專利名稱：BCR/ABL融合基因mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及BCR/ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA自身淬滅探針熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，為一種通過(guò)對(duì)臨床骨髓提取總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可以準(zhǔn)確定量待檢標(biāo)本中BCR/ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA表達(dá)量的試劑盒，為慢性粒細(xì)胞白血病的診斷、療效觀察、預(yù)后判斷提供依據(jù)。

背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種起源于骨髓多能造血干細(xì)胞異?？寺〉膼盒匝翰　Ｋ哂刑卣餍缘馁M(fèi)城染色體(Ph′)，其典型的核型是t(9；22)(q34；q11)，該染色體易位導(dǎo)致兩個(gè)正常基因BCR和ABL融合形成腫瘤性BCR/ABL融合基因，是CML發(fā)生的直接病因。由于基因斷裂點(diǎn)位置的不同，95％的費(fèi)城染色體陽(yáng)性的CML病人其BCR/ABL融合基因可為b2a2或b3a2型，其中大部分為b3a2型，但二者編碼的融合蛋白分子量均為210KD。因此，BCR/ABL融合基因及其編碼的蛋白是CML特異的腫瘤分子標(biāo)志。由于幾乎所有CML患者都能查出BCR/ABL融合基因，檢測(cè)BCR/ABL融合基因能夠明確CML的診斷，BCR/ABL融合基因表達(dá)水平還與CML急變有關(guān)，CML患者從慢性期發(fā)展到急變期，往往伴隨著BCR/ABL表達(dá)水平明顯升高。同時(shí)結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)，BCR/ABL融合基因檢測(cè)有助于初診時(shí)的CML急變與急性髓細(xì)胞白血病(AML)M2的鑒別和CML與慢性粒單細(xì)胞白血病(CMML)的鑒別。另外，BCR/ABL融合基因的陰轉(zhuǎn)已成為CML療效和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，有研究表明，CML治療到細(xì)胞遺傳學(xué)完全緩解后，其BCR/ABL表達(dá)水平常明顯降低，復(fù)發(fā)率仍然高達(dá)15％～60％，主要原因就在于體內(nèi)存在微量殘留白血病，而且BCR/ABL表達(dá)水平的改變可發(fā)生于細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變之前，用PCR方法檢測(cè)已能提前半年發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)。因此，骨髓中BCR/ABL mRNA的檢測(cè)對(duì)于CML診斷、療效觀察、預(yù)后判斷、指導(dǎo)用藥及微量殘留白血病的動(dòng)態(tài)觀察等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
正因?yàn)镃ML有如此明確特異的致病基因，臨床上對(duì)該病的檢驗(yàn)常采用的細(xì)胞學(xué)方法、遺傳學(xué)方法、熒光原位雜交(FISH)、常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄PCR等主要就是針對(duì)費(fèi)城染色體和BCR/ABL融合基因而進(jìn)行的。其中前三種方法只能定性檢測(cè)，目前，臨床通常采用常規(guī)半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)BCR/ABL mRNA。但是常規(guī)半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR在PCR的指數(shù)期和平臺(tái)期產(chǎn)量相差極大，很難準(zhǔn)確定量，并且PCR反應(yīng)后要開蓋進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，常存在污染和非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性，另外還存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、勞動(dòng)強(qiáng)度大、重復(fù)性差、定量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等諸多缺點(diǎn)。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR技術(shù)，從常規(guī)PCR定性檢測(cè)邁上了可以量化的臺(tái)階。熒光定量PCR技術(shù)主要利用待測(cè)模板起始濃度的對(duì)數(shù)與各模板的CT值(CT值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。即將熒光技術(shù)(熒光染料或熒光標(biāo)記的探針)應(yīng)用于PCR。在PCR的每一次循環(huán)中，都可觀察到熒光強(qiáng)度的變化，這種變化對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。熒光定量PCR技術(shù)更先進(jìn)，操作更便捷，避免常規(guī)PCR反應(yīng)后檢測(cè)的煩瑣步驟，并能達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、絕對(duì)定量的目的。
熒光定量PCR技術(shù)有很多種，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BCR/ABL轉(zhuǎn)錄本載量，但都借用Roche公司基于Taqman探針技術(shù)開發(fā)的試劑，沒(méi)有成熟試劑盒。國(guó)內(nèi)商品化熒光定量PCR試劑盒也多采用Taqman探針技術(shù)開發(fā)，但是該技術(shù)除了擴(kuò)增引物以外還需要單獨(dú)合成1～2條熒光探針，并且要分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，探針在結(jié)合過(guò)程中會(huì)影響PCR擴(kuò)增，影響PCR體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，而且探針合成以及探針雙標(biāo)記價(jià)格昂貴，給病人帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)壓力。因此如何優(yōu)化PCR擴(kuò)增，并且降低成本，滿足廣大病員的需要，是目前亟待解決的重要問(wèn)題。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本低廉的BCR/ABL融合基因mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，以準(zhǔn)確、靈敏、快速檢測(cè)BCR/ABL融合基因mRNA。
本發(fā)明所述BCR/ABL融合基因mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包含淋巴細(xì)胞分離液、RNA提取液A、RNA提取液B、Oligo(dT)12-18、RT反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、DEPC水，定量PCR反應(yīng)液中含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和無(wú)菌去離子水，定量PCR反應(yīng)液中還含有標(biāo)記引物和未標(biāo)記引物，標(biāo)記引物序列為5′-CGGAACAGACTGTCCACAGCATTCcG-3′，3′端第二個(gè)堿基c標(biāo)記熒光物質(zhì)FAM，5′端的CGGAA可以與3′端最后5個(gè)堿基TTCCG形成自身配對(duì)，未標(biāo)記引物序列為5′-TTTGGGCTTCACACCATTCC-3′；標(biāo)準(zhǔn)品核苷酸序列為 1 gactgttgac tggcgtgatg tagttgcttg ggacccagcc ttggccattt ttggtttggg 61 cttcacacca ttccccattg tgattatagc ctaagacccg gagcttttca cctttagtta 121 tgcttagagt gttatctcca ctggccacaa aatcatacag tgcaacgaaa aggttggggt 181 cattttcact gggtccagcg agaaggtttt ccttggagtt ccaacgagcg gcttcactca 241 gaccctgagg ctcaaagtca gatgctactg gccgctgaag ggcttttgaa ctctgcttaa 301 atccagtggc tgagtggacg atgacattca gaaacccata gagccccgga gactcatcat 361 cttccttatt gatggtcagc ggaatgctgt ggacagtctg gagtttcaca cacgagttgg 421 tca 所述的標(biāo)準(zhǔn)品為含有插入BCR/ABL融合基因特異性保守序列的pMD 18-TVector，該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。對(duì)照品中的陰性對(duì)照品為正常人骨髓細(xì)胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對(duì)照品中的陽(yáng)性對(duì)照品為P210bcr/abl cDNA樣品。
RNA提取液A為Trizol。
RNA提取液B為DEPC水配制的65～80％乙醇。
RT反應(yīng)液中含有RT緩沖液、RNasin、dNTPs、DEPC水。
逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV。
定量PCR反應(yīng)液還含有Taq DNA聚合酶。
本試劑盒中淋巴細(xì)胞分離液保存于室溫(22～25℃)，其它試劑保存于-20℃，盡量避免反復(fù)凍融。
本發(fā)明采用的自身淬滅探針熒光定量PCR技術(shù)，在保證高靈敏度和高特異性的前提下，能夠極大的降低成本(僅為Taqman探針技術(shù)的50％)。該技術(shù)只需要一對(duì)擴(kuò)增引物，引物中的某一條3′端經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記(該引物即為自身淬滅探針)，同時(shí)自身淬滅探針5′端連接有幾個(gè)和3′自身配對(duì)的堿基，自身淬滅探針是通過(guò)自身構(gòu)象的變化實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的淬滅和熒光信號(hào)的產(chǎn)生。PCR開始前引物處于游離狀態(tài)，自身淬滅探針5′端和3′端自身配對(duì)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的構(gòu)象可以導(dǎo)致標(biāo)記的熒光物質(zhì)發(fā)生淬滅，此時(shí)熒光信號(hào)很弱，當(dāng)PCR反應(yīng)開始后，自身淬滅探針在變性溫度下解鏈，形成單鏈結(jié)構(gòu)。在退火階段，自身淬滅探針和模板雜交，并進(jìn)行延伸反應(yīng)，引物(同時(shí)也是自身淬滅探針)延伸導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化，淬滅效應(yīng)減弱，此時(shí)可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，有更多的自身淬滅探針構(gòu)象發(fā)生改變，從而熒光信號(hào)也不斷增強(qiáng)。
由于該技術(shù)只需要合成一對(duì)引物(其中一條引物即為自身淬滅探針)，因此在反應(yīng)體系的優(yōu)化上將比較容易，而且它只需要一個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記，不需要淬滅基團(tuán)，可以極大的節(jié)約試劑的成本，更適宜臨床采用。該技術(shù)同樣具有熒光定量PCR技術(shù)的重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)。因此，該試劑盒能夠準(zhǔn)確、靈敏、快速檢測(cè)BCR/ABL融合基因mRNA，并能夠極大程度地降低試劑盒的成本。



現(xiàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
圖1為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品模板按10倍梯度稀釋后，實(shí)施熒光定量PCR獲得的熒光反應(yīng)曲線，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表相對(duì)熒光強(qiáng)度，圖中平行于橫坐標(biāo)的直線代表循環(huán)閾值。
圖2為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品模板按10倍梯度稀釋后，實(shí)施熒光定量PCR所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表起始模板濃度的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)。

具體實(shí)施例方式 該BCR/ABL融合基因mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包含淋巴細(xì)胞分離液、RNA提取液A、RNA提取液B、Oligo(dT)12-18、RT反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、DEPC水，定量PCR反應(yīng)液中含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、無(wú)菌去離子水、標(biāo)記引物和未標(biāo)記引物。RNA提取液A為Trizol；RNA提取液B為DEPC水配制的75％(v/v)乙醇；Oligo(dT)12-18濃度為0.5μg/μl，；RT反應(yīng)液中含有2.8×RT緩沖液、22.2U/μl RNasin、1.6mM dNTPs、DEPC水；逆轉(zhuǎn)錄酶為200u/μl M-MLV；定量PCR反應(yīng)液成分含有1.3×PCR緩沖液、2.7mMMgCl2、0.33mM dNTPs、0.33pmol/μl標(biāo)記引物(自身淬滅引物)、0.33pmol/μl未標(biāo)記引物、0.17U/μl Taq DNA聚合酶、無(wú)菌去離子水；標(biāo)準(zhǔn)品是含有插入BCR/ABL融合基因特異性保守序列的pMD 18-T Vector，該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖，其濃度為109copies/ul；對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陰性對(duì)照品為正常人骨髓細(xì)胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，陽(yáng)性對(duì)照品為P210bcr/ablcDNA樣品，其濃度為105copies/ul；DEPC水為向去離子水中加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度0.1％(v/v)，室溫放置10～12小時(shí)后，在121℃下，高壓滅菌20分鐘。
自身淬滅探針熒光定量PCR檢測(cè)BCR/ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA試劑盒的配制 一、材料 Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄用M-MLV、RNasin、Buffer、Oligo(dT)12-18購(gòu)自Promega公司；DEPC購(gòu)自Sigma公司；無(wú)水乙醇、逆轉(zhuǎn)錄用dNTPs購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；T-A克隆系統(tǒng)、PCR用TaqDNA聚合酶、dNTPs、Buffer、MgCl2購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司；PTC-200PCR儀為Perkin Elmer產(chǎn)品，ABI 7000型熒光定量PCR儀為美國(guó)AppliedBiosystems公司產(chǎn)品。
二、引物的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)GenBank公布的BCR/ABL融合基因核苷酸序列(AJ131466)和引物設(shè)計(jì)的基本原則，用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品PCR引物，其序列如下 標(biāo)準(zhǔn)品PCR上游引物序列為 5’-CGCGGATCCTGACCAACTCGTGTGTGAAACT-3’ 下游引物序列為 5’-CCCAAGCTTGACTGTTGACTGGCGTGATGTA-3’ 由上海生工公司合成。
根據(jù)所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品中目的片段核苷酸序列和自身淬滅引物(探針)設(shè)計(jì)的基本原則，在http://www.invitrogen.com/LUX上設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)用的自身淬滅引物(探針)，其序列如下 標(biāo)記引物序列為 5′-cggaaCAGACTGTCCACAGCATTCcG-3′ 3′端第二個(gè)堿基為c，其上標(biāo)記熒光物質(zhì)FAM； 未標(biāo)記引物序列為 5′-TTTGGGCTTCACACCATTCC-3′ 由美國(guó)Invitrogen公司合成。
三、檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)品制備 細(xì)胞總RNA提取實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞為表達(dá)BCR/ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA的K562細(xì)胞，2000rpm離心5min收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中，每管約107個(gè)K562細(xì)胞。按操作步驟二的方法提取K562細(xì)胞總RNA。
逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)RNA定量結(jié)果，取1μgRNA，加入0ligo(dT)12-181μl，再用DEPC H2O補(bǔ)足體積為15μl，混勻，高速離心5秒后，70℃預(yù)熱5分鐘，立即冰浴1分鐘，再依次加入5×Buffer 5μl，10mM dNTP 1.5μl，200u/μl M-MLV 1.0μl，200u/μl RNasin 1.0μl，DEPC H2O 1.5μl，最后總體積為25μl?；靹?，高速離心5秒后，37℃溫浴1小時(shí)，95℃ 5分鐘，產(chǎn)物置-20℃保存。
PCR擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2ul、10pmol/μl標(biāo)準(zhǔn)品上下游引物各1.5ul、10×Buffer 3ul、25mM MgCl2 1.6ul、2mMdNTPs 3ul、TaqDAN聚合酶0.2ul、無(wú)菌去離子水17.3ul，循環(huán)參數(shù)為95℃變性3min，然后再94℃1min、57℃1min、72℃ 45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。
PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，膠回收，定量，然后與T載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并將陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。質(zhì)粒提取后即為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度法測(cè)濃度并換算成拷貝數(shù)/體積。經(jīng)DNA測(cè)序，上述設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品與預(yù)期相符，回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下 1 gactgttgac tggcgtgatg tagttgcttg ggacccagcc ttggccattt ttggtttggg 61 cttcacacca ttccccattg tgattatagc ctaagacccg gagcttttca cctttagtta 121 tgcttagagt gttatctcca ctggccacaa aatcatacag tgcaacgaaa aggttggggt 181 cattttcact gggtccagcg agaaggtttt ccttggagtt ccaacgagcg gcttcactca 241 gaccctgagg ctcaaagtca gatgctactg gccgctgaag ggcttttgaa ctctgcttaa 301 atccagtggc tgagtggacg atgacattca gaaacccata gagccccgga gactcatcat 361 cttccttatt gatggtcagc ggaatgctgt ggacagtctg gagtttcaca cacgagttgg 421 tca 本發(fā)明試劑盒的使用方法 每次檢測(cè)均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
樣品要求
2～3ml EDTAK2抗凝新鮮骨髓樣本。
樣本采集后應(yīng)立即使用，若不能立即使用，可在4℃保存2～3小時(shí)，但不能保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。
操作步驟
一、骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離 1.將新鮮抗凝骨髓加入等體積生理鹽水稀釋，充分混勻。
2.離心管中先加入1/2體積(指稀釋后骨髓體積)的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后骨髓小心加入到分離液面上，保持清晰的界面，2000rpm離心15min。
3.小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層于離心管中，用生理鹽水洗兩次，每次500rpm離心5min。
二、骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA的提取和定量 1.加1.0ml RNA提取液A于分離的單個(gè)核細(xì)胞中，充分混勻，室溫靜置5min。
2.加入200μl的氯仿，用力振搖15秒，室溫靜置2～3min，在4℃12000rpm離心15min。
3.將上層無(wú)色水相移入另一干凈Ep管，加等體積的異丙醇，混勻，室溫放10min，在4℃ 12000rpm離心15min。
4.小心棄上清，加1.0ml RNA提取液B，在4℃ 7500rpm離心5min。小心吸去大部分RNA提取液B，開蓋，室溫干燥10min。
5.沉淀用25μl DEPC水溶解，并吸出部分溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280。根據(jù)RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA，乘以稀釋倍數(shù)，即可得RNA濃度。
三、逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 根據(jù)RNA定量結(jié)果，取1μgRNA，加入Oligo(dT)12-181μl，再用DEPC H2O補(bǔ)足體積為15μl，混勻，高速離心5秒后，70℃預(yù)熱5min，立即冰浴1分鐘。再依次加入1μl逆轉(zhuǎn)錄酶和9μl RT反應(yīng)液，最后總體積為25μl。混勻，高速離心5秒后，42℃溫浴1小時(shí)，95℃5分鐘。cDNA產(chǎn)物置-20℃保存。
四、PCR檢測(cè) 取5μl cDNA液，再加入15μl定量PCR反應(yīng)液。
按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)93℃預(yù)變性3min；然后93℃變性20s，58℃退火、延伸1min共40個(gè)循環(huán)，于退火溫度下收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后利用熒光定量PCR軟件分析。
五、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將109copies/ul的標(biāo)準(zhǔn)品以10倍梯度稀釋至102copies/ul。取各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品5μl作為模板，加入15μl定量PCR反應(yīng)液。按上述PCR反應(yīng)條件同待測(cè)樣品一同進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
結(jié)果判定
使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的分析軟件進(jìn)行文件的保存和域值的設(shè)定。
為了使我們測(cè)得的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，最終結(jié)果以1μg總RNA所對(duì)應(yīng)的cDNA拷貝數(shù)來(lái)表示。具體計(jì)算為Qty×5(Qty為熒光定量PCR測(cè)得的濃度) 自身淬滅探針熒光定量PCR檢測(cè)BCR/ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA試劑盒性能評(píng)價(jià) 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性范圍 取梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(109～102copies/ul)進(jìn)行熒光定量總體積20ul，其中15μl定量PCR反應(yīng)液，5ul梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(109102copies/ul)。反應(yīng)條件93℃預(yù)變性3min，93℃變性20s，分別再58℃退火、延伸1min共40個(gè)循環(huán)，于退火溫度下收集熒光信號(hào)。根據(jù)儀器所檢測(cè)到的熒光信號(hào)經(jīng)軟件處理獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)(R)，得出線性范圍，見圖1和圖2。
結(jié)果為在109～102copies/ul有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性很好R＝0.998。
二、靈敏度 將質(zhì)粒以10倍梯度稀釋至濃度極限10copies/ul，用去離子水做陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，能區(qū)別于陰性對(duì)照的最低質(zhì)粒濃度即為該法的靈敏度。同時(shí)將含有BCR/ABL融合基因的白血病K562細(xì)胞以及用淋巴細(xì)胞分離液分離的正常外周血單個(gè)核細(xì)胞，分別按106正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞含104、103、102、10及1個(gè)K562細(xì)胞的比例相混合配成細(xì)胞懸液備用，按本試劑盒使用方法所述步驟提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行熒光定量PCR，觀察本試劑盒能從106正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測(cè)出的K562細(xì)胞的最低數(shù)量。
檢測(cè)結(jié)果顯示所建方法最低能檢測(cè)10copies/μl的重組質(zhì)粒。并且該方法可從106正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)10個(gè)K562細(xì)胞，即相當(dāng)于從105個(gè)正常細(xì)胞中檢測(cè)1個(gè)白血病細(xì)胞。
三、重復(fù)性 批內(nèi)重復(fù)性取107個(gè)K562細(xì)胞，按本試劑盒使用方法所述步驟提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。濃度分別為102、103、104、105、106copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行做10管，計(jì)算所得CT值的變異系數(shù)(CV)。見表1-1。
表1-1批內(nèi)重復(fù)性測(cè)定結(jié)果 天間重復(fù)性取107個(gè)K562細(xì)胞，按本試劑盒使用方法所述步驟提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，每天各測(cè)一次，連續(xù)測(cè)定10天，記錄結(jié)果，計(jì)算所得CT值的變異系數(shù)(CV)。見表1-2。
表1-2天間重復(fù)性測(cè)定結(jié)果 結(jié)果該方法的批內(nèi)CV為2.1％，天間CV為6.1％。
標(biāo)本檢測(cè) 標(biāo)本來(lái)源30例病人為血液科門診和住院病人，診斷標(biāo)準(zhǔn)按FAB協(xié)作組診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中19例為慢性粒細(xì)胞白血病(CML)病人，CML病人中12例為慢性期，其中1例發(fā)生急變，6例為急變期，其中2例病人作α-干擾素治療前后的隨訪檢查，另有一例為治療后緩解3年隨訪。另有3例為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，1例為巨幼細(xì)胞性貧血，1例為缺鐵性貧血，6例為正常增生性骨髓象。抽取病人骨髓3ml，EDTAK2抗凝。
標(biāo)本檢測(cè)嚴(yán)格按上述本試劑盒使用方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定，設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。
結(jié)果用本試劑盒檢測(cè)30例病人標(biāo)本，19例CML病人標(biāo)本全為陽(yáng)性，其中9、13號(hào)病人進(jìn)行了α-干擾素治療前后BCR/ABL表達(dá)水平的比較，兩例病人治療后緩解，BCR/ABL表達(dá)水平明顯降低，15號(hào)病人治療無(wú)效發(fā)生急變，BCR/ABL表達(dá)水平升高。19號(hào)病人緩解3年隨訪，BCR/ABL表達(dá)水平較低，檢測(cè)BCR/ABL期間其費(fèi)城染色體檢查為陰性。3例ALL有1例為陽(yáng)性。其它1例巨幼細(xì)胞性貧血，1例缺鐵性貧血，6例正常增生性骨髓象均為陰性。19例CML病人和1例陽(yáng)性ALL病人的檢測(cè)結(jié)果見表2。
表2 19例CML病人和1例陽(yáng)性ALL病人BCR/ABL mRNA檢測(cè)結(jié)果
SEQUENCE LISTING
<110>馮文莉
<120>BCR/ABL融合基因mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒
<160>3
<170>Patentin version 3.1
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
CGGAACAGAC TGTCCACAGC ATTCCG 26
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
TTTGGGCTTC ACACCATTCC 20
210>3
<211>423
<212>DNA
<213>BCR/ABL融合基因融合區(qū)保守序列
<400>3
1 gactgttgac tggcgtgatg tagttgcttg ggacccagcc ttggccattt ttggtttggg
61 cttcacacca ttccccattg tgattatagc ctaagacccg gagcttttca cctttagtta
121 tgcttagagt gttatctcca ctggccacaa aatcatacag tgcaacgaaa aggttggggt
181 cattttcact gggtccagcg agaaggtttt ccttggagtt ccaacgagcg gcttcactca
241 gaccctgagg ctcaaagtca gatgctactg gccgctgaag ggcttttgaa ctctgcttaa
301 atccagtggc tgagtggacg atgacattca gaaacccata gagccccgga gactcatcat
361 cttccttatt gatggtcagc ggaatgctgt ggacagtctg gagtttcaca cacgagttgg
421 tca
權(quán)利要求
1.一種BCR/ABL融合基因mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包含淋巴細(xì)胞分離液、RNA提取液A、RNA提取液B、Oligo(dT)12-18、RT反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、DEPC水，定量PCR反應(yīng)液中含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和去離子水，其特征在于定量PCR反應(yīng)液中還含有標(biāo)記引物和未標(biāo)記引物，標(biāo)記引物序列為5′-CGGAACAGACTGTCCACAGCATTCcG-3′，3′端第二個(gè)堿基c標(biāo)記熒光物質(zhì)FAM，5′端的CGGAA可以與3′端最后5個(gè)堿基TTCCG形成自身配對(duì)，未標(biāo)記引物序列為5′-TTTGGGCTTCACACCATTCC-3′；標(biāo)準(zhǔn)品核苷酸序列為
1 gactgttgac tggcgtgatg tagttgcttg ggacccagcc ttggccattt aggtttggg
61 cttcacacca ttccccattg tgattatagc ctaagacccg gagcttttca cctttagtta
121 tgcttagagt gttatctcca ctggccacaa aatcatacag tgcaacgaaa aggttggggt
181 cattttcact gggtccagcg agaaggtttt ccttggagtt ccaacgagcg gcttcactca
241 gaccctgagg ctcaaagtca gatgctactg gccgctgaag ggcttttgaa ctctgcttaa
301 atccagtggc tgagtggacg atgacattca gaaacccata gagccccgga gactcatcat
361 cttccttatt gatggtcagc ggaatgctgt ggacagtctg gagtttcaca cacgagttgg
421 tca。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BCR/ABL融合基因mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)品為含有插入BCR/ABL融合基因特異性保守序列的pMD 18-T Vector，對(duì)照品中的陰性對(duì)照品為正常人骨髓細(xì)胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對(duì)照品中的陽(yáng)性對(duì)照品為P210bcr/abl cDNA樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及BCR/ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其包含淋巴細(xì)胞分離液、RNA提取液A、RNA提取液B、Oligo(dT)12-18、RT反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、DEPC水，定量PCR反應(yīng)液中含有標(biāo)記引物和未標(biāo)記引物。該試劑盒通過(guò)提取骨髓或外周血總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可以準(zhǔn)確定量待檢標(biāo)本中BCR/ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA水平。該試劑盒采用最新的自身淬滅探針技術(shù)，具有重復(fù)性好、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于慢性粒細(xì)胞白血病診斷、療效觀察、預(yù)后、微量殘留白血病(MRD)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101168772SQ20071009296
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者輝 彭, 王小中, 劉釘賓, 曾建明 申請(qǐng)人:馮文莉