專利名稱：：一種口蹄疫抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備抗原的方法，尤其涉及一種利用重組桿狀病毒在昆蟲體內(nèi)表達(dá)口蹄疫抗原的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：口蹄疫是由口蹄疫病毒(FoofflwJ-moW/zWn,FMDV)弓I起偶蹄動物的一種急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，以傳播迅速、感染率高而著稱。該病一旦爆發(fā)將對發(fā)病國造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界各國對該病的研究極為重視，國際獸醫(yī)局將其列為A類傳染病之首?？谔阋邔儆谛NA病毒科口蹄疫病毒屬的成員，有A、O、C、Asial、SAT1、SAT2禾BSAT3型7個血清型。目前我國口蹄疫的防制仍以預(yù)防為主。盡管傳統(tǒng)疫苗在口蹄疫預(yù)防控制中仍占主導(dǎo)地位，但生產(chǎn)成本昂貴，免疫期短，疫苗制備過程中病毒逃逸等危險因素很難避免。因此，傳統(tǒng)疫苗亟需加以改進(jìn)，研制安全、高效的口蹄疫分子疫苗仍顯得非常必要。隨著生物技術(shù)、基因工程等高新技術(shù)的發(fā)展，人們意識到通過基因工程的手段，利用生物反應(yīng)器來高效表達(dá)口蹄疫基因，可望達(dá)到大幅度提高口蹄疫抗原產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的(ConneelyO.M.,BiotechnologyintheFeedIndustry,T.P.Lyons(Ed),AlltechTechnicalPublications.Nicholasville，KY.57-66,1992)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)這一生物反應(yīng)器是八十年代建立起來的。自從1983年首次利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了人的a-干擾素以來(Smith,Mol.CellBiol.,3:2156-2165,1983)，已有數(shù)十個外源基因得到了高效表達(dá)，僅我國就有a-干擾素(楊冠珍等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，22:355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制劑(季平等，蠶業(yè)科學(xué)，21:223-227，1995)、馬立克氏病毒糖蛋白B(肖慶利等，蠶業(yè)科學(xué)，23:104-108，1997)等多種。利用此系統(tǒng)來生產(chǎn)口蹄疫抗原的優(yōu)點在于1.這一表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)效率極高，產(chǎn)量可達(dá)10毫克級/蟲的水平。因而可大大降低口蹄疫抗原的生產(chǎn)成本并使通過基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)口蹄疫抗原成為可能；2.這一表達(dá)系統(tǒng)為真核表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)的外源蛋白質(zhì)可進(jìn)行翻譯后修飾，使其在生化性質(zhì)和生物活性等與天然產(chǎn)品相似，這為所表達(dá)的口蹄疫抗原具有正常的蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)免疫活性提供了保證。目前，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，尤其是其中的家蠶(Bm)-家蠶桿狀病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)是世界上最具有商業(yè)開發(fā)價值的真核生物個體表達(dá)系統(tǒng)之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲體內(nèi)安全、高效的表達(dá)口蹄疫抗原的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種制備口蹄疫抗原的方法，包括將口蹄疫不同的基因組合分別克隆到桿狀病毒運載載體中，獲得轉(zhuǎn)移載體；用所獲得的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染桿狀病毒進(jìn)行DNA重組，獲得重組桿狀病毒；用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主使其進(jìn)行口蹄疫抗原表達(dá)；收獲并純化所表達(dá)的抗原。其中，所述的口蹄疫不同的基因組合優(yōu)選自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5所示的堿基序列；所述的桿狀病毒運載載體優(yōu)選自AcRP23-/acZ，AcRP6-SC,AcUWl-/acZ,BacPAK6，BactoPac，Bacmid,BlucBacII(pETL)，p2Bac,p2Blue,p89B310,pAc360、pAc373，pAcAB3、pAcAB4，PAcAS3，pAcC129，pAcC4，DZI,pAcGP67，pAcIEl,pAcJPl,pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8,pAcMPl、pAcMP2，pAcRP23、pAcRP25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51，pAcVC2、pAcVC3,pAcYMl,pAcJcC5，pBacl、pBac2,pBlueBacIII，pBlueBacHis,pEV55、mXIV，pIEINeo,pJVETL,pJVNhel，pJVP10,pJVrsMAG，pMBac,pP10,pPAKl，pPBac,pSHONEX1.1,pSYNXIVVI+,pSYNVI+wp,pSYNXIVVI-,pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985，pVTBac,pBM030，pUAC-5或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體，更優(yōu)選為pVL1393。所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體優(yōu)選為pVL1393(P1-2A3C)、pVL1393(ORF)或pVL1393(VPl)。所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV、或TeNPV，優(yōu)選為家蠶桿狀病毒Bm-NPV-ZJ8;所述的重組桿狀病毒優(yōu)選為以下任意一種(1)家蠶核型多角體病毒rBmNPV(ORF)，其微生物保藏號是CGMCCNO.1980;保藏時間是2007年3月20H;保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所；(2)家蠶核型多角體病毒rBmNPV(P1-2A3C)，其微生物保藏號是CGMCCN0.1979;保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所；(3)家蠶核型多角體病毒rBmNPV(VPl)，其微生物保藏號是CGMCCN0.1975;保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。所述的昆蟲宿主選自包括家蠶(Bombyxmori)、野蠶(Bombyxmandarina)、蓖麻蠶(Philosamiacynthiaricim)、樟蠶(Dictyoplocajapanica)、樗蠶(Philosamiacynthiapryeri)、柞蠶(Antheraeapernyi)、日本柞蠶(Antheraeayamamai)、野天蠶(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜紋夜蛾(Spodopteralittoralis)、秋粘蟲(Spodopterafrugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)、行軍蟲(Thaumetopoeawilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)、美國棉鈴蟲(Heliothiszea)、煙青蟲(Heliothisassulta)、'煙草夜蟲我(Heliothisvirescens)、東方茅占蟲(Pseudaletiaseparata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)等；更優(yōu)選為家蠶(Bombyxmori)。所述的感染是指重組桿狀病毒通過口食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體(更優(yōu)選為將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或穿刺接種l-5齡的家蠶幼蟲或蛹，在感染3-6天后收集含口蹄疫抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿)；其中，所述的蛹體為l-2天的早期嫩蛹。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)，將來源于口蹄疫病毒的不同基因組合，包括P1-2A3C、ORF、VP1構(gòu)建到各種桿狀病毒運載載體(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUWl-lacZ，BacPAK6，BactoPac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIEl，pAcJPl，pAcMLF2、7、8，pAcMPl、2，pAcRP23、25，pAc證4，pAcsMAG，pAcUWl、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYMl，pAcJcC5，pBacl、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhel，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAKl，pPBac，pSHONEX1.1，pSYNXIVVI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使口蹄疫病毒不同的基因組合，包括ORF、P1-2A3C、VP1基因在多角體啟動子、p10啟動子或別的病毒和真核生物的強啟動子控制之下，通過體內(nèi)或體外(invivo/invitro)重組，將口蹄疫病毒不同的基因組合，包括P1-2A3C、ORF、VP1整合到桿狀病毒的基因組上，得到重組病毒。重組病毒可通過經(jīng)口食下或采用各種手段透過表皮感染l-5齡(最優(yōu)時間為四或五齡)的昆蟲幼蟲或蛹體(最優(yōu)時間為l-2天的早期嫩蛹)，表達(dá)生產(chǎn)口蹄疫病毒抗原。本發(fā)明中最優(yōu)選的一個技術(shù)方案是將SEQIDNO:l(P1-2A3C)、SEQIDNO:3(ORF)或SEQIDNO:5(VP1)所示的堿基序列插入到運載載體pVL1393上，再通過體內(nèi)重組將全長P1-2A3C、ORF、VP1基因轉(zhuǎn)移到家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8的基因組上，替代基因組上的Polyhedrin基因，通過空斑篩選技術(shù)和PCR檢測技術(shù)，獲得攜帶口蹄疫不同基因組合的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)。將其感染家蠶細(xì)胞系或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹，大量繁殖rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)。當(dāng)rBmNPV(ORF)、rBmNPV(P1-2A3C)、rBmNPV(VP1)在蠶體內(nèi)復(fù)制時，ORF、P1-2A3C、VP1在多角體蛋白基因(polh)啟動子控制下表達(dá)，產(chǎn)生口蹄疫抗原。在感染3-6天(最佳為5天)后收集含口蹄疫抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液(或整體勻漿)，每毫升蠶血淋巴可產(chǎn)生IO毫克以上的口蹄疫抗原，殺滅感染性病原后，經(jīng)過蛋白純化后便得到安全、高效的口蹄疫抗原，此種抗原可用于制備疫苗。本發(fā)明方法采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中安全、高效的生產(chǎn)口蹄疫抗原，其生產(chǎn)成本顯著低于傳統(tǒng)的制備口蹄疫抗原方法(例如通過細(xì)胞繁殖病毒制備口蹄疫抗原)，無需投資建廠，無三廢，電力和水資源等能源消耗極少。由于家蠶已經(jīng)我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為食藥兼用昆蟲，所以將本發(fā)明方法所制備的抗原純化后，安全性極高，可直接制作疫苗免疫動物。總體而言，本發(fā)明方法可以大幅度降低口蹄疫抗原的生產(chǎn)成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點。圖l、口蹄疫病毒P1-2A3C在家蠶幼蟲中的表達(dá)。圖2、口蹄疫病毒P1-2A3C在家蠶蛹中的表達(dá)。圖3、口蹄疫病毒全長ORF在家蠶幼蟲中的表達(dá)。圖4、口蹄疫病毒全長ORF在家蠶蛹中的表達(dá)。圖5、口蹄疫病毒VP1在家蠶幼蟲中的表達(dá)。圖6、口蹄疫病毒VP1在家蠶蛹中的表達(dá)。具體實施方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。試驗材料1.大腸桿菌株E.coliTG1和DHsa購自Promega公司；運載載體pVL1393(購自Invitrogen公司)、家蠶細(xì)胞BmN、家蠶核型多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJ8由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存；口蹄疫病毒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫國家參考實驗室保存；抗原檢測試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所制備，家蠶品種JY1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存。2.酶與試劑限制性內(nèi)切酶、連接酶為Promega公司產(chǎn)品。3.生化試劑IPTG、X-Gal為Promega公司產(chǎn)品。Lipofectin、低融點瓊脂糖LMP、PCR試劑盒、T4DNA連接酶、RNA酶、ProteinaseK、胎牛血清及其他試劑購于Invitrogen公司，細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100購于Sigma公司。4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(l。/。蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0);家蠶細(xì)胞培養(yǎng)基為TC-IOO。5.口蹄疫病毒基因不同組合表達(dá)產(chǎn)物的動物實驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物隔離實驗室進(jìn)行。實施例1口蹄疫抗原的制備、純化及動物免疫實驗及病毒攻擊保護(hù)實驗1、P1-2A、3C基因的克隆和序列分析1.1目的基因的獲得設(shè)計引物，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出口蹄疫病毒抗原蛋白P1-2A基因與非結(jié)構(gòu)蛋白3C基因。所設(shè)計的抗原蛋白P1-2A基因和非結(jié)構(gòu)蛋白3C基因的擴(kuò)增引物為，P1-2A上游5，-ATAGGATCCACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGCC陽3，,Bfl/wHl酶切位點P1-2A下游5，-CGCGAATTCTGACATGTCCTCCTGCATCTGGTTG-3，?！阠oRI酶切位點3C上游5，-GCGGAATTCAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGT-3'?！阠oRI酶切位點3C下游5，-ATAAGATCTCTACTCGTGGTGTGGTTCGGGAT-3'Bg/n酶切位點從口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中提取總RNA。將提取的總RNA用01igo(dT)183物在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，42。C反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以獲得的cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下表lPCR反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反應(yīng)過程94。C變性10分鐘；94。Cl分鐘，58。Cl分鐘，72。C8分鐘，共30個循環(huán)。最后延伸反應(yīng)10分鐘。1.2.PCR產(chǎn)物的純化將PCR擴(kuò)增的P1-2A、3C基因產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出約2.4kb、0.7kb的片段。在紫外燈下用滅菌手術(shù)刀切取含相應(yīng)DNA片段的凝膠，然后用Geneclean試劑盒進(jìn)行純化。方法如下切取凝膠片段并稱重，將其放入滅菌的1.5ml小離心管中，加入3倍(v/w)體積的6MNal，37。C將凝膠溶解后，加入10pl玻璃奶(Glassmilk)，混勻后室溫下放置5分鐘，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm離心5秒鐘，再用NewWash溶液洗三次，每次均將沉淀彈起，并離心。最后將沉淀晾干后加入30nlO.lxTEBuffer溶解DNA，離心后去沉淀，取上清作進(jìn)一步分析。1.3.酶切與連接反應(yīng)酶切反應(yīng)純化后的P1-2A用S薩HI和五coRI雙酶切分析，反應(yīng)總體積為50^d，其中純化的PCR產(chǎn)物lOpl，10x酶相應(yīng)緩沖液5pl，兩種酶各為lpl，無菌水補足體積。37。C反應(yīng)2小時以上。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGEM-3Z作同樣酶切反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后于65T滅活10分鐘。連接反應(yīng)連接總體積15pl，PCR產(chǎn)物8^，載體1^d，5xT4DNA連接緩沖液3pl，T4DNA連接酶lpl，無菌水補足體積，1214。C連接過夜。用相同的方法酶切3C、pGEM-3Z，并進(jìn)行連接反應(yīng)。1.4.大腸桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化用75mMCaCl2制備大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。取步驟3中制備的連接混合物5^1，加到200pl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42。C熱激2分鐘，迅速置于冰上12分鐘，加入已溫育至37°C的LB培養(yǎng)基500pl，37°C培養(yǎng)1小時，取100200^涂布于含100^ig/ml氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37。C倒置培養(yǎng)過夜。1.5.質(zhì)粒DNA的制備(1)從轉(zhuǎn)化的LB平板上挑取單個菌落，接種于3ml含100pg/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)過夜。(2)取1.5ml菌液于小離心管中，3500rpm離心4min，去上清。(3)加入SolutionI150|iil，混勻后置于冰上15min。(4)加入SolutionII300pl，氯仿150pl，輕輕混勻后靜置5min。(5)加入SolutionIII450pl，混勻后置于冰上15min。(6)11000g離心10min，上清移入新管。(7)加入異丙醇450)il，混勻后置于4°C15min。(8)11000g離心6min，去上清。(9)加入TER250pl，混勻后置于37°C20min。(10)加入PPtBuffer300350pl，混勻后靜置15min。(11)llOOOg離心6min，去上清。(12)加入75%乙醇400^1。(13)11000g離心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1xTEBuffer40^1溶解，于-20。C保存。1.6.重組子的鑒定用5amHI/五coRI雙酶切1.5中制備的質(zhì)粒DNA，電泳后出現(xiàn)約2.4kb、0.7kb的DNA條帶的質(zhì)粒為重組運載質(zhì)粒pGEM-3Z(P1-2A)。用五coRI/Sg/11酶切1.5中制備的質(zhì)粒DNA，電泳后出現(xiàn)0.7kb的DNA條帶的質(zhì)粒為重組運載質(zhì)粒pGEM-3Z(3C)。將重組質(zhì)粒pGEM-3Z(P1-2A)、pGEM-3Z(3C)進(jìn)行雙向測序。P1-2A3C基因序列及氨基酸序列分別見SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。2、轉(zhuǎn)移載體pVL1393(P1-2A3C)的構(gòu)建將1.6中所制備的質(zhì)粒pGEM-3Z(P1-2A)用5，HI和五coRI雙酶切，用1.2中的方法純化P1-2A基因片段，與經(jīng)5amHI和五coRI雙酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，篩選得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393(P1-2A)。將1.6中制備的質(zhì)粒pGEM-3Z(3C)用五coRI和Sg/II雙酶切，按1.2的方法純化3C基因片段，與經(jīng)五coRI和萬g/II雙酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVL1393(P1-2A)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，篩選得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393(P1-2A3C)。3、家蠶核多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制備按GIBCO公司產(chǎn)品說明配制lxTC-100培養(yǎng)基，用2NNaOH將pH調(diào)至6.22，過濾除菌后的培養(yǎng)基補加10%胎牛血清，27。C下培養(yǎng)家蠶細(xì)胞BmN。用家蠶核多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJ8感染對數(shù)生長期的細(xì)胞約50ml，感染復(fù)數(shù)為1，34天后收集病毒感染液，離心(5000rpmx10min)，除去沉淀，上清用25000rpm離心1小時，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris12.1g，EDTA33.6g，KC114.1g，pH7.5)懸浮病毒粒子沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入蛋白酶K至終濃度為50pg/ml，50°C保溫2小時，再加入35%的Sarkorsel至終濃度為1%，繼續(xù)于50。C保溫2小時，分別用等體積的苯酚、苯酚氯仿(1:1)氯仿依次抽提，將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新管中，加入1/10體積的3MNaCl，再加入2倍體積的無水乙醇，一20。C放置2小時以上沉淀病毒DNA，5000rpm離心IO分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，冷凍干燥。溶解在100plTEBuffer中，放4。C保存?zhèn)溆谩?、重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(P1-2A3C)的構(gòu)建和獲得4.1重組桿狀病毒rBmNPV(P1-2A3C)的構(gòu)建接種大約lxl(^細(xì)胞于15ct^培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后，除去含胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基洗三次，加1.5ml無FBS培養(yǎng)基。向一滅菌管中依次加入1|Lig家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2pg重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVL1393(P1-2A3C)DNA和5pl脂質(zhì)體，用無菌雙蒸水補足體積到60pl，輕輕混勻，靜置15分鐘后，逐滴加入到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。27°C培養(yǎng)4小時后補加1.5ml無血清培養(yǎng)基和300plFBS。27。C恒溫培養(yǎng)45天，收集上清液用于重組病毒的篩選。4.2重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(P1-2A3C)的篩選和純化接種適量細(xì)胞(約7080%)于35mm小平皿中，細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，將共轉(zhuǎn)染上清進(jìn)行不同濃度稀釋，取lml共轉(zhuǎn)染液加到貼壁細(xì)胞中，分布均勻。270C感染1小時后，吸去感染液，將2%低融點瓊脂糖凝膠于60°(:水浴中融化，冷至40。C與40。C預(yù)熱的2xTC—100培養(yǎng)基(含20XFBS)混合均勻，每平皿加4ml膠，待凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培養(yǎng)35天，顯微鏡觀察。將不含有多角體的空斑挑選出來，重復(fù)以上步驟，經(jīng)過23輪的純化獲得純的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(P1-2A3C)(其微生物保藏號是CGMCCN0.1979)。4.3重組病毒rBmNPV(P1-2A3C)在家蠶細(xì)胞中的擴(kuò)增將重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(P1-2A3C)感染正常生長的BmN細(xì)胞，培養(yǎng)3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重組病毒rBmNPV(P1-2A3C)。4.4重組病毒的鑒定利用PCR方法分析外源基因整合。游離病毒基因組DNA的提取方法如下取病毒上清150/d，加入150/xl(0.5mol/L)的NaOH后混勻，再加入20^1(8mol/L)的醋酸銨，混勻后用等體積的酚和氯仿分別抽提一次，酒精沉淀后用20/xl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物為5，-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3'5'-TTACAr,cATCTrTCTTTccArTrTTrTr;AAT-:v取上述病毒基因組DNAl/xl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94。C變性5min、94°Clmin、58。Clmin、72°Clmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸5min。取15/il反應(yīng)產(chǎn)物電泳分析，結(jié)果證明獲得了重組病毒。5、P1-2A3C基因在家蠶中的表達(dá)本實驗所用的家蠶高表達(dá)品種為JY1(由本實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。餉食后48h選擇平均體重相同的家蠶，每頭蠶接種約1.0xl()SrBmNP(P1-2A3C)，4-5天后收集發(fā)病蠶血淋巴，-20°〇凍存以進(jìn)行雙抗體夾心￡1^18八法檢領(lǐng)"96孔酶標(biāo)板用兔抗口蹄疫陽性血清包被，4。C過夜。脫脂奶粉封閉后，將口蹄疫陽性抗原、感染rBmNPV(P1-2A3C)家蠶收獲的蠶血、感染Bm-NPV—ZJ8的家蠶收獲的蠶血做2倍梯度稀釋。37。C作用lh后，洗滌，加入豚鼠抗FMDV陽性血清，37。C作用lh。洗滌后加入HRP-兔抗豚鼠IgG，37°C作用lh。加入底物OPD-H202，于37匸作用15min，用終止液結(jié)束反應(yīng)，于入492nm處測定OD值。結(jié)果如圖l所示從感染rBmNPV(P1-2A3C)的家蠶中收獲的血淋巴OD值隨倍比稀釋度的增加逐漸下降，其變化規(guī)律與陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原變化規(guī)律相同。從OD值測定實驗結(jié)果來看，其表達(dá)量達(dá)到陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原表達(dá)水平的100倍以上，而對照Bm-NPV—ZJ8感染的蠶血淋巴中未檢測到抗原表達(dá)。6、P1-2A3C基因在家蠶蛹體中表達(dá)本實驗所用的家蠶蛹為高表達(dá)品種為JY1(由本實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。結(jié)繭七天后選擇平均體重相同的15粒蠶蛹，餉食后48h選擇平均體重相同的家蠶，每頭蠶蛹接種約1.0xl()SrBmNPV(P1-2A3C)，4-5天后收集發(fā)病蠶蛹血淋巴，-20°C凍存以進(jìn)行雙抗體夾心ELISA法檢測。結(jié)果如圖2所示從感染rBmNPV(P1-2A3C)的家蠶蛹中收獲的血淋巴OD值隨倍比稀釋度的增加逐漸下降，其變化規(guī)律與陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原的OD值變化規(guī)律相同。從OD值測定實驗結(jié)果來看，其表達(dá)量達(dá)到陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原表達(dá)水平的100倍以上，而對照Bm-NPV—ZJ8感染的蠶血淋巴中未檢測到抗原表達(dá)。7、口蹄疫抗原的純化稱取Sephadex干凝膠，溶脹處理后裝于玻璃色譜柱中，以洗脫液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH8.0)洗至基線穩(wěn)定。分別將上述5和6中所收獲的蠶血淋巴經(jīng)超聲波破碎，離心去細(xì)胞碎片。取上述樣品上樣，取適量洗脫液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脫液，收集至第一峰下降，將所收集的蛋白洗脫液合并，得純化的口蹄疫抗原。8、動物免疫實驗及病毒攻擊保護(hù)實驗將收集的純化抗原與等體積油佐劑混合。取3ml/頭頸部肌肉免疫牛。實驗組免疫5頭牛，設(shè)立2頭牛的對照組。在注射疫苗前，采用世界動物衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)方法液相阻斷ELISA法對侯選牛進(jìn)行抗體水平的檢測，挑選其效價低于1/8的牛在蘭州獸醫(yī)研究所的隔離動物房進(jìn)行實驗收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻斷ELISA法檢測牛血清中的抗FMDV抗體水平，所有的實驗動物都取得了較高的抗體水平。采用10,000BIDm)的同源病毒接種牛舌，連續(xù)觀測10d，檢測唇部及四蹄發(fā)病情況，實驗組的5頭動物獲得了全部保護(hù)，而對照組動物全部發(fā)病。實施例2口蹄疫抗原的制備、純化及動物免疫實驗及病毒攻擊保護(hù)實驗1、口蹄疫病毒全長ORF的克隆和序列分析設(shè)計引物，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出口蹄疫病毒全長ORF(SEQIDNO:3)。所設(shè)計的擴(kuò)增全長ORF的擴(kuò)增引物為，ORF:5，-GCGACTAGTACCATGGAATTCACACTTCACAACGGTGAG-3'，酶切位點ORF:5，-ATAGCGGCCGCAGGGATTATGCGTCACCGCACAC-3'。7VWI酶切位點從口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中提取總RNA。將提取的總RNA用Oligo(dT)is引物在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，42'C反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以獲得的cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>PCR反應(yīng)過程94。C變性10分鐘；94。Cl分鐘，58°C1分鐘，72。C8分鐘，共30個循環(huán)。最后延伸反應(yīng)10分鐘。2、轉(zhuǎn)移載體pVL1393(ORF)的構(gòu)建將中擴(kuò)增得到的ORF按實施例1中1.2的方法純化，用^el和WWI雙酶切后，與經(jīng)^d和雙酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，篩選得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393(ORF)。將重組質(zhì)粒pVL1393(ORF)進(jìn)行雙向測序。ORF基因序列及氨基酸序列分別見SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。3、重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(ORF)的構(gòu)建和獲得3.1、重組桿狀病毒rBmNPV(ORF)的構(gòu)建接種大約lxloe細(xì)胞于15cn^培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后，除去含胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基洗三次，加1.5ml無FBS培養(yǎng)基。向一滅菌管中依次加入1pg家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2pg重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVL1393(ORF)DNA和5nl脂質(zhì)體，用無菌雙蒸水補足體積到60pl，輕輕混勻，靜置15分鐘后，逐滴加入到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。27。C培養(yǎng)4小時后補加1.5ml無血清培養(yǎng)基和300plFBS。27。C恒溫培養(yǎng)45天，收集上清液用于重組病毒的篩選。3.2重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(ORF)的篩選和純化接種適量細(xì)胞(約7080%)于35mm小平皿中，細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，將共轉(zhuǎn)染上清進(jìn)行不同濃度稀釋，取lml共轉(zhuǎn)染液加到貼壁細(xì)胞中，分布均勻。27T感染l小時后，吸去感染液，將2%低融點瓊脂糖凝膠于60°(:水浴中融化，冷至40°C與40°C預(yù)熱的2xTC—100培養(yǎng)基(含20%FBS)混合均勻，每平皿加4ml膠，待凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培養(yǎng)35天，顯微鏡觀察。將不含有多角體的空斑挑選出來，重復(fù)以上步驟，經(jīng)過23輪的純化獲得純的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(ORF)(其微生物保藏號是CGMCCNO.1980)。3.3重組病毒rBmNPV(ORF)在家蠶細(xì)胞中的擴(kuò)增將重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(ORF)感染正常生長的BmN細(xì)胞，培養(yǎng)3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重組病毒rBmNPV(ORF)。3.4重組病毒的鑒定利用PCR方法分析外源基因整合。游離病毒基因組DNA的提取方法如下取病毒上清150^1，加入150/d(0.5mol/L)的NaOH后混勻，再加入20^1(8mol/L)的醋酸銨，混勻后用等體積的酚和氯仿分別抽提一次，酒精沉淀后用20/xl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物為5'-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3,5，-TTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3'取上述病毒基因組DNAl/d進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94。C變性5min、94QClmin、55°Clmin、72°Clmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸5min。取15/xl反應(yīng)產(chǎn)物電泳分析，結(jié)果證明獲得了重組病毒。4、ORF在家蠶中的表達(dá)本實驗所用的家蠶高表達(dá)品種為JY1(由本實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。餉食后48h選擇平均體重相同的家蠶，每頭蠶接種約1.0x105rBmNPV(ORF)，4-5天后收集發(fā)病蠶血淋巴，-20"凍存以進(jìn)行雙抗體夾心￡1^18八法檢測。96孔酶標(biāo)板用兔抗FMDV陽性血清包被，4t:過夜。脫脂奶粉封閉后，將FMDV抗原、感染rBmNPV(ORF)家蠶收獲的蠶血、感染Bm-NPV—ZJ8的家蠶收獲的蠶血做2倍梯度稀釋。37t:作用lh后，洗滌，加入豚鼠抗FMDV陽性血清，37。C作用lh。洗滌后加入HRP-兔抗豚鼠IgG，37。C作用lh。加入底物OPD-H202，于37。C作用15min，用終止液結(jié)束反應(yīng)，于入492nm處測定OD值。結(jié)果如圖3所示從感染rBmNPV(ORF)的家蠶中收獲的血淋巴OD值隨倍比稀釋度的增加逐漸下降，其變化規(guī)律與陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原的OD值變化規(guī)律相同。從OD值測定實驗結(jié)果來看，其表達(dá)量達(dá)到陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原表達(dá)水平的10倍以上，而對照Bm-NPV—ZJ8感染的蠶血淋巴中未檢測到抗原表達(dá)。5、ORF在家蠶蛹體中表達(dá)本實驗所用的家蠶蛹為高表達(dá)品種為JY1(由本實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。結(jié)繭七天后選擇平均體重相同的15粒蠶蛹，餉食后48h選擇平均體重相同的蠶蛹，每頭蠶蛹接種約1.0xl()SpfUrBmNPV(ORF)，4-5天后收集發(fā)病蠶蛹血淋巴，-20°C凍存以進(jìn)行雙抗體夾心ELISA法檢測。結(jié)果如圖4所示從感感染rBmNPV(ORF)的蠶蛹中收獲的血淋巴OD值隨倍比稀釋度的增加逐漸下降，其變化規(guī)律與陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原變化規(guī)律相同。從OD值測定實驗結(jié)果來看，其表達(dá)量達(dá)到陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原表達(dá)水平的10倍以上，而對照Bm-NPV—ZJ8感染的蠶血淋巴中未檢測到抗原表達(dá)。6、抗原純化稱取Sephadex干凝膠，溶脹處理后裝于玻璃色譜柱中，以洗脫液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH8.0)洗至基線穩(wěn)定。分別將4和5所收獲的蠶血淋巴經(jīng)超聲波破碎，離心去細(xì)胞碎片。取上述樣品上樣，取適量洗脫液，流速0.3ml/min,以5min/管收集蛋白洗脫液,收集至第一峰下降，合并蛋白洗脫液，得純化抗原。7、動物免疫實驗及病毒攻擊保護(hù)實驗將6所收集的純化抗原與等體積油佐劑混合。取3ml/頭頸部肌肉免疫牛。實驗組免疫5頭牛，設(shè)立2頭牛的對照組。在注射疫苗前，采用世界動物衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)方法液相阻斷ELISA法對侯選牛進(jìn)行抗體水平的檢測，挑選其效價低于1/8的牛在蘭州獸醫(yī)研究所的隔離動物房進(jìn)行實驗。收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻斷ELISA法檢測牛血清中的抗FMDV抗體水平，所有的實驗動物都取得了較高的抗體水平。采用10，000BIDm)的同源病毒接種牛舌，連續(xù)觀測10d，檢測唇部及四蹄發(fā)病情況，實驗組的5頭動物獲得了4頭保護(hù)，而對照組動物全部發(fā)病。實施例3口蹄疫抗原的制備、純化及動物免疫實驗及病毒攻擊保護(hù)實驗1、FMDVVP1基因的克隆和序列分析設(shè)計引物，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出口蹄疫病毒VP1基因。所設(shè)計的擴(kuò)增VP1基因的擴(kuò)增引物為，VP1上游5，-ATAGGATCCACCATGGCCACCACTACCGGCGAGTCAG-3，,萬amHl酶切位點VP1下游5，-CGCGAATTCTTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3，?！阠oRI酶切位點從口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中提取總RNA。將提取的總RNA用01igo(dT^弓物在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，42'C反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以獲得的cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下表3PCR反應(yīng)條件加入物體積滅菌ddH2033pi10XPCRBuffer5^12.5MmdNTP4^125MmMgCl23pi5'引物1pi3'引物1pi模板DNA2piTaq酶1(alTotal50piPCR反應(yīng)過程94。C變性IO分鐘；94°C1分鐘，58。C1分，72°C1分鐘，共30個循環(huán)。最后延伸反應(yīng)10分鐘。2、轉(zhuǎn)移載體pVL1393(VP1)的構(gòu)建按實施例1中1.2的方法純化1所獲得VP1基因片段，用SamHI和五coRI雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，篩選得到重組轉(zhuǎn)移載pVL1393(VP1)。將重組質(zhì)粒pVL1393(VP1)進(jìn)行雙向測序。VP1基因序列及氨基酸序列分別見SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。3、重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(VP1)的構(gòu)建和獲得3.1重組桿狀病毒rBmNPV(VP1)的構(gòu)建接種大約lxl(^細(xì)胞于15cmH咅養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后，除去含胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基洗三次，力口1.5ml無FBS培養(yǎng)基。向一滅菌管中依次加入1jug家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2pg重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVL1393(VP1)DNA和5pl脂質(zhì)體，用無菌雙蒸水補足體積到60nl，輕輕混勻，靜置15分鐘后，逐滴加入到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。27。C培養(yǎng)4小時后補加1.5ml無血清培養(yǎng)基和300plFBS。27。C恒溫培養(yǎng)45天，收集上清液用于重組病毒的篩選。3.2重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(VP1)的篩選和純化接種適量細(xì)胞(約7080%)于35mm小平皿中，細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，將共轉(zhuǎn)染上清進(jìn)行不同濃度稀釋，取lml共轉(zhuǎn)染液加到貼壁細(xì)胞中，分布均勻。27。C感染l小時后，吸去感染液，將2%低融點瓊脂糖凝膠于60°(:水浴中融化，冷至40°C與40°C預(yù)熱的2xTC—100培養(yǎng)基(含20%FBS)混合均勻，每平皿加4ml膠，待凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培養(yǎng)35天，顯微鏡觀察。將不含有多角體的空斑挑選出來，重復(fù)以上步驟，經(jīng)過23輪的純化獲得純的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(VP1)(其微生物保藏號是CGMCCN0.1975)。3.3重組病毒rBmNPV(VP1)在家蠶細(xì)胞中的擴(kuò)增將重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(VP1)感染正常生長的BmN細(xì)胞，培養(yǎng)3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重組病毒rBmNPV(VPl)。3.4重組病毒的鑒定利用PCR方法分析外源基因整合。游離病毒基因組DNA的提取方法如下取病毒上清150/il，加入150|id(O.5mol/L)的NaOH后混勻，再加入20pl(8mol/L)的醋酸銨，混勻后用等體積的酚和氯仿分別抽提一次，酒精沉淀后用20Ad的TE溶解DNA。寡核苷酸引物為5，畫GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3'5，-TTACACCATCTGCTTTCCAGGTGCAAT-3'取上述病毒基因組DNAl/d進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94。C變性5min、94°Clmin、55。Clmin、72°Clmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸5min。取15/il反應(yīng)產(chǎn)物電泳分析，結(jié)果證明獲得了重組病毒。4、VP1在家蠶中的表達(dá)本實驗所用的家蠶高表達(dá)品種為JY1(由本實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。銅食后48h選擇平均體重相同的家蠶，每頭蠶接種約1.0xlO、BmNPV(VP1)，4-5天后收集發(fā)病蠶血淋巴，-201凍存以進(jìn)行雙抗體夾心￡^8入法檢測。結(jié)果如圖5所示從感染rBmNPV(VP1)的家蠶中收獲的血淋巴OD值隨倍比稀釋度的增加逐漸下降，其變化規(guī)律陽性與對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原變化規(guī)律相同。從OD值測定實驗結(jié)果來看，其表達(dá)量達(dá)到陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原表達(dá)水平的100倍以上，而對照Bm-NPV—ZJ8感染的蠶血淋巴中未檢測到抗原表達(dá)。5、VP1基因在家蠶蛹體中表達(dá)本實驗所用的家蠶蛹為高表達(dá)品種為JY1(由本實驗室保存)。JY1品種家蠶飼養(yǎng)按呂鴻聲主編的《中國養(yǎng)蠶學(xué)》(上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991)的常規(guī)方法進(jìn)行。結(jié)繭七天后選擇平均體重相同的15粒蠶蛹，餉食后48h選擇平均體重相同的蠶蛹，每頭蠶蛹接種約1.0xl()SrBmNPV(VP1)，4-5天后收集發(fā)病蠶血淋巴，-20°(3凍存以進(jìn)行雙抗體夾心ELISA法檢測。結(jié)果如圖6所示從感染rBmNPV(ORF)的家蠶中收獲的血淋巴OD值隨倍比稀釋度的增加逐漸下降，其變化規(guī)律與陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原變化規(guī)律相同。從OD值測定實驗結(jié)果來看，其表達(dá)量達(dá)到陽性對照傳統(tǒng)細(xì)胞苗病毒抗原表達(dá)水平的100倍以上，而對照Bm-NPV—ZJ8感染的蠶血淋巴中未檢測到抗原表達(dá)。6、抗原純化稱取Sephadex干凝膠，溶脹處理后裝于玻璃色譜柱中，以洗脫液(5mmol/LTris溶液，0.1mol/LNaCl，pH8.0)洗至基線穩(wěn)定。分別將4和5所收獲的蠶血淋巴經(jīng)超聲波破碎，離心去細(xì)胞碎片。取上述樣品上樣，取適量洗脫液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脫液,收集至第一峰下降，合并蛋白洗脫液，得純化抗原。7、動物免疫實驗及病毒攻擊保護(hù)實驗將4或5收集的蠶血淋巴經(jīng)超聲波破碎，棄細(xì)胞碎片后，與等體積油佐劑混合。取3ml/頭頸部肌肉免疫牛。實驗組免疫5頭牛，設(shè)立2頭牛的對照組。在注射疫苗前，采用世界動物衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)方法液相阻斷ELISA法對侯選牛進(jìn)行抗體水平的檢測，挑選其效價低于1/8的牛在蘭州獸醫(yī)研究所的隔離動物房進(jìn)行實驗收集免疫后21d的牛血清，采用液相阻斷ELISA法檢測牛血清中的抗口蹄疫抗體水平，所有的實驗動物都取得了較高的抗體水平。采用10，000BID5c的同源病毒接種牛舌，連續(xù)觀測10d，檢測唇部及四蹄發(fā)病情況，實驗組的5頭動物有4頭得到保護(hù)，而對照組動物全部發(fā)病。序列表<110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所〈120〉一種口蹄疫抗原的制備方法<130>P0278〈160〉6<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉3024<212〉醒〈213〉Foot-and-mouthdiseasevirus〈220〉<221〉CDS<222>(1).■(3024)〈223〉〈400〉1ggagccgggcaatecageccggcgactgggteacagaaccagteaggc48GlyAlaGlyGinSerSerProAlaThrGlySerGinAsnGinSerGly151015aacactggaageateateaacaactactacatgcagcaataccagaac%AsnThrGlySerlielieAsnAsnTyrTyrMetGinGinTyrGinAsn202530tecatggacacacaacttggagacaacgetattageggaggctecaac144SerMetAspThrGinLeuGlyAspAsnAlalieSerGlyGlySerAsn354045gaaggttecactgacaccacctecacacacacaaacactacccaaaac192GluGlySerThrAspThrThrSerThrHisThrAsnThrThrGinAsn505560aacgattggttctcgcgcctggetagttecgccttcageggactgttc240AsnAspTrpPheSerArgLeuAlaSerSerAlaPheSerGiyLeuPhe65707580ggcgcgcttctggetgacaagaaaacggaagaaacaactttgcttgaa288GlyAlaLeuLeuAlaAspLysLysThrGluGluThrThrLeuLeuGlu859095gaccgcatecttaccaccaggaacggccacacgacgtcgacgacccag336AspArglieLeuThrThrArgAsnGlyHisThrThrSerThrThrGin10010^110tcgagegttggcgtgacatacggttacgetgtggetgaggacgcggta謝SerSerValGlyValThrTyrGlyTyrAlaValAlaGluAspAlaVal115120125teaggacctaacaccteaggtetcgagacccgtgttcaacaagcggag432SerGlyProAsnThrSerGlyLeuGluThrArgValGinGinAlaGlu130135140eggttcttcaaaaagcacttgtttgattggacaccgaatttggetttt480ArgPhePheLysLysHisLeuPheAspTrpThrProAsnLeuAlaPhe145150155160ggatactgtcactacctggaaetccccactgagcacaaaggtgtgtat528GlyTyrCysHisTyrLeuGluLeuProThrGluHisLysMyVaiTyr165170175ggcagtetcatggactegtacgcctacatgagaaacgggtgggacata576GlySerLeuMetAspSerTyrAlaTyrMetArgAsnGlyTrpAsplie180185190gaggtgactgetgttggaaaccagttcaacggcggttgtetccttgtt624GluValThrAlaValGlyAsnGinPheAsnGlyGlyCysLeuLeuVal195200205gcacttgtgccagagctgaagagecttgacacteggcagaaataccaa672AlaLeuValProGluLeuLysSerLeuAspThrArgGinLysTyrGin210215220ctgacccttttcccccatcagttcateaacccacgcaccaacatgacg720LeuThrLe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AlaTyrLysAlaAla179017951800ThrLysAlaGlyTyrCysGlyGlyAlaValLeuAlaLysAspGly180518101815AlaGluThrPhelieValGlyThrHisSerAlaGlyGlyAsnGly182018251830ValGlyTyrCysSerCvsValSerArgSerMetLeuLeuLysMet183518401845LysAlaHislieAspProGluProHisHisGluGlyLeulieVal185018551860AspThrArgAspValGluGluArgValHisValMetArgLysThr186518701875LysLeuAlaProThrValAlaHisGlvValPheAsnProGluPhe188018851890GlyProAlaAlaLeuSerAsnLysAspProArgLeuAspGluGly189519001905ValValLeuAspGluAlaliePheSerLysHisLysGlyAspThr191019151920LysMetSerGluGluAsplysAlaLeuPheArgArgCysAlaAla192519301935AspTyrAlaSerArgLeuHisSerValLeuGlyThrAlaAsnAla194019451950Prol>euSerlieTyrGluAlalieLysGlyValAspGlvLeuAsp195519601965'AlaMetGluProAspThrAlaProGlyLeuProTrpAlaLeuGin197019751980GlyLysArgArgGlyAlaLeulieAspPheGluAsnGlyThrVal198519901995GlyProGluValLysAlaAlaLeuGluLeuMetGluLysArgGlu200020052010TyrLysPheAlaCysGinThrPheLeuLysAspGlulieArgPro201520202025MetGluLysValArgAlaGlyArgThrArglieValAspValLeu203020352040ProValGluHislieLeuTyr丁hrArgMetMetlieGlyArgPhe204520502055CvsAlaGinMetHisSerAsnAsnGlvProGinlieGlySerAla'206020652070ValGlyCysAsnProAspValAspTrpGinArgPheGlyThrHis207520802085PheAlaGinTyrArgAsnValTrpAspValAspTyrSerAlaPhe209020952i00AspAlaAsnHisCysSerAspAlaMetAsnlieMetPheGluGlu210521102115ValPheAsnThrAspPheGlyPheHisProAsnAlaGluTrplie212021252130LeuLysThrLeuValAsnThrGluHisAlaTVrGluAsnLysArg213521402145lieThrValGluGlyGlyMetProSerGlyCysSerAlaThrSer215021552160lielieAsnThrlieLeuAsnAsnlieTyrValLeuTyrAlaLeu216521702175ArgArgHisTyrGluGlyValGluLeuAspThrTyrThrMetlie218021852190SerTyrGlyAspAsplieValValAlaSerAspHisAspLeuAsp219522002205PheGluAlaleuLysProHisPheLysSerLeuGlyGinThrlie221022152220ThrProAlaAspLysSerAspLysGlyPheValLeuGlyHisSer222522302235lieThrAspValThrPheLeuLysArgHisPheHisMetAspTyr22402245'2250'GlyThrGlyPheTyrLysProValMetAlaSerLysThrLeuGlu225522602565AlalieLeuSerPheAlaArgArgGlyThrlieGinGluLysLeu227022752280lieSerValAlaGlyLeuAlaValHisSerGlyProAspGluTvr228522902295ArgArgLeuPheGluProPheGinGlyLeuPheGlulieProSer230023052310TyrArgSerLeuTyrLeuArgTrpValAsnAlaValCysGlyAsp2315'23202325Ala<210〉5<211>636<212〉陽<213〉Foot-and-mouthdiseasevirus〈220〉<221〉CDS<222〉(1).(633)〈223〉<400>5accaccactaccggcgagteagcagacccggtaacaaccacggtcgag化ThrThrThrThrGlyGluSerAlaAspProValThrThrThrValGlu151015aactacggaggagaaactcagacagccaggeggcttcacactgatgtt96AsnTyrGlyGlyGluThrGinThrAlaArgArgLeuHisThrAspVal202530gccttcgttcttgacaggtttgtgaaaetcactgcacccaagaacatt144AlaPheValLeuAspArgPheValLysLeuThrAlaProLysAsnlie354045cagacccttgacetcatgcaaattcccteacacacgctggttggagca192GinThrUuAspLeuMetGinlieProSerHisThrLeuValGlyAla505560ctgctgeggtctgcgacgtactacttcteagacctggaggttgcgatt240LeuLeuArgSerAlaThrTyrTyrPheSerAspLeuGluValAlalie65707580gtccacacaggcccgateacctgggtgcccaacggctegcccaaggat288ValHisThrGlyProlieThrTrpValProAsnGlySerProLysAsp859095getetagacaaccagaccaacccaactgcctaccagaagcaacctgtc336AlaLeuAspAsnGinThrAsnProThrAlaTyrGinLysGinProVal100105110acccgcttggcgetcccctacaccgccccccatcgtgtgctggcgaca384ThrArgLeuAlaLeuProTyi'ThrAlaProHisArgValLeu人laThr115120125gtgtacaacgggaagacgacgtacggggaaacaaccgcgeggcgtggc432ValTyrAsnGlyLysThrThrTyrGlyGluThrThrAlsArgAtgGly1^30135140gatacggcggcccttgcacaaagactgagtgggeggctgcccacctea480AspThrAlaAlaleuAlaGinArgLeuSerGlyArgLeuProThrSer145150155160tttaactacggcgetgtaaaggetgaaaccateactgagcttttgatt528PheAsnTyrGlyAlaValLysAlaGluThrlieThrGluLeuLeulie165170175cgcatgaaacgtgcggagacatactgccctaggcctttgetagetcttArgMetLysArgAlaGluThrTyrCysProArgProLeuLeuAlaLeu180比5190576gacaccactcaggaccgccgtaaacagaagateattgcacctgg己aagAspThrThrGinAspArgArgLysGinLyslielieAlaProGlyLys195200205cagatggtgtagGinMetVal210624636〈210〉6<211>211<212>PRT<213>Foot—and—mouthdiseasevirus<400〉6ThrThrThrThr1GlyGluSerAla5AspProValThrThrThrValGlu1015AsnTyrGlyGlyGluThrGinThrAlaArgArgLeuHisThrAspVal202530AlaPheValLeuAspArgPheValLysLeuThrAlaProLysAsnlie354045GinThrLeuAspLeuMetGinlieProSerHisThrLeuValGlyAla505560leuLeuArgSerAlaThrTyrTyrPheSerAspLeuGluValAlalie65707580ValHisThrGlyProlieThrTrpValProAsnGlySerProLysAsp859095AlaLeuAspAsnGinThrAsnProThrAlaTyrGinLysGinProVal100105110ThrArgLeuAlaleuProTyrThrAlaProHisArgValLeuAlaThr115120125ValTyrAsnGlyLysThrThrTyrGlyGluThrThrAlaArgArgGly1^0135140AspThrAlaAlaLeuAlaGinArgLeuSerGlyArgLeuProThrSer145150155160PheAsnTyrGlyAlaValLysAlaGluThrlieThrGluLeuLeulie165170175ArgMetLysArgAlaGluThrTyrCysProArgProLeuLeuAlaLeu180185190AspThrThrGinAspArgArgLysGinLyslielieAlaProGlyLys195200205GinMetVal210權(quán)利要求1、一種制備口蹄疫抗原的方法，包括將口蹄疫不同的基因組合分別克隆到桿狀病毒運載載體中，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移載體；用所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染桿狀病毒進(jìn)行DNA重組，獲得重組桿狀病毒；將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主使其進(jìn)行口蹄疫抗原表達(dá)；收集并純化所表達(dá)的口蹄疫抗原。2、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述口蹄疫不同的基因組合選自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5所示的堿基序列；3、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的桿狀病毒運載載體選自AcRP23-/acZ，AcRP6-SC，AcUWl-/acZ，BacPAK6，BactoPac,Bacmid，BlucBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360，pAc373，pAcAB3、pAcAB4，PAcAS3,pAcC129，pAcC4，DZI，pAcGP67，pAcIEl，pAcJPl，pAcMLF2，pAcMLF7，pAcMLF8，pAcMPl，pAcMP2，pAcRP23，pAcRP25,pAc證4，pAcsMAQpAcUWl，pAcUW21，pAcUW2A，pAcUW2B，pAcUW3，pAcUW31，pAcUW41，pAcUW42，pAcUW43，pAcUW51,pAcVC2，pAcVC3，pAcYMl,pAcJcC5，pBacl，pBac2,pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55，mXIV，pIEINeo，pJVETL,pJVNhel，pJVP10,pJVrsMAQpMBac,pP10，pPAKl,pPBac，pSHONEXU，pSYNXIVVI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391，pVL1392，pVL1393，pVL941，pVL945，pVL985，pVTBac，pBM030，pUAC-5或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體。4、按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述的桿狀病毒運載載體是pVL1393。5、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體是pVL1393(P1-2A3C)、pVL1393(ORF)或pVU393(VP1)。6、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV或TeNPV。7、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的桿狀病毒是家蠶桿狀病毒Bm-NPV-ZJ8。8、按照權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述的重組桿狀病毒選自以下任意-種重組病毒(1)家蠶核型多角體病毒rBmNPV(ORF)，其微生物保藏號足CGMCCNO.1980;(2)家蠶核型多角體病毒rBmNPV(P1-2A3C)，其微生物保藏號是CGMCCNO.1979:(3)家蠶核型多角體病毒rBmNPV(VP1)，其微生物保藏號是CGMCCN0.1975。9、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的昆蟲宿主包括家蠶(Bombyxmori)、野蠶(Bombyxmandarina)、蓖麻蠶(Philosamiacynthiaricim)、樟蠶(Dictyoplocajapanica)、得蠶(Philosamiacynthiapryeri)、作香(Antheraeapernyi)、日本柞蠶(Antheraeayamamai)、野天蠶(Antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺螻(Ectropisobliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜紋夜蛾(Spodopteralittoralis)、秋粘蟲(Spod叩terafrugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)、行軍蟲(Thaumetopoeawilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothisarmigera)、美國棉鈴蟲(Heliothiszea)、煙青蟲(Heliothisassulta)、煙草夜蛾(Heliothisvirescens)、東方粘蟲(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantriadispar)。10、按照權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述的昆蟲宿主是家蠶幼蟲或蛹(Bombyxmori)。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用重組桿狀病毒在昆蟲體內(nèi)表達(dá)口蹄疫抗原的方法，包括將口蹄疫不同的基因組合分別克隆到桿狀病毒運載載體中，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移載體；用所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染桿狀病毒進(jìn)行DNA重組，獲得重組桿狀病毒；將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主使其進(jìn)行口蹄疫抗原表達(dá)；收集并純化所表達(dá)的口蹄疫抗原。本發(fā)明方法采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中安全、高效的生產(chǎn)口蹄疫抗原，所制備的抗原安全性極高，可直接制作疫苗免疫動物。本發(fā)明制備口蹄疫抗原的方法無需投資建廠，無三廢，電力和水資源等能源消耗極少，其生產(chǎn)成本也顯著低于傳統(tǒng)制備口蹄疫抗原的方法，，具有安全、高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點。文檔編號C12N15/866GK101121938SQ20071009003公開日2008年2月13日申請日期2007年3月23日優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日發(fā)明者喜蘭,張志芳,易詠竹,李學(xué)瑞,李寶玉,李志勇,李軼女,彬楊,柳紀(jì)省,殷相平,沈桂芳,白銀梅申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所