專利名稱：一種異源表達和純化人艾滋病病毒輔助受體ccr5的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種表達和純化蛋白的方法，尤其涉及一種異源表達和純化人 艾滋病病毒輔助受體CCR5 (C-C chetnokine receptor type 5)的方法。
背景技術：
艾滋病病毒HIV及其引起的艾滋病(AIDs)嚴重威脅著人類健康，已經(jīng)成 為人類社會面臨的重大災難。目前艾滋病病毒已導致了全球4200萬人的感染， 2800萬人死亡。我國艾滋病感染者累計數(shù)量已近100萬人，即使能有效控制， 我國艾滋病患者2010年也將達到1500萬。因此，艾滋病的預防和治療已成為 全世界共同關注的重大課題。目前，釆用高效抗逆轉(zhuǎn)錄的病毒療法可以極大地 降低體內(nèi)HIV的病毒數(shù)量、延緩病情進展，但存在毒副反應嚴重及病毒變異產(chǎn) 生對治療的抵抗，不能完全控制艾滋病病毒侵染健康細胞，難于從根本上恢復 艾滋病人的正常免疫功能及價格昂貴等問題，迫切需要尋求控制HIV的新途徑， 開發(fā)新的治療藥物和治療方案。近年來，對HIV侵染機制的大量研究發(fā)現(xiàn)，親巨噬細胞型(M-tropic)病 毒抹感染靶細胞時的主要輔助受體CCR5是影響艾滋病病毒侵染過程的一個關鍵 因子(David a/., 2000)。 CCR5是p-趨化因子RANTES、 MIP-1 a和MIP-1 P的受體，具有7個跨膜區(qū)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其主要功能是通過與其相 應的配體結合而誘導炎癥細胞的遷移與聚集。這些P"^化因子與受體CCR5結 合可抑制HIV-1的感染；在侵染過程中，CCR5幾乎被所有的早期HIV-1和相關 的HIV-2及猴免疫缺陷性病毒SIV利用；缺失32對堿基的CCR5等位基因的純 合子突變個體不僅對HIV-1的侵染具有高度的抵抗能力，而且免疫功能正常。由于CCR5是影響艾滋病病毒侵染過程的一個關鍵因子，如果降低它在把細 胞內(nèi)的表達水平或通過趨化因子、趨化因子類似物或某些小分子化合物等與CCR5的竟爭結合，就可以抑制艾滋病病毒與CCR5的結合，從而控制艾滋病病毒 的侵染，達到預防和治療艾滋病的目的。所以，針對艾滋病病毒對細胞的侵染 過程，以CCR5為靶標設計開發(fā)抗艾滋病藥物已成為一個重要的研究熱點。以CCR5 為靶標篩選抗艾滋病藥物已有較多研究，已取得一定進展。趨化因子RANTES、 MIP-la、 MIP-1P能夠抑制HIV-1感染，但是會同時引起炎癥反應，副作用較 大，而且這些天然趨化因子在細胞內(nèi)穩(wěn)定性差、與CCR5的親和力低；針對天然 趨化因子的缺陷，人們篩選出了穩(wěn)定性好、親和力強的趨化因子修飾體，如 AOP-RANTES,但趨化因子修飾體存在潛在的趨化活性、異源蛋白的免疫原性等 問題。此外，以中國倉鼠卯巢法等體系，通過抑制趨化因子RANTES、 MIP-lot等 與CCR5的結合，已篩選了一些與CCR5具有較強親和力的天然或人工合成的小 分子化合物，如從海洋動物海黃瓜提取物中篩選到的兩種新三薛糖苷，及人工 合成的小分子化合物SCH-C (肟哌啶)，其中SCH-C已進入臨床試驗階段。據(jù)報道， 曰本0N0 /^司最近向英國醫(yī)藥/>司GlaxoSmithKline轉(zhuǎn)讓了可抑制艾滋病病毒 與CCR5結合的小分子化合物ONO-4128，英國醫(yī)藥公司GlaxoSmithKline將于近 期進行臨床試驗.雖然以CCR5為靶標篩選抗艾滋病藥物已取得一些進展，并顯示出巨大的應 用前景。但是，由于CCR5屬于膜蛋白，其大量生產(chǎn)、分離純化極其困難，目前 國內(nèi)外尚未見到能成功分離和純化CCR5蛋白質(zhì)的報道。因此，針對以CCR5為 靶標篩選抗艾滋病藥物主要是用中國倉鼠卵巢法等活細胞體系，極大地限制了 篩選效率。鑒于CCR5在艾滋病侵染機制研究和藥物篩選中的重要地位，國內(nèi)外 許多實驗室都正在試圖進行CCR5立體結構的研究，用于定向設計和虛擬篩選 CCR5結合配體。Yang等以膜蛋白一一細菌視紫紅質(zhì)為模板，通過計算機分析， 模擬出了 CCR5的立體結構模型，但其真實性尚有待進一步證實。膜蛋白CCR5的結構、功能研究、以CCR5為靶標的藥物開發(fā)及其抗體的生產(chǎn) 需要毫克數(shù)量級以上的、高度純化的膜蛋白。但是要獲得毫克數(shù)量級以上的、 高度純化的膜蛋白非常困難，主要原因在于(l)天然膜蛋白含量低，絕大多數(shù) 低于微克數(shù)量級；(2)膜蛋白難于體外表達，迄今未見膜蛋白高效表達體系的報 道；(3)膜蛋白不穩(wěn)定，分離、純化過程比較困難。至今，僅幾十種天然含量豐 富或易于生產(chǎn)的膜蛋白獲得了具有原子分辨率的三維結構，僅占所有已經(jīng)解析
出三維結構蛋白質(zhì)的O. 2%。雖然國際上已有少數(shù)天然含量豐富或易于生產(chǎn)的膜 蛋白作為抗原成功地開發(fā)出了抗體，由于缺乏大量高度純化的膜蛋白，目前國 際上銷售的多數(shù)膜蛋白抗體質(zhì)量較差，難于用來進行科學研究。如目前銷售的 艾滋病病毒輔助受體CCR5抗體，是美國ProSci Incorporated公司根據(jù)CCR5蛋 白質(zhì)的序列，利用化學方法合成的N端20個氨基酸殘基通過免疫白兔生產(chǎn)的， 售價每IOO pg高達$225,但質(zhì)量較差，難于檢測靶標CCR5蛋白。因此，目前制 約膜蛋白結構生物學及其功能研究、藥物開發(fā)及膜蛋白抗體生產(chǎn)的主要因素是 膜蛋白的高效表達及分離方法。基于膜蛋白CCR5的重要性，為了獲得毫克數(shù)量級以上CCR5，研究其高效表 達和純化的關鍵技術是該領域的技術發(fā)展趨勢。建立一套全新的、穩(wěn)定的、重 復性好的高效表達和純化膜蛋白CCR5的體系，表達和純化毫克數(shù)量級以上的 CCR5具有非常重要的意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種異源表達和純化人艾滋病病毒輔助受體CCR5的 方法，建立適合于膜蛋白CCR5的表達和純化體系，用于初步表達和純化人艾滋 病病毒輔助受體CCR5蛋白，解決了膜蛋白CCR5結構和功能研究、藥物開發(fā)和 抗體生產(chǎn)中的 一個關鍵制約因素。該方法主要包括以下步驟(1) 構建誘導型GST-CCR5 (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-CCR5)融合蛋白表達載體；(2) GST-CCR5融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)化粟酒酵母，得到粟酒酵母轉(zhuǎn)化子；(3) 篩選和鑒定粟酒酵母轉(zhuǎn)化子；(4) GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的誘導表達；(5) 確證CCR5能在粟酒酵母中獲得表達；(6) 分離和純化GST-CCR5融合蛋白；(7) 檢測分離純化的GST-CCR5融合蛋白；(8) 鑒定分離純化的GST-CCR5融合蛋白； (9)從GST-CCR5融合蛋白中分離和純化人類CCR5蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，在上述步驟(l)中，采用包含大腸桿菌復制起始序 列Co/W，粟酒酵母自主復制序列"W，粟酒酵母啟動子/^"的質(zhì)粒pESP-2， 及采用人類CCR5 cDNA序列全長構建所迷的誘導型GST-CCR5融合蛋白表達載體。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(2)中，釆用醋酸鋰方法，將所述的 GST-CCR5融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)化粟酒酵母細胞。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(3)中，釆用亮氨酸營養(yǎng)缺陷型或PCR擴 增法篩選鑒定所述的粟酒酵母轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(4)中包括采用含有硫胺素的培養(yǎng)基YES、 不含疏胺素的基本培養(yǎng)基E畫培養(yǎng)所述的酵母細胞。根據(jù)啟動子&"表達活性受 培養(yǎng)基中硫胺素含量嚴格調(diào)控的特點，首先采用含有硫胺素的培養(yǎng)基YES培養(yǎng) 所述的酵母細胞，使粟酒酵母轉(zhuǎn)化菌迅速、大量生長，而抑制外源蛋白的表達。 然后收集和充分洗滌酵母細胞去除YES豐富培養(yǎng)基中所含的硫胺素，采用不含 硫胺素的基本培養(yǎng)基E畫培養(yǎng)所述的酵母細胞，從而誘導人類CCR5的異源表達。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述的GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中誘導表達 的條件為于所述的YES培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)到OD600 - 1. 4,于所述的E固培養(yǎng) 基上繼續(xù)誘導培養(yǎng)18小時。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(5)中，采用Northern印跡方法鑒定粟 酒酵母轉(zhuǎn)化子中CCR5基因經(jīng)過誘導后的的表達水平。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(6)中，采用超高速離心和親和層析的方 法分離和純化GST-CCR5融合蛋白，即破碎酵母細胞后，采用離心沉淀法首先去 除細胞碎片，然后通過超高速離心機進行離心，使酵母細胞的細胞膜及其上的 膜蛋白一同沉淀，從而使膜蛋白與其它水溶性蛋白質(zhì)分開。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述的親和層析的方法是谷胱香肽-S-轉(zhuǎn)移酶標簽 親和層析方法。即用含去垢劑的緩沖液從細胞膜中將膜蛋白溶解出來，然后用 GST親和樹脂結合異源表達的GST-CCR5,經(jīng)過多次洗滌GST親和樹脂去除其它 可能附著的酵母細另包膜蛋白，使酵母中異源表達的GST-CCR5得到純化。最后用
還原型谷胱甘肽溶液將純化的異源GST-CCR5從GST親和樹脂上洗脫下來。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(7)中，采用SDS-PAGE電泳檢測分離純 化的GST-CCR5融合蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(8)中，采用蛋白質(zhì)印跡鑒定分離純化的 GST-CCR5融合蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(9)中包括采用凝血蛋白酶切割GST-CCR5 融合蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述步驟(9)中還包括利用谷胱苷肽瓊脂糖吸附 GST及未裂解的GST-CCR5融合蛋白純化外源蛋白CCR5。根據(jù)本發(fā)明的方法，異源表達的人類CCR5蛋白產(chǎn)量為20mg/L。本發(fā)明的優(yōu)點是構建了人類膜蛋白CCR5表達載體，通過粟酒酵母表達體 系，使難于從人體內(nèi)大量分離純化，并且難于通過體外異源表達純化的人類膜 蛋白CCR5,首次在體外大量表達并獲得純化。此外，粟酒酵母表達體系生產(chǎn)出 的蛋白質(zhì)具有翻譯后的修飾作用和生物活性，表達的人類膜蛋白CCR5對于研究 其晶體結構，高通量藥物篩選和抗體生產(chǎn)具有重要的應用價值，解決了抗艾滋 病藥物開發(fā)的瓶頸問題，對人類艾滋病的防治具有重要意義。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳 實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1為誘導型GST-CCR5融合蛋白表達栽體的構建；圖2為粟酒酵母轉(zhuǎn)化子的PCR擴增電泳圖；圖3為粟酒酵母轉(zhuǎn)化子的Northern印跡才全測圖；圖4為GST層析純化GST-CCR5的SDS-PAGE電泳圖；圖5為分離純化GST-CCR5的蛋白質(zhì)印跡圖；圖6為本發(fā)明的步驟示意圖。
具體實施方式
材料1. Taq DM聚合酶、Pr imeSTAR'" HS DM聚合酶(Takara />司產(chǎn)品，中國 大連)2. pMD18-T載體克隆試劑盒(Takara公司產(chǎn)品，中國大連)3. T4 DNA連接酶(Takara公司產(chǎn)品，中國大連)4. 去褲酸化酶CIAP,限制性內(nèi)切酶勘邁^1 (Takara公司產(chǎn)品，中國大連)5. DL2000 plus (北京全世公司產(chǎn)品，中國北京)6. Unstained Protein Molecular Weight Marker ( Fermentas公司產(chǎn)品, 前蘇聯(lián)立陶宛)7. Rediprime IIDNA Labelling system才笨4十標記試劑盒及Hybond N尼龍 膜(Phamarcia公司產(chǎn)品；瑞典)8. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司產(chǎn)品，前蘇耳關立陶宛)9. RNAultra總RNA提取試劑盒(天為時代公司產(chǎn)品，中國北京)10. DM產(chǎn)物純化試劑盒、離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天為 時代Z^司產(chǎn)品，中國北京)11. 凝血酶Thrombin (Sigma公司產(chǎn)品，美國)12. GSTrap FF柱(GE/^司產(chǎn)品，美國)13. 粟酒酵母菌SP-Q01 ( Invitrogen公司產(chǎn)品，美國)14. 質(zhì)粒載體pESP-2 ( Invitrogen/^司產(chǎn)品，美國)15. 大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(Takara公司產(chǎn)品，中國大連) 注以下所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品。16. LB培養(yǎng)基 酵母提取物 5g
胰蛋白胨 10g NaCl 10g 固體培養(yǎng)基加入2 % (w/v)瓊脂粉溶于1000ml去離子水中，并用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0，高壓蒸汽 滅菌。17. YPD培養(yǎng)基 酵母提取物 10g 蛋白胨 20g 葡萄糖 20g 固體培養(yǎng)基加入2 % (w/v)瓊脂粉 溶于1000ml去離子水中，高壓蒸汽滅菌。18. YES培養(yǎng)基 5 g酵母提取物； 30 g葡萄糖； 225 mg腺嘌呤； 225 mg L-組氨酸； 225 mg L-亮氨酸； 225 mg尿嘧咬； 225 mg L-賴氨酸.溶于1000ml去離子水中，高壓蒸汽滅菌。19. E畫培養(yǎng)基3 g 鄰苯二曱酸氬鐘(potassium hydrogen phthalate) (14. 7raM); 2. 2 gNa2HP04(15. 5mM); 5 g NH4C1 (93. 5mM); 20 g 葡萄糖(2。/。w/v); 20 ml 50 x鹽組分；1 ml 維生素組分；0. 1 ml孩史量元素組分。溶于lOOOml去離子水中，高壓蒸汽滅菌。其中，50x鹽組分配方(每升) 52. 5 g MgCl2. 6H2O(0. 26M); 0. 735 g CaCl2.2H20(4. 99mM); 50 g KC1 (0. 67M);2 g Na2S04(14. lmM)。 維生素組分配方(每升)1 g泛酸(4. 20 mM); 10 g煙酸(81. 2 mM); 10 g肌醇(55. 5 mM);10 mg生物素(40. 8 juM)。 微量元素組分配方(每升) 5 g硼酸(80. 9 mM); 4 g MnS04(23. 7 mM); 4 g ZnS04. 7H20(13. 9 mM);2 g FeCl3. 6H20(7. 4 mM); 0. 4 g鉬酸銨(2. 47 mM); 1 g KI(6. 02 mM);0. 4 g CuSO" 5H20(1. 6 mM); 10 g檸檬酸(47. 6 mM)實施例1 人類CCR5 cDNA的克隆利用RMultra總RM提取試劑盒從健康人外周血單核細胞(PBMC)中提取 總RNA,根據(jù)RevertAid"1 First Strand cDNA Synthesis Kit操作說明合成cDNA 第一鏈。根據(jù)Gen bank中CCR5 cDNA序列設計PCR引物C1和C2，這兩條引物的5 '端分別有保護4tt和勘虛I酶切位點，上游引物C1/下游引物C2分別為SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7 。PCR的反應體系為100ul，其中含引物Cl和C2各20prao1, 200 jumol的譜P, 4 ul cDNA第一鏈合成反應液，5 x PrimeSTAR'"反應緩沖液20ul ,高保真的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶5U。 PCR的反應條件為第一階段95。C預變性5分鐘； 第二階段94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸l分鐘，循環(huán)35次；第三階段 72 °C延伸5分鐘。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1 °/。瓊脂糖電泳檢測可見約100Obp大小電泳帶， 將PCR產(chǎn)物回收、純化后加入dATP, Taq DNA聚合酶，10xPCR反應緩沖液，72°C 反應30分鐘，DNA純化試劑盒過柱純化PCR產(chǎn)物，取適量純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接。連接產(chǎn)物通過CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)氨千青 霉素和藍白篩選后，挑取LB平板上的白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中37。C振蕩過夜， 次日提取質(zhì)粒DNA，用fe/sH I進行酶切鑒定，對于有1000bp大小DNA片段出現(xiàn)的 重組質(zhì)粒進行測序，測序結果表明陽性重組質(zhì)粒多克隆位點中插入的DNA片段即 是完整的人類CCR5 cDNA (SEQ ID NO: 5)，該重組質(zhì)粒命名為pMD18- CCR5。實施例2 誘導型GST-CCR5融合蛋白表達載體的構建采用包含大腸桿菌復制起始序列Co/W(SEQ ID NO: 1)、粟酒酵母自主復 制序列arW (SEQ ID NO: 2)、粟酒酵母中嚴格受硫胺素濃度調(diào)控的啟動子尸一 全長序列(SEQ ID NO: 3)、 GST全長序列(SEQ ID NO: 4)以及具有Thrombin 識別位點的質(zhì)粒pESP-2和重組質(zhì)粒PMD18- CCR5，構建誘導型GST-CCR5融合蛋 白表達載體。具體構建過程如下(圖1):勘yzfl I酶切質(zhì)粒PMD18- CCR5，回收純化CCR5 cDNA片^爻，同時利用5a/aH I 酶切質(zhì)粒pESP-2并進行去磷酸化處理，將CCR5 cDNA片段與去磷酸化處理后的質(zhì)
粒pESP-2連接，連接產(chǎn)物通過CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)氨 芐青霉素篩選后，糸沐LB平板上的轉(zhuǎn)化菌進行PCR篩選，PCR引物為C1和C2， PCR 的反應體系為25ul，其中含引物Cl和C2各10pmo1, 200 pmol的dNTP, 1 ul菌液, 10xPCR反應緩沖液2. 5ul， Taq DM聚合酶1U。 PCR的反應條件同以上實施例l。 挑取能夠PCR擴增出約lOOObp的菌落進行測序。測序結果表明陽性重組質(zhì)粒中插 入了CCR5 cDNA片段并且方向正確，該重組質(zhì)粒命名為pESP- CCR5。實施例3誘導型GST-CCR5融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)化粟酒酵母挑選1個粟酒酵母SP-Q01單菌落，接入到10 ml培養(yǎng)基YPD中，在28°C 搖床中以180—200 rpm的轉(zhuǎn)速過夜培養(yǎng)。取1. 5 ml過夜培養(yǎng)液加入到50 ml新 鮮培養(yǎng)基YPD，在28。C搖床中以180_200 rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)至OD6。。=0. 5左右(約5 個小時)，在室溫下用50 ml的離心管以3000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除上 清，收集酵母細胞沉淀，細胞沉淀懸浮于6 ml 1 x TE中，然后在室溫下以3000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除上清，細胞沉淀最后懸浮于0.5-1.0 ml TE/LiAC(0. 1M LiAC, 1 x TE)中，制備成酵母感受態(tài)細胞。取100 jul酵母感受 態(tài)細胞用于表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。取5pl含CCR5基因的粟酒酵母表達載體質(zhì)粒DNA和10ial濃度為10jag/ p 1的鮭魚精DNA (鮭魚精DNA先煮沸2分鐘，然后在冰上迅速冷卻)，加入到上 述制備的100yl感受態(tài)細胞中，充分混勻，然后加入600ial PEG/LiAC/TE緩 沖液(8 ml 50% PEG4000，1 ml 1M LiAC, 1 ml lOxTE )，并經(jīng)過窩旋充分混勻， 將混勻的酵母感受態(tài)細胞放置在30。C的搖床上以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30一50 分鐘。然后再向酵母感受態(tài)細月包中加入70y 1 DMSO并輕輕顛倒充分混勻(禁止 窩旋)，將混勻后的酵母細胞放置在42。C水浴鍋中水浴培養(yǎng)15分鐘，接著將酵 母細胞〃故置在冰上冷卻2分鐘。然后以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心5—10秒，去除上 清液，用"0 iu 1的1 x TE重懸酵母細胞沉淀，接著以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心5一10 秒，用150 jLi 1的1 x TE重懸沉淀酵母細胞，從其中取50 m 1酵母細胞鋪EMM培 養(yǎng)基+25)iM硫胺素的平板。用石蠟封口膜密封平板，倒置在28。C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)3一4天，平板上生長出的酵母單菌落即為含CCR5基因表達載體的酵母轉(zhuǎn)化子 SP-CCR5。
實施例4 粟酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定1) 亮氨酸營養(yǎng)缺陷型篩選用CCR5表達栽體轉(zhuǎn)化粟酒酵母感受態(tài)細胞后，將50-100 m 1酵母轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 均勻涂在含1. 2%瓊脂的培養(yǎng)基EMM+ 25pM硫胺素平板上，用石蠟封口膜密封平 板，于28。C培養(yǎng)3-4天。由于表達載體pESP-CCR5上含有LEU2-d基因，可以互 補SP-Q01菌抹中亮氨酸營養(yǎng)缺陷，包含有表達載體pESP-CCR5的粟酒酵母菌才 能在E固培養(yǎng)基上生長。2) PCR擴增法鑒定粟酒酵母轉(zhuǎn)化子在平板上出現(xiàn)酵母轉(zhuǎn)化子SP-CCR5后，用接種針挑選單克隆在含1. 2%瓊脂 的培養(yǎng)基E醒+25^M硫胺素平板上進行劃線培養(yǎng)，同時利用粟酒酵母表達載體 上的特異性引物YF和YR (SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9)進4亍PCR鑒定，鑒 定結果如圖2所示，其中分子量標記物是DL2000 plus (分子量從大到小為 5000bp, 3000bp， 2000 bp, 1000 bp, 750 bp),從圖2中可以看出，擴增鑒定 得到的片段分子量與異源CCR5基因片段分子量基本相同，酵母轉(zhuǎn)化子中含有異 源CCR5基因，證明CCR5表達載體成功轉(zhuǎn)化至粟酒酵母細胞中。實施例5 GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的^i秀導表達將經(jīng)過劃線培養(yǎng)鑒定出的轉(zhuǎn)化子接種到10ml液體培養(yǎng)基YES中，28°C, 200rpm振蕩培養(yǎng)16小時。取3ml過夜培養(yǎng)的液體培養(yǎng)物接種至100ml新鮮的液 體培養(yǎng)基YES中，281C, 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD60(H1.4 (約7小時)，用無菌的 離心管以5000rpm的轉(zhuǎn)速在室溫下離心5分鐘，收集酵母培養(yǎng)物，用50ral無菌 水重懸細胞，以5000rpm的轉(zhuǎn)速在室溫下離心5分鐘，去上清液，加入50ml無 菌水再次重懸細胞，以5000rpm的轉(zhuǎn)速在室溫下離心5分4f ，去上清液。用200ml 無菌的液體培養(yǎng)基E固重懸沉淀的細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌的1000ml三 角瓶中，28°C，以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)16小時。由于培養(yǎng)基E畫中不含硫 胺素，從而解除了硫胺素對啟動子尸皿"的阻遏作用，使得由啟動子戶^驅(qū)動的 GST-CCR5融合蛋白獲得誘導表達。取10ml誘導培養(yǎng)液提取總RNA,采CCR5的 部分cDNA序列為探針，利用Northern印跡檢測轉(zhuǎn)化子SP-CCR5中CCR5基因經(jīng) 過誘導后的轉(zhuǎn)錄水平，Northern印跡結果如圖3所示，從圖3可以看出，經(jīng)過
誘導后，異源CCR5基因在酵母轉(zhuǎn)化子SP-CCR5中獲得了高效率的轉(zhuǎn)錄。 實施例6 酵母異源表達的GST-CCR5分離和純化體系的建立本發(fā)明采用超高速離心和親和層析的方法建立粟酒酵母異源表達的 GST-CCR5分離和純化體系，具體如下將經(jīng)過誘導表達的粟酒酵母轉(zhuǎn)化子SP-CCR5培養(yǎng)物以5000rpm的轉(zhuǎn)速在4 。C下進行離心收集，去上清液后，細胞沉淀用無菌水重懸洗滌2次。以5000rpm 的轉(zhuǎn)速在4。C下進行離心，去上清液后，細胞沉淀用50ml細胞裂解液重懸(細胞 裂解液組成如下50mMTris-Cl， pH7. 4; 5 mM EDTA; 300 mMNaCl; 0. 5% IGEPAL; 100 mM NaF; 1 mM EGTA; 1 mM Na3V4)，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(NS1001L Panda2K)的上樣杯中，在1300Mpa下循環(huán)3次，進行細胞^皮碎(50ml細胞懸液約 破碎5分鐘)，于冰上收集細胞勻漿液。4°C, 10000rpm離心20分鐘，棄沉淀， 取上清液，4°C， 45， OOOrpm超高速離心1. 5小時，使酵母細胞的細胞膜及膜上 的膜蛋白 一同沉淀從而使膜蛋白與其它水溶性蛋白質(zhì)分開，小心去除上清液(內(nèi) 含細胞中水溶性蛋白質(zhì))，收集沉淀。然后用5ml含1°/。 triton X-100的細胞裂 解液溶解沉淀，將膜蛋白從細胞膜中溶解出來，然后于4。C， 45, 000rpm超高速 離心30分鐘，取上清液，用GST親和樹脂預裝柱(GSTrap FF)進行親和層析， 純化異源表達的融合蛋白(GST-CCR5蛋白)。GSTrap FF親和層沖斤過程如下1. 將GSTrap FF柱安裝到Bio-Rad的Biologic LP層析系統(tǒng)上；2. 用3倍樣品體積的PBS緩沖液(140 mM NaCl， 2. 7 mM KC1, 10 mM Na2HP04， 1.8 mM KH2P04, pH 7. 3)以1.0 ml/分鐘的流速進行平衡GSTrap FF柱；3. 以0. 2 ml/分鐘的流速進行上樣；4. 用3倍樣品體積的PBS緩沖液，以1. 0 ml/分鐘的流速洗滌GSTrap FF柱， 去除其它可能附著的酵母細胞膜蛋白，使在酵母中異源表達的GST-CCR5蛋白得 到純化；5. 用2倍樣品體積的洗脫緩沖液(50 mM Tris-HCl， 10 mM還原型谷胱甘肽， pH 8. 0)以0. 2 ml/分鐘的流速，將純化的異源GST-CCR5蛋白從GST親和樹脂上 洗脫下來，同時收集洗脫成分；6.將收集到的異源表達GST-CCR5蛋白溶液進行低溫抽真空濃縮，將濃縮的 膜蛋白用于SDS-PAGE檢測和-80。C低溫保存。實施例7 SDS-PAGE電泳檢測分離純化的GST-CCR5蛋白將濃縮的GST-CCR5蛋白溶于400jul含iy。 triton X-100的PBS緩沖液中， 取30 nil蛋白溶液，加入30|al的2x蛋白質(zhì)上樣緩沖液(3. 55 ml去離子水， 1.25 ml 0. 5 M Tris-HC1， pH 6. 8， 2.5 ml甘油，2.0 ml 10% (w/v) SDS, 0.2 ml 0.5% (w/v)溴酚藍，0. 5ml巰基乙醇)，用12%的SDS-PAGE進行電泳，然后 用考馬斯亮藍R-250染色液(50'/ 甲醇，10%乙酸，0. 05。/。考馬斯亮藍R-250 )進 行染色。經(jīng)過脫色后，融合蛋白電泳分離結果如圖4,其中分子量標記物是 Unstained Protein Molecular Weight Marker (分子量從大到小為116. OkDa， 66. 2 kDa, 45. 0 kDa， 35. 0 kDa， 25. 0 kDa, 18. 4 kDa, 14. 4 kDa )。從圖4可 以看出，經(jīng)過GST親和層析純化的GST-CCR5蛋白只有一條單一的條帶，其分子 量大小與理論值相符。實施例8 蛋白質(zhì)印跡鑒定分離純化的GST-CCR5蛋白分離純化的GST-CCR5蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，通過電轉(zhuǎn)移將PAGE膠上 的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。尼龍膜用高濃度蛋白質(zhì)進行封閉，然后用GST抗體 進行結合反應，用洗液漂洗尼龍膜，加顯色試劑進行顯色。蛋白質(zhì)印跡結果如 圖5所示。從蛋白質(zhì)印跡結果可以看出，純化出的蛋白質(zhì)為含GST的CCR5蛋白。實施例9 人類膜蛋白CCR5從GST-CCR5融合蛋白中的分離和純化根據(jù)分離純化出來的GST-CCR5融合蛋白具有Thrombin識別位點的特點，在 已純化的融合蛋白溶液中加入1/500 1/1 OO凝血蛋白酶(Thrombin)，于25。C 下溫育l h,切割釋放出GST成分，酶切反應液再流經(jīng)GSTrap FF柱，利用柱中谷 胱苷肽瓊脂糖的吸附作用，吸附掉GST及未裂解的融合蛋白，純化出異源表達蛋 白CCR5。根據(jù)本發(fā)明的方法，異源表達CCR5蛋白產(chǎn)量為20mg/L。 本發(fā)明提供的上述在粟酒酵母中進行異源表達和純化膜蛋白一一艾滋病病
毒輔助受體CCR5的方法步驟示意圖如圖6所示，本發(fā)明的實驗結果表明，通過 將CCR5基因連接到酵母中嚴格受硫胺素濃度調(diào)控的啟動子^"及GST后，構建 GST-CCR5融合蛋白表達載體，將該表達載體轉(zhuǎn)化到粟酒酵母感受態(tài)細胞中后， 異源融合蛋白GST-CCR5在酵母中獲得了表達。采用超高速離心和親和層析等方 法，使在酵母中獲得異源表達的CCR5蛋白質(zhì)得到了分離和純化。雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所 屬技術領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當可作些許的更動 與改進，因此本發(fā)明的保護范圍當視權利要求所界定者為準。
序列表<110>重慶大學<120> —種異源表達和純化人艾滋病病毒輔助受體CCR5的方法<130><160〉 9<170> Patentln version 3.2<210〉 1<211> 668<212> DNA<213>大腸桿菌復制起始序列ColEl的核苷酸序列<400> 1gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 60 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggttte gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctca 668<210> 2<211> 1206<212> DNA<213>粟酒酵母自主復制序列arsl的核苷酸序列<400> 2gaattcgagt ctaactcctt aaccactcgg acatagtgac ttatctgaca ctcattgtaa 60 attaatatat atataggcat tttgtttagt taaaggtact taagtaatta gtataaacga 120 accaatttta taatcaggaa gttaagtgaa tggtagcaca tgtcgtaaaa attgtgaatt 180 tttattgaat aatattttaa atacaagcct ttctagacta ggtatactca taaacatata 240 tgagcaaaag gatagaggag attacattgc atcttctaca aatttattta ttgcccttta 300 ctgaaaaatt aaataatgag tactaaatga taaaaagcgc tcagtacaag aaagattgca 360 aaaatattgc attcttcatg aattaaagtt gcatataagg catattgaaa gtaatagtac 420 taaaacagea gttagcgaaa attaatagaa ttatattcgc aagacaattg tgacattaaa 480 ttaaaaaatt gtagaatttt tactatcctc tttaacgcca tgagccttta taaaaaggtt 540 aaattagttt taacattctt tttttgagta agagtttaca atttatcaaa acctgtgtta 600 ttatattcat tagtttcaat ttattagcat ctagagaaaa atcaattggc agttacattg 660 ttggaattta tgaagaaaaa gaatctacaa cggagaataa gttgctgatc gctttcccta 720 aaattgtata ttttgctgag cttattttga catttcgttg aagttttctc taattcgcat 780 tcattttaag taaaacaatg agaaataaaa ttacaaaaaa tacaaattaa aatacaattt 840 ttagctataa ttatagacga tgcccttgta tcccattctg tctcgcttgc ccctactttt 900 tatcttttat ataccataat gaacgctgcc gctactaacc ataccccgat tttacatttc 960 ggactcccaa ggacgtacaa aatagaaaac tatagaaaaa aataatcaga aaatagcatg 1020
tcatctcttt gtaaaacgcg tttgcaagaa gaaaggaaac aatggagaag agatcatcca 1080tttgtatgta aattttagta aacttgaaga aatcactaac aacttctctt acttagggat1140tctatgcaaa accttgtaaa tcatctgatg gaggactcga tttaatgaat tggaaggttg 1200gaattc 1206<210> 3<211〉 174<212> DNA<213〉粟酒酵母啟動子Pnmtl的核苷酸序列<400> 3agaggatcag aaaattatcg ccataaaaga cagaataagt catcagcggt tgtttcattt 60 cctatatttt ttttttattt ttttattttt taataaggga aaatttaacg tctaaggata 120 cagaagattg ttagcacatt aaagtaataa aggcttaagt agtaagtgcc ttagcatgtt 180 attgtatttc aaaggacata atctaaaata ataacaatat catttctcac aagttattca 240 attttctttt ttttttctaa taatatcaag aatgtattat ttgtttgaca taagtcaact 300 aatttattta atatgctgga ttaatcttgc agacatgtaa attaacaagt tttagteaaa 360 taacgttgaa gtttcaatga actcaaataa tttctctttt tttttatata accataatct 420 gatttatatt ttccgcagga tcaactgaag ttatgacatt tggattggat cacttataac 480 cttggtcgcc aaataataca aaaatcagcg ttataaaaca aagaaggttt ttgttaagaa 540 attaatcctc tttcttgata agaaagttga accgaaattg cagatactga tatatgaaaa 600 taatacccac aattttggga atagcgcaag cctcaattta aacaataggt gaggacacat 660 gataatgacc teaatgattg ttagaagaaa agagcctcat tacaaaatcg aaaaatgaat 720 ggttgggtac aagtttccaa aacatggtaa agtggacttt gcgtatgaga cgtaaataga 780 aaaaaacact tgttatatgt tttctagaat tattgttgtc tctttatggt tggatgatgc 840 aaaatagtaa tttcggttag ttgctgtaaa acaccacgag acaaatagat atggatattt 900 attaaatcag gaaaaacgta actctcggct actggatggt tcagtcaccc aacgattact 960 ggggagagaa aacagggcaa aagcaaagct taaaggaatc cgattgtcat tcggcaatgt 1020 gcagcgaaac taaaaaccgg ataatggacc tgttaatcga aacattgaag atatataaag 1080 gaagaggaat cctggcatat catcaattga ataagttgaa ttaattattt caatctcatt1140 ctcactttct gacttatagt cgctttgtta aatc 1174<210> 4<211> 651<212〉 DNA<213〉全長GST(谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶)基因cDNA的核苷酸序列<400> 4atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300gatattagat acggtgttto gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc a 651<210> 5<211> 1059 <212> DNA<213>人艾滋病病毒輔助受體CCR5基因cDNA的核苷酸序列 <400> 5atggattatc aagtgtcaag tccaatctat gacatcaatt attatacate ggagccctgc 60caaaaaatca atgtgaagca aatcgcagcc cgcctcctgc ctccgctcta ctcactggtg 120ttcatctttg gttttgtggg caacatgctg gtcatectca tcctgataaa ctgcaaaagg 180ctgaagagca tgactgacat ctacctgctc aacctggcca tctctgacct gtttttcctt 240cttactgtcc ccttctgggc tcactatgct gccgcccagt gggactttgg aaatacaatg 300 tgtcaactct tgacagggct ctattttata ggcttcttct ctggaatctt cttcatcatc 360ctcctgacaa tcgataggta cctggctgtc gtccatgctg tgtttgcttt aaaagccagg 420acggtcacct ttggggtggt gacaagtgtg atcacttggg tggtggctgt gtttgcgtct 480ctcccaggaa teatctttac cagatctcaa aaagaaggtc ttcattacac ctgcagctct 540cattttccat acagtcagta tcaattctgg aagaatttcc agacattaaa gatagtcatc 600ttggggctgg tcctgccgct gcttgtcatg gtcatctgct actcgggaat cctaaaaact 660ctgcttcggt gtcgaaatga gaagaagagg cacagggctg tgaggcttat cttcaccatc 720 atgattgttt attttctctt ctgggctccc tacaacattg tccttctcct gaacaccttc 780caggaattct ttggcctgaa taattgcagt agctctaaca ggttggacca agctatgcag 840gtgacagaga ctcttgggat gacgcactgc tgcatcaacc ccatcatcta tgcctttgtc 900ggggagaagt tcagaaacta cctcttagtc ttcttccaaa ageacattgc caaacgcttc 960tgcaaatgct gttctatttt ccagcaagag gctcccgagc gagcaagctc agtttacacc 1020cgatccactg gggagcagga aatatctgtg ggcttgtga 1059<210> 6 <211> 30 <212> DNA<213>根據(jù)人艾滋病病毒輔助受體CCR5基因cDNA設計合成的上游引物序列 <400> 6gcgaagctta tggattatca agtgtcaagt 30<210> 7<211> 33<212> DNA<213>根據(jù)人艾滋病病毒輔助受體CCR5基因cDNA設計合成的下游引物序列<400> 7gcgaagcttt cacaagccca cagatatttc ctg 33<210> 8<211> 27<212> DNA<213>根據(jù)粟酒酵母表達載體多克隆位點兩端的核苷酸序列設計合成的上游引物序列<400> 8gtacttgaaa tccagcaagt atatagc 27<210> 9<211> 33
<212> DNA<213>根據(jù)粟酒酵母表達載體多克隆位點兩端的核苷酸序列設計合成的下游引物序列 <400> 9caaaatcgta atatgcagct tgaatgggct tcc 3權利要求
1、一種異源表達和純化人艾滋病病毒輔助受體CCR5的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)構建誘導型GST-CCR5融合蛋白表達載體；(2)將GST-CCR5融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)化粟酒酵母，篩選和鑒定粟酒酵母轉(zhuǎn)化子；(3)GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的誘導表達；(4)確證CCR5基因在粟酒酵母中得到表達；(5)分離和純化GST-CCR5融合蛋白；(6)檢測分離純化的GST-CCR5融合蛋白；(7)鑒定分離純化的GST-CCR5融合蛋白；(8)人類CCR5蛋白從GST-CCR5融合蛋白中的分離和純化。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(l)中，采用包含大 腸桿菌復制起始序列tWW,粟酒酵母自主復制序列arW,粟酒酵母啟動子^^ 的質(zhì)粒pESP-2,及采用人類CCR5 cDM序列全長構建誘導型谷胱香肽-S-轉(zhuǎn)移酶 -CCR5融合蛋白表達載體。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(2)中，采用醋酸鋰 方法，將構建的表達載體轉(zhuǎn)化到粟酒酵母細胞中，然后利用亮氨酸營養(yǎng)缺陷型 篩選和PCR擴增法鑒定栗酒酵母轉(zhuǎn)化子。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(3)中，先釆用含有 疏胺素的培養(yǎng)基YES使粟酒酵母轉(zhuǎn)化菌迅速、大量生長，而抑制外源蛋白的表 達，然后在不含硫胺素的基本培養(yǎng)基E醒上培養(yǎng)酵母細胞，從而誘導人類CCR5 的異源表達，根據(jù)誘導條件的優(yōu)化，獲得了人類CCR5在粟酒酵母中誘導表達的 較佳條件為YES培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)到OD600 = 1. 4,然后于E畫培養(yǎng)基上誘導 培養(yǎng)18小時。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(4)中，采用Northern 印跡方法鑒定粟酒酵母轉(zhuǎn)化子中CCR5基因經(jīng)過誘導后的的表達水平。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(5)中，采用超高速 離心和谷胱苦肽-S-轉(zhuǎn)移酶標簽親和層析的方法分離和純化GST-CCR5融合蛋白。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(6)中，采用SDS-PAGE 電泳檢測分離純化的GST-CCR5融合蛋白。
8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(7)中，采用蛋白質(zhì) 印跡鑒定分離純化的GST-CCR5融合蛋白。
9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于上述步驟(8)中，釆用Thrombin 切割GST-CCR5融合蛋白釋放出GST,然后利用谷胱苦肽瓊脂糖吸附掉GST及未 裂解的融合蛋白，純化外源蛋白CCR5。
10. 根據(jù)權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于異源表達CCR5蛋白 產(chǎn)量為20mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種異源表達和純化人艾滋病病毒輔助受體CCR5的方法，該方法主要包括步驟構建誘導型GST-CCR5融合蛋白表達載體并轉(zhuǎn)化粟酒酵母；鑒定粟酒酵母轉(zhuǎn)化子；GST-CCR5融合蛋白在粟酒酵母中的誘導表達；確認CCR5基因在粟酒酵母中得到表達；分離和純化GST-CCR5融合蛋白；檢測分離純化的GST-CCR5融合蛋白；鑒定分離純化的GST-CCR5融合蛋白；從GST-CCR5融合蛋白中的分離和純化人類CCR5蛋白。本發(fā)明的方法可以應用于在粟酒酵母中表達高等動植物的膜蛋白，并且獲得的蛋白質(zhì)具有翻譯后的修飾作用和生物活性。表達的膜蛋白對于研究其晶體結構和高通量藥物篩選有應用價值。
文檔編號C12N15/09GK101148662SQ20071009267
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月6日 優(yōu)先權日2007年9月6日
發(fā)明者楊妤欣, 宇 潘, 胡宗利, 胡廷章, 陳國平, 陳緒清 申請人:重慶大學