(duì)照相比有不同程度的提高，其中VirD2、VirE2分別介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化明顯高于由VirD1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，達(dá)到了7～13％左右，而VirD1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率約為3～10％。
在基因VirD1、VirD2、VirE2的共同作用下，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率明顯高于其他的處理，達(dá)到了60～66％。
實(shí)施例7轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的PCR檢測(cè)(參見圖9)將用pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2和pBin-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體在培養(yǎng)42天時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)混合液以4000rpm離心5min，棄上清，將沉淀懸浮于TE(pH＝8.0)溶液中，于高溫煮沸5min，使煙草的基因組釋放出來，再分別以上清和沉淀為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)(設(shè)兩個(gè)重復(fù))，用1.0％的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。如圖8所示，4和6為以沉淀為模板的PCR沒有目的條帶，因?yàn)槌恋砜赡苁撬劳龅募?xì)胞和組織；5和7為以上清為模板的PCR結(jié)果，與預(yù)期結(jié)果相符，說明GFP已整合到煙草基因組中。
實(shí)施例8棉花花粉管通道轉(zhuǎn)化法1.花粉管通道的轉(zhuǎn)化方法選擇第二天即將開放的花蕾用塑料衣夾夾花蕾頂部，進(jìn)行自交。選擇每個(gè)果枝的第一和第二個(gè)果節(jié)位的花朵作為轉(zhuǎn)基因操作的對(duì)象。開花后18-24h左右進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前，不用剝花，分開苞葉，直接用單面刀片在花萼上部橫切，將花柱及切面上部花瓣切除，同時(shí)在子房頂部切出0.5cm直徑的切面。然后用微量注射器滴加DNA溶液。滴加的量5～10uL，DNA濃度2～5ug/uL.
2.轉(zhuǎn)基因棉花的初步篩選收獲的種子用95％濃硫酸脫絨處理。將卡那霉素配制成300～500ppm濃度的浸種水溶液，進(jìn)行浸種，浸種時(shí)間24h，以水洗的細(xì)沙為發(fā)芽床，播種后保持發(fā)芽28℃，濕度保持75～80％；經(jīng)過7天左右，棉苗子葉完全平展，對(duì)棉苗進(jìn)行計(jì)數(shù)，按黃斑率初步鑒定轉(zhuǎn)基因抗性單株。提取具卡那霉素抗性的植株的總DNA，將子葉發(fā)黃或發(fā)自的植株和沒有轉(zhuǎn)化的植株分別做陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR鑒定。
3.提高棉花花粉管通道轉(zhuǎn)化效率研究棉花授粉后不同時(shí)間段導(dǎo)入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以自花授粉24h為準(zhǔn)，導(dǎo)入時(shí)間越早，脫鈴率越高。隨著自花授粉時(shí)間的延長，成鈴率越高。以綠苗率代表轉(zhuǎn)基因陽性率，以18～24h較好。其余時(shí)間轉(zhuǎn)化效率較差。
不同導(dǎo)入組合花粉管通道法數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

質(zhì)粒濃度[GFP]＝5.23ug/ul；[VirD1]＝3.48ug/ul；[VirD2]＝4.92ug/ul；[VirE2]＝4.33ug/ul表中看，以農(nóng)桿菌毒蛋白基因輔助轉(zhuǎn)化的效果比對(duì)照明顯提高，提高效率達(dá)3.4倍以上，如果同時(shí)用脂質(zhì)體包裝后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率比對(duì)照提高4.25倍。農(nóng)桿菌直接滴加的轉(zhuǎn)化效果不明顯。
序列表<110>石河子大學(xué)<120>利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法<160>6<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1atgtcgcaaggcagtagg<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ttacaaggcgtctttcagca<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3cgccatggatgcccgatcgagctcaag<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>4cggtcgactgccatcactcggtccttc<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>5atggatccgaaggccga<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>6tgacgcggtatcaggaa
權(quán)利要求
1.一種利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征是通過以下過程實(shí)現(xiàn)的(1)植物增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建；(2)virD1、virD2和virE2基因克隆、原核表達(dá)分析；原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析將virD1、virD2和virE2基因從克隆載體上切下，將其融合到分泌型原核表達(dá)載體，大腸桿菌周質(zhì)蛋白phoA或外膜ompA蛋白信號(hào)引導(dǎo)肽核酸序列的下游，構(gòu)建成分泌型原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到L型細(xì)胞壁缺陷的大腸桿菌中，產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，進(jìn)行提取純化，用純化的蛋白加弗氏佐劑免疫新西蘭白兔，抽提血清，制備一抗并測(cè)定效價(jià)，(3)virD1、virD2和virE2基因植物瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建；植物瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的序列圖譜和酶切圖譜，在virD1、virD2和virE2基因編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物，并在引物上加上用于克隆的酶切位點(diǎn)，通過高保真PCR技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的基因擴(kuò)增，將產(chǎn)物直接構(gòu)建到帶有抗卡那霉素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體上，將帶有強(qiáng)植物啟動(dòng)子-毒蛋白基因-終止子的完整的表達(dá)框切下，構(gòu)建到高效克隆載體pUC18的多克隆位點(diǎn)上，獲得不帶左右邊界序列的植物瞬時(shí)表達(dá)載體；(4)virD1、virD2和virE2基因或蛋白與報(bào)告基因經(jīng)脂質(zhì)體包裝，對(duì)煙草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化整合頻率研究；T-DNA蛋白復(fù)合物的體外組裝將需要轉(zhuǎn)化的帶有目的基因pBin-EGFP植物表達(dá)載體，加入到植物細(xì)胞提取液中，并按順序加入提取并純化的virD1、virD2蛋白，接著加入DNA聚合酶I，通過缺口平移產(chǎn)生相應(yīng)的T-DNA單鏈，加入virE2蛋白孵育，然后用核酸酶完全消化混合物，凝膠阻滯電泳分析，與此同時(shí)酚氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀、純化DNA，最終通過特異性引物，對(duì)相應(yīng)T-DNA片段進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，評(píng)估virD1、virD2和virE2蛋白活性，研究T-DNA蛋白復(fù)合體最佳組裝方式和濃度配比；脂質(zhì)體包裝將T-DNA蛋白復(fù)合物或virD1、virD2和virE2基因與含有目的基因GFP質(zhì)粒載體按一定比例混合，用陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行包裝處理，并對(duì)煙草原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究，同時(shí)利用抗生素，對(duì)轉(zhuǎn)化煙草體細(xì)胞系進(jìn)行多代篩選，再生植株并檢測(cè)其整合效率，以此間接推斷毒蛋白在植物體內(nèi)的組裝活性，在此基礎(chǔ)上對(duì)脂質(zhì)體最佳轉(zhuǎn)化條件及緩沖液組成進(jìn)行研究；(5)在virD1、virD2和virE2基因能在植物體內(nèi)正常表達(dá)并具有活性的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的機(jī)理，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化和花粉管通道技術(shù)相結(jié)合，對(duì)棉花轉(zhuǎn)化效率及遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)；(6)改良花粉管通道技術(shù)體系的評(píng)價(jià)在(4)(5)研究的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的機(jī)理，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化和花粉管通道技術(shù)相結(jié)合，田間對(duì)特定的棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化，后代在苗期利用抗生素及長波紫外燈進(jìn)行篩選，同時(shí)進(jìn)行分子驗(yàn)證，確定其轉(zhuǎn)化頻率同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行連續(xù)多代系譜式的跟蹤調(diào)查，研究其遺傳穩(wěn)定性。
2.如權(quán)利要求1所述的利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于所述的過程中，按每1×105～5×106個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞分別加濃度為5～25μLpUC-pBin-GFP的質(zhì)粒、濃度為5～15μL pUC-pBin-VirD1、5～15μL pUC-pBin-VirD2和5～15μLpUC-pBin-VirE2的協(xié)助基因進(jìn)行組裝。
3.如權(quán)利要求2所述的利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于所述的過程中，其組裝是pUC-pBin-VirD1+UC-pBin-VirD2+pUC-pBin-VirE2+pUC-pBin-GFP，pUC-pBin-GFP質(zhì)粒濃度為15～20μL。
4.如權(quán)利要求1、或2、或3所述的利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于所述的過程脂質(zhì)體包裝時(shí)，利用農(nóng)桿菌協(xié)助轉(zhuǎn)化的毒蛋白基因，在體外同需要轉(zhuǎn)化的目的基因(綠色熒光蛋白基因)組裝或混合，以質(zhì)粒濃度[GFP]＝3～6ug/ul；[VirD1]＝3～5ug/ul；[VirD2]＝3～5ug/ul；[VirE2]＝3～5ug/ul，按1∶1∶1∶5組裝，經(jīng)脂質(zhì)體包裝后，用花粉管通道技術(shù)，對(duì)棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
5.一種利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法在棉花種植中的應(yīng)用，其特征在于選擇第二天即將開放的棉花花蕾用夾子夾住花蕾頂部，進(jìn)行自交，選擇每個(gè)果枝的第一和第二個(gè)果節(jié)位的花朵作為轉(zhuǎn)基因操作的對(duì)象，開花后18-24h左右進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前，不用剝花和分開苞葉，直接用單面刀片在花萼上部橫切，將花柱及切面上部花瓣切除，同時(shí)在子房頂部切出0.3～0.7cm直徑的切面，然后用微量注射器滴加DNA溶液，滴加的量5～10uL，DNA濃度2～5ug/uL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用農(nóng)桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率的方法，主要利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化機(jī)理，利用農(nóng)桿菌協(xié)助轉(zhuǎn)化的毒蛋白基因，在體外同需要轉(zhuǎn)化的目的基因(綠色熒光蛋白基因)組裝或混合，經(jīng)脂質(zhì)體包裝后，采用花粉管通道技術(shù)，對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并利用上述的方法對(duì)植物、尤其是對(duì)棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明將農(nóng)桿菌－脂質(zhì)體－花粉管通道技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率明顯提高，質(zhì)粒不僅在進(jìn)行入胚囊階段受脂質(zhì)體保護(hù)，而且在進(jìn)入卵細(xì)胞后，能被表達(dá)的毒蛋白包被，提高了外源DNA在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的穩(wěn)定性，能夠精確的在T－DNA區(qū)加工切割，提高了轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101092633SQ20071008995
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日
發(fā)明者祝建波, 張煜星, 崔百明, 王愛英, 劉紅玲, 李小紅, 王彥芹 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)