專利名稱：大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)方法，特別是指一種大鼠結(jié)腸成纖維細胞培 養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
生物體是一種非常復雜的巨系統(tǒng)。在系統(tǒng)內(nèi)，不同的器官、組織、細 胞以及不同的生物活性物質(zhì)之間存在錯綜復雜的相互關系。在生物體內(nèi) 部，幾乎不存在"自由"的細胞。任何一種細胞隨時隨地都處在整個生物 系統(tǒng)的統(tǒng)一調(diào)控與影響之中。而通過體外培養(yǎng)技術(shù)，可以將生物體的活體 結(jié)構(gòu)成分甚至生物個體從體外或其寄生體內(nèi)取出,放在類似于體內(nèi)生存環(huán) 境的體外環(huán)境中觀察其生長和發(fā)育。因其具有簡化細胞的生長環(huán)境、方便 施加實驗因素以及便于觀測實驗結(jié)果等方面的優(yōu)點而備受關注。
腸纖維化的形成是由于腸道組織對于腸道慢性炎癥過度的、不可逆的 應答造成。病理表現(xiàn)為腸道肌層的afi生長、膠原組織的過度沉積、腸道 固有層、肌層、粘膜下層以及固有肌層和漿膜層內(nèi)間充質(zhì)細胞的過度生長。 肌層的過度生長以及纖維化最終導致腸腔狹窄,是遷延不愈的炎癥性腸病
的共同病理表現(xiàn)[Jolanta B, Pucilowska, Kristen L,, et al， Fibroge nesis IV, Fibrosis and inflanmatory bowel disease, cellular mediators and animal models. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2000,4(279), 653-659]。由于研究方法的局限，目前國內(nèi)關于 腸纖維化發(fā)病機制的研究甚少。
國夕卜資料表明[Lawrance IC, Maxwell L, Doe W, Altered response of intestinal mucosal fibroblasts to profibrogenic cytokines in inflammatory bowel disease, Inflairan Bowel Dis， 2001， 7(3),226-36j Lawrance， Ian Craig, Jfexwell, Lesley, Doe, William, Inflammation Location, But Not Type, Determinses the Increase in TGF-[beta] 1 and IGF-l Expression and Collagen Deposition in IBD Intestine, Inflanm Bo冊l Dis, 2001,7(1), 16-26],成纖維細胞是腸纖維化發(fā)生發(fā)展過程中 的關鍵細胞之一，因此，以腸道成纖維細胞為研究的切入點有可能是發(fā)現(xiàn) 腸纖維化發(fā)病機制的有效途徑。掌握分離培養(yǎng)腸道成纖維細胞的技術(shù)便是 探索腸纖維化機制的關鍵技術(shù)。目前，國內(nèi)尚無相關報道，若按國外文獻 [James G， Simmons, Jolanta B, Pucilowska, IGF—I and TGF- P 1 have distinct effects on phenbtype and proliferation of intestinal fibroblasts. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, ，2002, 283, 809-818; J腿esG, Si咖onsl， Jolanta B， Pucilowska, andP， feyLund， Autocrine paracrine actions of intestinal fibroblast-derived insulin-like growth factors. Am J" Physiol Gastrointest Liver Physiol, 1999 ， 276， 817-827]極力推薦的消化法分離培養(yǎng)結(jié)腸成纖維 細胞(CFB)，其所需消化酶種類多，價格昂貴，操作繁瑣，污染機會較大， 不易普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法，
它可以縮短消化時間，僅用單一的胰蛋白酶節(jié)約成本，減少污染機會。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法，其原
代培養(yǎng)依次包括如下歩驟:a)處死老鼠，剪取5 10cm結(jié)腸,含lOOOUI/ml 青霉素和1000UI/ml鏈霉素的PBS漂洗干凈，其組織塊置75%酒精內(nèi)浸泡 30s; W歩驟a)得到的組織用含1000UI/ml青霉素和1000UI/邁1鏈霉素 的PBS反復漂洗7 10分鐘,取出組織塊置35mm培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS漂洗1-5 分鐘，快速剪成體積為1 3咖3的塊狀；c)置于0.25%胰蛋白酶0.02 %EDTA= 1 : 1的混合消化液中，在5iCft培養(yǎng)箱37C消化6個5 10分 鐘d)棄第1個5 10分鐘的上清液，收集第2 6個5—10分鐘的上清 液于15ml離心管中，加入4ml含10%FBS的DMEM/F-12終止消化，在4 "C , 800rpm離心8分鐘；e)棄上清液，加入4ml含10%FBS的DMEM/F-12 于15邁1離心管中，用滴管反復吹打制備細胞懸液，調(diào)整細胞濃度并接種 于培養(yǎng)板中；f)進行細胞計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度，按1Xl(f lXl(f個 /邁1接種于24孔培養(yǎng)板中，加入含10WI/ml青霉素、100UI/ml鏈霉素及 終濃度為10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液于5紫C仏培養(yǎng)箱371C進行培養(yǎng)。
本發(fā)明的大鼠結(jié)腸成纖維細胞(colonic fibroblast CFB)培養(yǎng)方法， 經(jīng)過反復實驗摸索，將組織塊培養(yǎng)法和消化法的優(yōu)點融合，在國外文獻報 道的基礎上進行改進，探索了消化時間，僅 ^單一的胰蛋白酶，便成功 地研制出大鼠結(jié)腸成纖維細胞的培養(yǎng)方法，不僅節(jié)約了成本，而且能在短 時間內(nèi)獲取大量細胞，減少污染的機會。


下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明做進一步詳細的說明
圖1是本發(fā)明原代培養(yǎng)第13天的正常大鼠結(jié)腸成纖維細胞觀察圖2是本發(fā)明HE染色光鏡下的大鼠結(jié)腸成纖維細胞形態(tài)及生長分化 觀察圖。
具體實施方式
實施例l
大鼠結(jié)腸成纖維細胞的原代培養(yǎng)-
大鼠結(jié)腸成纖維細胞的培養(yǎng)方法包括原代培養(yǎng)過程和傳代培養(yǎng)過程， 本發(fā)明首先從大鼠體內(nèi)分離結(jié)腸組織，按照如下步驟進行原代培養(yǎng)。
1)首先，斷頸法同時處死5只大鼠，用75%的酒精消毒腹部，沿腹部正 中線剖開，剪取自肛門向近端5—10cm的大鼠結(jié)腸，用含1000UI/ml青霉素 和1000UI/ml鏈霉素雙抗的PBS漂洗干凈；2)取出該組織塊，置759&酒精內(nèi) 浸泡30秒鐘；3)重新用含1000UI/ml青霉素和1000UI/邁l鏈霉素雙抗PBS反 復漂洗10mins; 4)取出組織塊置35咖培養(yǎng)皿內(nèi)用不含雙抗的PBS漂洗1 邁ins; 5)取出組織塊，快速用鋒利的眼科剪將組織塊快速剪成體積為l咖3 左右的塊狀；6)置于0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA=1 : 1 (體積比)混合 的消化液中，5%的Ca, 371C的培養(yǎng)箱中消化6個10mins., 7)棄第l個ltoins 的上清液，收集第2-6個l(Mns的上清液于15ml離心管中，加入^d含10M FBS的DMEM/F-12 (Sigma, Hyclone等廠商生產(chǎn)的進口試劑)終止消化，4 "C 、 800rp魂度離心8mins; 8)棄上清液，加入4ml含10MFBS (Sigma, Hyclone等廠商生產(chǎn)的進口試劑)的DMEM/F-12 (Sigma, Hyclone等廠商生 產(chǎn)的進口試劑)于離心管中，用滴管反復吹打制備細胞懸液；9)用細胞計 數(shù)板進行細胞計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度，按lXlQ3個/ml接種于24孔培養(yǎng)板中，
加入含100UI/ml青霉素、100UI/ml鏈霉素雙抗及終濃度為10 % FBS的 DMEM/F-12培養(yǎng)液于5% C02培養(yǎng)箱37。C進行培養(yǎng)。
倒置顯微鏡—卜'可見新接種的原代大鼠結(jié)腸成纖維細胞為圓形單核細 胞，分散懸浮于培養(yǎng)液中，1 2個小時后細胞開始貼壁，12小時后大鼠CFB 大部分貼壁，呈圓形。有較長的潛伏期，大約為3 4天，第5 10天，細胞 開始增殖，形態(tài)以帶突起的三角形、短梭形為主，細胞核明顯。第8 13 天，細胞增殖明顯，形成多個相對獨立的細胞簇，細胞由簇中央向周圍生 長。在細胞密集區(qū)可表現(xiàn)為放射狀、旋渦狀或柵欄狀，有接觸抑制現(xiàn)象， 第13 14天，細胞貼滿瓶壁并連成單層片狀，以短梭形細胞為主。
如圖1所示，原代培養(yǎng)第13天的正常CFB,細胞形態(tài)為梭形、三角 形、不規(guī)則形，其中梭形和不規(guī)則形為多，細胞多排列成放射狀，細胞間 相互貼緊但不會重疊生長；細胞核呈橢圓形，大都位于細胞中央，符合動 物成纖維細胞的基本形態(tài)特征。
實施例2
大鼠結(jié)腸成纖維細胞的傳代培養(yǎng)-
經(jīng)過上述步驟進行原代培養(yǎng)的大鼠CFB,從5iC"培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng) 瓶，在倒置顯微鏡下觀察細胞已長至瓶底的90%時便進行傳代，按照如下 步驟進行傳代培養(yǎng)-
l)棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用不含雙抗的PBS液漂洗2遍；2)往培養(yǎng)瓶 中加入0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA= 1 : 1(體積比)混合的消化液2邁1， 置5%002培養(yǎng)箱371C孵育3-6邁ins,直至在顯微鏡下觀察到貼壁細胞胞質(zhì) 已回縮，細胞間隙增大；3)立即加入4邁1含10駡FBS的D腿SI/F-12終止
消化，收集于15ml離心管中，800rpra離心8mins; 4)棄上淌液， 加入含10%FBS的DMEM/F-12 6ml于離心管中，用滴管反復吹打制備細胞 懸液。
倒置顯微鏡下可見傳代細胞形態(tài)基本一致，細胞在培養(yǎng)液中開始呈圓 形，1 2小時后，大部分細胞貼壁，形態(tài)以多角形為主。12小時后，細 胞完全貼壁。傳代的大鼠CFB潛伏期明顯縮短，一般不超過36h,第2 3d,細胞增殖明顯，核分裂相多見，以三角形、短梭形為主。6 8d,細 胞長滿瓶壁。
實施例3
臺盼藍排斥實驗-
經(jīng)過上述傳代培養(yǎng)的大鼠結(jié)腸成纖維細胞通過臺盼藍排斥實驗檢測 細胞的活力首先，制備單個細胞懸液，并作適當稀釋至約10Vml;其次 進行染色取9滴細胞懸液移入小試管中，加l滴O.鄉(xiāng)臺盼藍溶液，混 勻；混勻之后進行記數(shù)，在3邁ins內(nèi)，用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死 細胞；根據(jù)如下公式計算活細胞率-活細胞率(％)=(活細胞總數(shù)/活細 胞總數(shù)+死細胞總數(shù))X100;其次進行細胞計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度，按l X 105個/邁1接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，用含100UI/邁1青霉素和100UI/邁1鏈 霉素雙抗、10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液于5% CQ2培養(yǎng)箱371C培養(yǎng)，該 方法用臺盼藍排斥試驗檢測細胞活力>95%。
實施例4
大鼠結(jié)腸成纖維細胞的純化
細胞經(jīng)培養(yǎng)3 5天后，觀察CFB生長情況。其長至瓶底的90%時，
用胰酶消化傳代，利用細胞不同貼壁時間來純化CFB。即，依據(jù)成纖維細 胞比上皮細胞貼壁時間短的特點，采用反復貼壁法對CFB進行分離提純。 具體步驟為首先制備單個細胞懸液，接種于25cnf培養(yǎng)瓶，5% (為培養(yǎng) 箱371C培養(yǎng)l 2h后，輕輕倒掉上清液，重新注入培養(yǎng)液，如此反復2 4次，得到了較純的成纖維細胞。 實施例5
大鼠結(jié)腸成纖維細胞的鑒定
下一步需要鑒定大鼠CFB細胞,ft先，要進行細胞蘇木fr^紅(HE) 染色1)將純化好的細胞接種于玻片上，用95%酒精固定30mins; 2)再 用PBS洗2次，每次l邁ins; 3)浸入蘇木精染液，染色5 10mins; 4) 自來水浸洗；5)浸入稀鹽酸酒精溶液進行分色5秒；6)自來水浸洗；7) 浸入淡氨水中，使胞核藍化，3 5mins; 8)自來水浸洗；9)浸入伊紅染 液，染色5 10邁ins; 10)自來水漂洗；11)經(jīng)70%、 80%、 90%酒精各 1次、95%酒精2次和100%酒精3次逐級脫水，每次進行時間為lmins; 12)通過二甲苯3次，每次進行時間為l邁ins; 13)在載玻片上滴加中性 樹膠，將有細胞一面的蓋玻片向下固定于載玻片上。
其次，利用波形蛋白、肌間線蛋白、平滑肌肌動蛋白表達的間接免疫 熒光法鑒定大鼠CFB-步驟如下1)將純化好的細胞接種于玻片上，用 95%酒精固定3toins,再滴加0. Olmol/L, pH7.4的PBS于玻片上，10mins 后棄去，使其保持一定濕度；分別于不同玻片上滴加一抗(以0.Olmol/L, pH7.4的PBS,的抗波形蛋白(l: 50)、鄉(xiāng)間線蛋白(l- 30)、抗平滑 肌肌動蛋白抗體(l: 20))，充分覆蓋玻片，將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37
r保溫60mins;取出玻片，置于玻片架上，先用0. Olmol/L, pH7.4的PBS 漂洗2次,然后按順序過0. Olmol/L,卵7.4的PBS三缸浸泡，每缸5mins， 并不時振蕩；取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一 滴1: 20稀釋度的異硫氰酸熒光素標記的羊抗小鼠球蛋白抗體IgG-FITC; 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37TC保溫3toins;重復操作5;取出玻片， 用濾紙吸去多余水分,滴加甘油緩沖液覆蓋,迅速置于熒光顯微鏡下觀察 并拍照。
蘇木^"^紅(HE)染色光鏡下的大鼠CFB形態(tài)及生長分化特征，如 圖.2所示，大鼠CFB扁平，呈梭形、三角形與不規(guī)則形，其中梭形和不規(guī) 則形為多，細胞多排列成放射狀或柵欄狀，胞質(zhì)著色淺，呈弱嗜堿性，核 較大，卵圓形，可見核仁。其細胞形態(tài)學特征與成纖維細胞相符。
實施例6
利用上述方法培養(yǎng)大鼠CFB，進行結(jié)腸成纖維細胞致腸纖維,制的 研究及艾灸干預IGF-1、 TGF-婦機理研究。
權(quán)利要求
1、一種大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法，其特征在于其大鼠結(jié)腸成纖維細胞原代培養(yǎng)依次包括如下步驟a)處死老鼠，剪取自肛門向近端結(jié)腸5～10cm，含1000UI/ml青霉素和1000UI/ml鏈霉素的PBS漂洗干凈，其組織塊置75％酒精內(nèi)浸泡30s；b)步驟a)得到的組織用含1000UI/ml青霉素和1000UI/ml鏈霉素的PBS反復漂洗7～10分鐘，取出組織塊置35mm培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS漂洗1～5分鐘，快速剪成體積為1～3mm3的塊狀；c)置于0.25％胰蛋白酶∶0.02％EDTA＝1∶1(體積比)的混合消化液中，在5％CO2，37℃條件下消化6個5～10分鐘；d)棄第1個5～10分鐘的上清液，收集第2～6個5～10分鐘的上清液于15ml離心管中，加入5～8ml含10％EBS的DMEM/F-12終止消化，在4℃，800rpm離心8分鐘；e)棄上清液，加入4ml含10％FBS的DMEM/F-12于15ml離心管中，用滴管反復吹打制備細胞懸液，進行細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度并調(diào)整細胞濃度，按1×105～1×106個/ml接種于24孔培養(yǎng)板中；f)加入含100UI/ml青霉素、100UI/ml鏈霉素及終濃度為10％FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
2、 如權(quán)利要求1所述的大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法，其特征在于 所述步驟a)中，用斷頸法處死老鼠，用75%的酒精消毒腹部，沿腹部正 中線剖開，自肛門向近端剪取結(jié)腸。
3、 如權(quán)利要求1所述的大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法，其特征在于 所述步驟e)川細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度，按1X105 1X 1(f個/ml接種于24孔培養(yǎng)板中。
4、如權(quán)利要求1所述的大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法，其特征在于-所述步驟f)的培養(yǎng)的優(yōu)選條件為在5%C" , 371C條件下進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大鼠結(jié)腸成纖維細胞培養(yǎng)方法，其原代細胞培養(yǎng)包括如下步驟，首先分離結(jié)腸組織之后，用含1000UI/ml青霉素和1000UI/ml鏈霉素的PBS漂洗，剪成塊狀，置于0.25％胰蛋白酶∶0.02％EDTA＝1∶1的混合消化液中進行消化，收集上清液終止消化、進行離心，離心之后棄上清液，加入培養(yǎng)液于離心管中，制備細胞懸液，調(diào)整細胞濃度并接種于培養(yǎng)板中。本發(fā)明所需的消化酶單一，操作簡單能在短時間內(nèi)獲取大量細胞并污染機會小。
文檔編號C12N5/071GK101353642SQ20071009398
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日
發(fā)明者劉慧榮, 吳煥淦, 彬 江, 王曉梅, 譚琳鎣 申請人:上海市針灸經(jīng)絡研究所;上海中醫(yī)藥大學