專利名稱：：人cd40l表達(dá)體系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種真核表達(dá)體系，尤其涉及一種人CD40LDNA表達(dá)體系及其制備方法。
背景技術(shù)：
：DM重組:汰術(shù)(recombinantDNAtechnology)是生物工程體系中的重要組成部分。是指在基因水平上，根據(jù)需要以人工的方法取得供體上某個(gè)或某些有用的基因，在體外重組于載體DM分子，然后將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖或行使正常功能。DNA重組技術(shù)主要包括①人工合成或從生物基因組中，獲取帶有目的基因的DNA片段；②選擇或t造作為載體的DNA;③將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，即DNA重組；④將重組DNA分子引入受體細(xì)胞；⑤從大量的細(xì)胞繁殖群體中篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞并擴(kuò)增，進(jìn)一步抽提、純化、擴(kuò)增得到目的基因；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下呈現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需的物質(zhì)。該技術(shù)已廣泛用于基因工程藥物及各種疫苗的制備等研究領(lǐng)域。CD40L(CD154),是由261個(gè)氨基酸構(gòu)成的II型跨膜糖蛋白。它主要表達(dá)于激活態(tài)T淋巴細(xì)胞，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞表面。在免疫系統(tǒng)，該分子與相應(yīng)細(xì)胞CD40受體的相互作用對(duì)調(diào)節(jié)體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)具有樞紐作用。一定狀態(tài)下，CD40L與腫瘤細(xì)胞表面CD40結(jié)合，可以直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，增加抗腫瘤制劑的敏感性。更重要的是，CD40L—方面可以誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟，延長(zhǎng)DC細(xì)胞生存期，上調(diào)共刺激分子及內(nèi)源性腫瘤肽表達(dá)；另一方面可增加一些免疫刺激因子的分泌。從而提高DC的抗原呈遞效應(yīng)，促進(jìn)T效應(yīng)細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)了宿主抗腫瘤免疫的能力。以CD40L為組件的抗腫瘤疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究日益受到重視，諸多資料表明，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的抑癌效果令人欣慰，有望拓展于臨床領(lǐng)域。因此，建立人CD40L表達(dá)體系，為進(jìn)一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種人CD40L表達(dá)體系，使人CD40L在所需的受體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，達(dá)到以人工的方式適度調(diào)整某些免疫反應(yīng)的目的，為相關(guān)臨床免疫研究奠定基礎(chǔ)，該體系具有以下特征含真核啟動(dòng)子的表達(dá)載體；編碼SEQIDNO:1的特異性人CD40L目的基因片,更；所述的表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)與CD40L目的基因片段重組。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的CD40L目的基因片段SEQIDNO:1序列為NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的編號(hào)為BC071754CD40L序列中所載取的40至915間基因序列，共876個(gè)堿基。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的表達(dá)載體含CMV和SV40真核啟動(dòng)子。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)具有NheI和KpnI酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)載體除去多克隆位點(diǎn)NheI與KpnI之間16個(gè)石威基的載體部分。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的CD40L目的基因片段是由人激活態(tài)T淋巴細(xì)胞中獲取。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種制備上述的人CD40L表達(dá)體系的方法，制備中所用試劑均為市售分析純制劑。其主要包含以下步驟(1)CD40L目的基因的克??；(2)CD40L與pMD-18-T重組克隆載體的構(gòu)建；(3)PMD-18-T-CD40L重組克隆載體的鑒定與純化；(4)重組CD40L-表達(dá)載體的構(gòu)建；(5)重組CD40L-表達(dá)載體陽性質(zhì)粒的鑒定與純化；(6)重組CD40L-表達(dá)載體陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞林；(7)靶細(xì)胞林中CD40L目的基因表達(dá)的檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的CD40L目的基因的克隆引物為SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的核苷酸序列。其中，為便于定向重組載體的篩選，上述的SEQIDNO:2所示序列的5，末端和上述的pMD18-T載體分別設(shè)有酶切位點(diǎn)NheI和KpnI。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的重組CD40L-表達(dá)載體中的表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)載體除去多克隆位點(diǎn)NheI與KpnI之間16個(gè)堿基的載體部分。本發(fā)明所述的人CD40L表達(dá)體系，是借用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將該基因轉(zhuǎn)入耙細(xì)胞，使CD40L在所需的細(xì)胞中表達(dá)，可以利用CD40L對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，研究相應(yīng)臨床免疫，尤其是相關(guān)抗胂瘤免疫研究。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。圖1A是人血分離、培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞刺激前的示意圖1B是人血分離、培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞刺激后的示意圖2A是激活T細(xì)胞總RM的電泳圖2B是CD40LDNA及純化后產(chǎn)物的電泳圖3是pMD-l8載體的物理圖i普；圖4是菌液CD4OLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖5是CD4OLPCR陽性菌液的DNA測(cè)序圖譜；圖6是pcDNA3.1(+)載體的物理結(jié)構(gòu)圖7是pMD18-CD40L和pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒的電泳圖8是pMD18-CD40L和pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒的酶切、純化物的電泳圖9是pcDNA3，1(+)-CD40L轉(zhuǎn)化菌液的CD40LPCR檢測(cè)電泳圖10是pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-CD40L、pc醒3.1(+)-CD40L酶切產(chǎn)物的電泳圖ll是pcDM3.1(+)-CD40L的測(cè)序圖譜；圖12是pcDNA3.1(+)和pcDM3.1(+)-0)401質(zhì)粒轉(zhuǎn)染^46細(xì)胞的？01#:測(cè)電泳圖13A是pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染H446細(xì)胞的流式細(xì)胞4義測(cè)試圖13B是pcDM3.1(+)-CD40L轉(zhuǎn)染H446細(xì)月包的流式細(xì)胞4義測(cè)試圖14是重組pcDNA3.1(+)-CD40L轉(zhuǎn)染H446抹后的熒光顯示圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1CD40L目的基因的克隆1.引物設(shè)計(jì)與合成本發(fā)明構(gòu)建的人CD40L表達(dá)體系，以NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)收錄、編號(hào)為BC071754的CD40L序列為引物設(shè)計(jì)的模板，利用primerPremier5引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，主要注重以下幾點(diǎn)1)確保閱讀框完整，2)在包含核心啟動(dòng)子元件TATA盒(起始信號(hào)前25-30bp)的前提下，盡量降低或避免引物出現(xiàn)發(fā)夾或二聚體結(jié)構(gòu)形成的可能。3)選擇能夠較穩(wěn)定表達(dá)外源DNA的，pcDNA3.1(+)質(zhì)粒真核表達(dá)載體，介導(dǎo)本基因在靶定細(xì)胞中表達(dá)。4)為確保目的基因的高純度克隆及在酶切時(shí)有良好的g反應(yīng)構(gòu)象空間，選擇T克隆載體作為中間介質(zhì)。5)為便于定向重組載體的篩選，設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，一個(gè)設(shè)于正鏈引物5'末端，另一個(gè)設(shè)于T載體。上游引物5'-TGCCAGAAGATACCATTT-3、(SEQIDNO:2所示)下游引物5'-gctgtattatgaagactccc-3',(seqidno:3所示)上游引物5'端加載NheI酶切位點(diǎn)。下游引物的KpnI酶切位點(diǎn)設(shè)在T載體。2.CD40L目的基因存在細(xì)胞的獲取取健康成人外周血約40ml,以淋巴細(xì)胞分離液離心得單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)貼壁收集非貼壁的淋巴細(xì)胞，再經(jīng)尼龍毛柱過濾得t淋巴細(xì)胞。以含有il-2的10FWPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)6天，再分別加入PMA與ConA使其終濃度分別為10ng/ml與lOjag/ml,激刺培養(yǎng)10小時(shí)收獲激活的T淋巴細(xì)胞。刺激前、后的T細(xì)胞請(qǐng)分別參照?qǐng)D1A和圖1B。3.CD40L目的基因的擴(kuò)增1)T細(xì)胞總RNA提取收集激活T淋巴細(xì)胞以Tripur提取T細(xì)胞RNA。取培養(yǎng)7天并刺激10^時(shí)的T細(xì)胞，從瓶中輕輕吸取所有細(xì)胞懸液于離心管，盡量吸凈，室溫lOOOrmp離心5分鐘，棄上清，取lmlTripure加至原培養(yǎng)并瓦內(nèi)反復(fù)吹打，沖洗，隨后將所有Tripure移入已收集細(xì)胞的離心管，反復(fù)吹打2分鐘，將離心管內(nèi)所有內(nèi)容移入DEPC處理的EP管內(nèi)，室溫放置5分鐘。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置15分鐘。4°C12000xg離心15分鐘，以100jal移液器，小心吸取水相于另一EP管，加入異丙醇0.5ml,混勻，室溫放置10分鐘。4°C12000xg離心IO分鐘，去上清，加無RNase75。/。乙醇1ml洗滌沉淀。4°C7500xg離心5分鐘，去上清。電吹風(fēng)吹離心管，使乙醇揮發(fā)，力口30yl無RNAaseddH20，55-6(TC放置10分鐘，待沉淀溶解，紫外分光光度計(jì)，測(cè)其od值。rna電泳取5m1rna與6x上樣緩沖液1/a1混合，于1%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣，于TAE緩沖液構(gòu)成的電泳體系進(jìn)行電泳，設(shè)置90V電壓，電泳15分鐘。電泳圖請(qǐng)參照?qǐng)D2A。2)RT-PCR試劑盒以PR-PCR法，逆轉(zhuǎn)、擴(kuò)增CD40L目的基因并給予純化。A、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與條件設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組合成分體積MgCl22nl10xRT緩沖液1^1無RNasedH202.75^1dNTP混合物(各10mM)l^ilRNase#卩制劑0.25|nlAMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5piOligodT-A接頭引物0.5piT細(xì)胞總RNA2^il總體積_10^1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)42°C30分鐘99°C5分鐘、15°C5分上述成分混勻后，于上述反應(yīng)條件合成CD40LcDNA。B、PCR反應(yīng)與條件設(shè)置PCR反應(yīng)液組合成分體積5xPCR緩沖液10^1滅菌ddH2028.75|_ilTaKaRaxTaqTMHS0.25pl上游特異PCR引物(SEQIDNO:1)0.5|al下游特異PCR引物(SEQIDNO:2)0.5pl總體積50pi將B液與反應(yīng)后的A液混合，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)94°C2分鐘194°C30秒反應(yīng)產(chǎn)物于1°/。瓊脂糖凝膠由TAE緩沖液構(gòu)成的電泳體系中電泳，設(shè)電壓60V，電泳時(shí)間45分4中。3)CD40LDNA片段純化回收采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。取5jal電泳鑒定質(zhì)量。電泳圖請(qǐng)參照?qǐng)D2B。圖2B中的1和2分別是已經(jīng)純化和未純化的CD40LDNA片段的電泳條帶，M為標(biāo)準(zhǔn)DNADL2000。實(shí)施例2人CD40L與pMD-18-T重組克隆栽體的建立1.以pMD-18-TVector試劑盒，將已純化的人CD40L與pMD-18T載體連接，pMD-18-T載體的物理圖鐠如圖3所示。連接反應(yīng)體系配制成分_體積pMD-18-TvertorDNA1pl純化的CD40LDNA4plddH200pi連接反應(yīng)液_5pl總體積_10pl上述反應(yīng)體系于16'C反應(yīng)9小時(shí)。2.重組克隆載體轉(zhuǎn)化于DH5感受態(tài)菌抹-70。C冰箱取DH5感受態(tài)細(xì)菌lOOpil于冰浴冰融，將lOpl重組克隆載體連接反應(yīng)產(chǎn)物加入100plDH5感受態(tài)菌液，輕彈、旋轉(zhuǎn)管底混勻，冰水浴放置30分鐘。立即置42。C水浴熱休克90秒。立即水浴3分鐘。加Amp—-SOC培養(yǎng)液150pl,于37。C恒溫?fù)u床，200rpm振蕩孵育1小時(shí)。取50(^1轉(zhuǎn)化菌液涂布于IPTG+-X-gar-Amp+SOC瓊脂平板。待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37。C孵育箱培養(yǎng)16小時(shí)。3.CD40L重組克隆載體的鑒定。1)DH5pMD-18—T-CD40L載體P日寸生菌液PCR才企煩寸在藍(lán)、白斑篩選培養(yǎng)皿中，挑取白色菌落13林，置Amp+SOC液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，每支試管取菌液5pl，熱裂解后行PCR檢測(cè)，編號(hào)A3、A5、A6三林菌液有擬似CD40L基因表達(dá)，如圖4所示，A3、A5為其中的二株，所擴(kuò)增條帶位于標(biāo)準(zhǔn)DNA750-1000bp之間，與T細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增條帶大小相符，推測(cè)，該條帶為本研究所需目的基因。2)CD40LPCR陽性菌液DM測(cè)序測(cè)序結(jié)果如圖5所示，測(cè)得的序列如SEQIDNO:4所示，經(jīng)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)NheI和KpnI酶切位點(diǎn)序列分別位于SEQIDNO:4序列的5，端和3，端，SEQIDNO:2引物序列緊跟位于NheI酶切位點(diǎn)后面，SEQIDNO:3引物序列、T載體上19個(gè)堿基和緊隨其后的KpnI的酶切位點(diǎn)序列依次位于SEQIDNO:4序列的3，端，上述兩個(gè)引物之間的插入序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的編號(hào)為BC071754CD40L序列中40至915間基因序列完全相符。實(shí)施例3pcDNA3.1(+)-CD40L表達(dá)栽體的建立1.菌液準(zhǔn)備-20。C水箱取pcDNA3.1(+)載體與重組pMD-18-CD40L載體凍存轉(zhuǎn)化菌，以接種環(huán)各取一環(huán)菌，于IPTG+-X-gar-Amp+SOC固體培養(yǎng)基，劃線接種，37。C培養(yǎng)箱孵育16小時(shí)。次日分別挑取單個(gè)菌落于各含5mlA即+S0C液體培基試管，37。C恒溫?fù)u床孵育12小時(shí)，得OD值約有0.6菌液。pcDNA3.1(+)載體的物理圖譜如圖6所示。2.pcDNA3.1(+)載體、pMD18-T-CD40L載體質(zhì)粒提取以質(zhì)粒提取試劑盒分別提取兩轉(zhuǎn)化菌中的質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖電泳。電泳圖如圖7所示，泳道1表示pMD18-T-CD40L載體質(zhì)粒，泳道2表示pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒。3.pcDNA3.1(+)載體、pMD18-CD40L載體質(zhì)粒分別酶切并純化兩質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)體系如下pMD18-CD4QL載體質(zhì)粒雙酶切<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述pcDNA3.1(+)載體、pMD18-CD40L載體質(zhì)粒分別酶切純化后，進(jìn)行瓊脂糖電泳，電泳圖如圖8所示，其中1和2分別為pMD18-CD40L載體質(zhì)粒的雙酶切、純化物的電泳條帶，3和4分別為pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒的雙酶切、純化物的電泳條帶。4.pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒與CD40L基因片段連接連接反應(yīng)體系:_成分體積pcDNA3.1(+)質(zhì)粒純化液2ju1CD40LDNA片,爻純化液13.5u1lraMrATP2ul10x緩沖液2ulT4腿連接酶0.25ulddH200.25ul總體積20ul16。C反應(yīng)16小時(shí)5.pcDNA3.1(+)載體與CD40L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于TOP10感受態(tài)細(xì)菌-70匸水箱取11010感受態(tài)細(xì)菌lOOpl于冰浴冰融，將10^1pcDNA3.1(+)與CD40L連接產(chǎn)物加入100plTOP10感受態(tài)菌液，輕彈、旋轉(zhuǎn)管底混勻，冰水浴放置30分鐘，立即置42。C水浴熱休克90秒，再冰浴3分鐘，加Amp—-SOC培養(yǎng)液150pl,置于37。C恒溫?fù)u床，以200rpm振蕩孵育1小時(shí)，取50nl轉(zhuǎn)化菌液分別涂布Amp+SOC瓊脂平板，待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37t:孵育箱培養(yǎng)16小時(shí)。6.pcDNA3.1(+)-CD40L重組陽性質(zhì)粒的篩選、鑒定A、Amp抗性菌落篩選上述轉(zhuǎn)化菌液于Amp+S0C固體培養(yǎng)進(jìn)行篩選培養(yǎng)，可見有Amp抗性白色菌落生長(zhǎng)。B、pcDNA3.1(+)-CD40L載體轉(zhuǎn)化菌液CD40LPCR篩選取分別44取414朱白色菌落，以吸管吸取Amp+S0C培養(yǎng)基5ml，將其沖入相應(yīng)試管內(nèi)，消毒棉塞封口。37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，進(jìn)行菌液質(zhì)粒的CD40LPCR檢測(cè)。15抹存在CD40L插入片段，圖9中所示的為其中的9株，擴(kuò)增條帶位于標(biāo)準(zhǔn)DNA750至1000之間與插入序列大小相符。C、pcDNA3.1(+)載體與pc醒3.1(+)-CD40L載體大小的比較及重組質(zhì)粒酶切分別提取空載pcDNA3.1(+)與重組載體pcDM3.1(+)-CD40L質(zhì)粒并對(duì)重組質(zhì)粒酶切，電泳結(jié)果如圖10所示，1，2，3分別是pcDNA3.1(+)質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)-CD40L質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)-CD40L質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的電泳泳道。泳道'2'質(zhì)粒大于泳道'l'質(zhì)粒與設(shè)想的結(jié)果相符，泳道'2'重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切得泳道'3，可見兩個(gè)大小不等的DNA片,爻，其一位于5500bp附近與pcDNA3.1(+)載體相符，其二略小于1000bp與本研究插入CD40L相符，兩條酶切片段與本研究設(shè)想結(jié)構(gòu)的大小基本一致。D、pcDNA3.1(+)-CD40L質(zhì)粒的DNA序列測(cè)定測(cè)序結(jié)果如圖ll所示，測(cè)得的序列如SEQIDN0:5所示，經(jīng)對(duì)比，SEQIDNO:2引物序列位于SEQIDNO:5序列的5，端，SEQIDNO:3引物序列、T載體上的序列依次位于SEQIDNO:5序列的3，端，上述兩引物之間的插入序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的編號(hào)為BC071754CD40L序列中40至915間基因序列完全相符。實(shí)施例4H446細(xì)胞林質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染及CD40L表達(dá)的鑒定1.H446細(xì)胞林質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染將1.5x105個(gè)H446細(xì)胞500|i1接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞融合至85%-90°/。，將月旨酉旨體LipofectamineTM20002ul分別與pcDNA3.1(+)及pcDNA3.l(+)-CD4QL各lug混合，混合物100n1加入相應(yīng)培養(yǎng)孔，轉(zhuǎn)染8小時(shí)，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD40L表達(dá)的檢測(cè)1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CD40LmRNA轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA的提取去除空載與重組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加Tripure0.5ml，吸管吹打，使細(xì)胞脫壁并裂解，將裂解產(chǎn)物移入1.5mlDEPC處理的EP管內(nèi)，室溫放置5分鐘。加入0.1ml氯仿/管，劇烈振蕩15秒，室溫放置15分鐘。4。C10000xg離心15分鐘，以100ial移液器，小心吸取250ul水相于另一EP管。加入O.25ml異丙醇，混勻，室溫》文置于10分鐘。4°C12000xg離心10分鐘，去上清，加75%乙醇0.5ml漂洗沉淀。4°C7500xg離心5分鐘，去上清。以電吹風(fēng)吹離心管，使其乙醇揮發(fā)，加20"l/管無RNase水，55-60。C放置10分鐘溶解沉淀。溶解后，取空載與重組轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA各5n1與6x上樣緩沖液1ja1混合，于含1%瓊脂糖凝膠的TAE緩沖液構(gòu)成的電泳體系進(jìn)行電泳。CD40LRT-PCR檢測(cè):A、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成分體積(空栽)體積(重組)MgCl24^14^110xRT緩沖液2^12^1無RNaseddH207.5pl7.5pldNTP混合物(各10mM)2pl2plRNase抑制劑0.5^10.5|alAMV反轉(zhuǎn)錄酶1.Ojil1.OplOligodT-A接頭引物1.Onl1.O^il空載總RNA2pi重組總RNA2|_U總體積20nl20|_U逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)42°C30分鐘、99'C5分鐘5。C5分鐘上述成份混勻后，按上述條件反應(yīng)。B、PCR反應(yīng)，按以下組成配制PCR反應(yīng)液分為4組成々重組-CD40L體積重組-P-actin空載-CD40L體積體積空載-Pactin體積5xPCR緩液ddH20TaKaRaxTaqTMHS10nl28.75^1，28.75(^1128.75pl128.75(il0.25^10.25|il0.25^10.25)^1上游特異物0.5^10.5(xl(SEQIDN0:2)下游特異引物(SEQ0.5^10.5plIDNO:3)上游特異引物0.5pi0.5pi(人Pacti售)下游特異引物0.5nl0.5|al(人pacti售)重組A反應(yīng)液體I空載A反應(yīng)液體1(^110^1總體積50(^150nl反應(yīng)條件溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)94°C今194°C30秒，56°C30秒一3672°C1.4分鐘脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別介導(dǎo)pcDNA3.1(+)與pcDNA3.1(+)-CD40L轉(zhuǎn)染肺小細(xì)胞肺癌細(xì)胞抹H446,轉(zhuǎn)染后48小時(shí),PR-PCR法分別對(duì)兩種載體轉(zhuǎn)染的H446細(xì)胞進(jìn)行CD40LmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果如圖12所示，重組pcDNA3.1(+)-CD40L轉(zhuǎn)染細(xì)胞有CD40LmRNA的表達(dá)；空載pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞無C詣LmRNA的表達(dá)。2)H446重組體轉(zhuǎn)染后流式細(xì)胞儀測(cè)試CD40L表達(dá)率PE標(biāo)記CD40L單抗對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞染色，流式細(xì)胞^U企測(cè)PE標(biāo)記CD40L單抗與轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合的百分率。設(shè)雙復(fù)管，空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合率分別為3.7%、2.8%,如圖13A所示，考慮為非特異結(jié)合，重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合率分別為72.42%、63.69%如圖13B所示。重組轉(zhuǎn)染細(xì)胞被被染色后，于螢光顯微鏡可見抗CD40L與胞膜上CD40L結(jié)合后形成的環(huán)形紅色螢光標(biāo)記，如圖14所示。說明重組pcDNA3.1(+)-CD40L表達(dá)載體通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，順利轉(zhuǎn)染于H446細(xì)胞，并且該載體在H446細(xì)胞能正常執(zhí)行功能，使CDWL得到有效地轉(zhuǎn)錄、翻譯與表達(dá)。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。序列表<110>田坤<120>人CD40L表達(dá)體系及其制備方法<130><160>5<170〉Patentlnversion3.2<210>1<211>876<212>纖<213>CD40L目的基因序列<400>1tgccagaagataccattteaactttaacacagcatgatcgaaac由c^ccaaacttct60ccccgatctgcggccactggactgcccatcagcatgaaaatttttatgtatttacttact120gtttttcttatcacccagatgattgggtcagcactttttgctgtgtatcttc汪tagaagg180ttggacaagatagaagatgaaaggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaaacgata240cagagatgcaacacaggagaaagatccttatccttactgaactgtgaggagattaaaagc300cagtttgaaggctttgtgaaggatataatgttaaacsa^igaggagacgaaga^tagaaaac360agctttgaaatgcaaaaaggtgatcagaatcctcaaattgeggcacatgtcaUagtgag420gccagcagtaaaacaacatctgtgttacagtgggctg纖aaggatactacaccatg汪gc480aacaacttggtaaccctggacagctgaccgttaaaagacaaggactctat540tatatctatgcccaagtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccattt600atagccagcctctgccUaagtcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgea660aatacccacagttccgccaaaccUgcgggcaacaatccattcacttggg汪ggagtmt720gaattgcgiaccaggtgcttcggtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtgagccat780ggcactggcttcacgtcctttggcttactcaaactctgaacagtgtc汪ccttgcaggctg840tggtggagctgacgctgggagtcttcataatacagc876<210>2<211>18<212>DM<213>人工合成的擴(kuò)增CD40L目的基因的上游引物<400>2gctagctgccagaagaUccattt18<210〉3<211>20<212>DM<213>人工合成的擴(kuò)增CD40L目的基因的下游引物<400〉3gctgtattatgaagactccc20<210>4<211>907<212>廳<213>pMD-18-CD40L轉(zhuǎn)化陽性菌插入CD40LDNA測(cè)序序列(含有酶切位點(diǎn))<400〉4gctagctgccagaagataccatttcaacttta3C3C3gcatgatcgaaacatacaaccaa60acttctccccgatctgcggccactggactgcccatcagcatga^atttttatgtattta120cttactgtUttcttatcacccagatgattgggtcagcactttttgctgtgtatcttcat180agaaggttggaca3gatagaag"g謹(jǐn)ggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaa240acgatacagagatgcaacacaggag扁gatccttatcctUctgaactgtgaggagatt300aaaagccgigtttgaaggctttgtgugg"ataatgttaaacaa,ggagacgaagaaa360gaaaacagctttgaaatgcaaaa3ggtgatcagaatcctcaaattgcggcacatgtcata420agtgaggccagcagtaaaaca3catctgtgtt濃gtgggctgaaaaaggatactacacc480atg汪gcaacaacttggtaaccctggaaaatggg咖cagctgaccgttaaaagacaagga540ctctattatatcUtgcccaagtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagct600ccatttatagccagcctctgcchaagtcccccggtagattcgagagaatcttactcaga660gctgcaaatacccacagttccgccaaaccttgcgggc獄aatccatteacttgggagga720gtatttgaattgcaaccaggtgcttcggtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtg780agccatggcactggcttcacgtcctttggcttactcaaactctgaacagtgtcaccttgc840aggctgtggtggagctgacgctgggagtcttcataatacagcaatctctagaggatcccc900gggtacc907<210>5<211>895<212〉DNA<213>pcDNA3.1(+)-CD40L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽性菌插入CD40L測(cè)序序列(不含酶切位點(diǎn))<400>5tgccagaagataccatttcaactttaacacagcatgatcgaaacatacaaccaaacttct60ccccgatctgCggCC3Ctggactgcccatcagcatgaaaatttttatgtatttacttact120gtttttcttatcacccagatg"tgggtcagcactttttgctgtgtatcttcatagaagg180ttggacaagatagaagatgaaaggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaaacgata240cagagatgcaacacaggagaaagatccttatccttactgaactgtgaggagattaaaagc300cagtttgaaggctttgtgaaggatataatgttaaaca^gagg卿cgaagaaag^aac360agctttgaaatgca^aaggtgatcagaatcctcaaattgcggcacatgtcataagtgag420gccagcagta3aacaac3tctgtgtUcagtgggctg咖aaggat3ctacaccatgagc480aacaacttggUaccctggaa^tgggaaacagctgaccgttaaaagacaaggactctat540taUtctatgcccaagtcaccttctgttcc組cgggaagcttcgagtcaagctccattt600atagccagcctctgcctaaagtcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgca660aatacccacagttccgccaa腦ttgcgggUcacttgggaggagUttt720gaattgcaaccaggtgcttcggtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtgagccat780ggcactggcttcacgtcctttggcttactcaaactctgaacagtgtcaccttgcaggctg840tggtggagctgacgctgggsgtcttcataaUcagcaatctctagaggatccccg89權(quán)利要求1.一種人CD40L表達(dá)體系，其特征在于該體系含真核啟動(dòng)子的表達(dá)載體；編碼SEQIDNO1特異性人CD40L目的基因片段；所述表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)與CD40L目的基因片段重組。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)體系，其特征在于所述的CD40L目的基因片段SEQIDNO:1的序列是NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的編號(hào)為BC071754CD40L序列中所載取的40至915間基因序列。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的表達(dá)體系，其特征在于所述的表達(dá)載體含CMV和SV40真核啟動(dòng)子。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)體系，其特征在于所述的表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)具有NheI和KpnI酶切位點(diǎn)。5.根據(jù)權(quán)利要求1，3或4所述的表達(dá)體系，其特征在于所述的表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)載體除去多克隆位點(diǎn)NheI與KpnI之間16個(gè)堿基的載體部分。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)體系，其特征在于所述的CD40L目的基因片段是由人激活態(tài)T淋巴細(xì)胞中荻取。7.—種制備權(quán)利要求1所述的人CD40L表達(dá)體系的方法，其特征在于包含以下步驟(1)CD40L目的基因的克隆；(2)CD40L目的基因與pMD-18-T載體的重組克隆載體的構(gòu)建；(3)pMD18-T-CD40L重組克隆載體的鑒定與純化；(4)CD40L-表達(dá)載體的構(gòu)建；(5)CD40L-表達(dá)載體重組陽性質(zhì)粒的鑒定與純化；(6)CD40L-表達(dá)載體重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染耙細(xì)胞抹；(7)靶細(xì)胞抹中CD40L目的基因表達(dá)的檢測(cè)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于CD40L目的基因的克隆引物為SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的核苷酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述的SEQIDNO:2所示序列的5，末端和pMD18-T載體分別設(shè)有酶切位點(diǎn)NheI和KpnI。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的CD40L-表達(dá)載體中的表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)載體除去多克隆位點(diǎn)NheI與KpnI之間16個(gè)石成基的載體部分。全文摘要本發(fā)明公開了一種人細(xì)胞表面分子CD40L(CD154)的表達(dá)體系及制備方法。CD40L(CD154)的表達(dá)體系含真核啟動(dòng)子的表達(dá)載體；編碼SEQIDNO1的特異性CD40L目的基因片段；表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)與CD40L目的基因片段重組。構(gòu)建該體系的目的是借用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將該基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，使CD40L在所需細(xì)胞中表達(dá)，利用CD40L對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，為相應(yīng)臨床免疫研究，尤其是相關(guān)抗腫瘤免疫研究奠定基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/09GK101200715SQ20071009308公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者坤田,錢桂生申請(qǐng)人:坤田