專利名稱：：用于乳腺癌預后的基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及乳腺癌的預后，尤其涉及一組用于乳腺癌預后的基因及其應用。
背景技術：
：乳腺癌(mammarycarcinoma)是女性最主要的惡性腫瘤，全國乳腺癌發(fā)病率以每年3%的比率遞增，成為發(fā)病率增長最快的腫瘤。滬、京、津及沿海地區(qū)是我國乳腺癌的高發(fā)地區(qū)。以上海為例，過去30年間，上海乳腺癌發(fā)病率從17.7/10萬上升至61/10萬，列各類女性腫瘤發(fā)病的首位，即每6名女性癌癥患者中就有一位是乳腺癌。僅上海市腫瘤醫(yī)院的乳腺癌手術量，已從過去每一年不足70例，猛增至今年的每個月差不多120例。乳腺癌術后經(jīng)系統(tǒng)的化療或放療或內分泌治療等療法，可以獲得臨床緩解。有些患者在治療后可以恢復正常生活及工作，但有些患者術后一段時間甚至若干年后，又出現(xiàn)腫瘤復發(fā)或轉移，其中一部分經(jīng)再次手術及化療，又可帶瘤生存很長時間，而另一部分則可能死于腫瘤。因此，根據(jù)個體差異來選擇合適的治療乳腺癌的方法并有效地預防其復發(fā)，是乳腺癌治療中待解決的最重要問題之一。由于乳腺癌的直接病因到現(xiàn)在仍未明了，引起乳腺癌復發(fā)的直接原因也不清楚，因此防止乳腺癌復發(fā)存在一定的困難，也就是說，人們不知道它是怎么引起的復發(fā)，也就無法防止其發(fā)生復發(fā)或阻斷其復發(fā)的某一環(huán)節(jié)。盡管如此，通過各種研究手段和臨床證明，人們還是發(fā)現(xiàn)了一些與乳腺癌預后相關的因子，如ER和HER-2。ER檢測已成為患者內分泌治療選擇與否的重要條件，而HER-2檢測更成為是否選用赫賽汀單抗治療復發(fā)轉移性乳腺癌的必要條件。經(jīng)典預后和個體化治療指標是患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、組織學類型、腋淋巴結和激素受體狀況等"傳統(tǒng)指標"，但乳腺癌是一個具有極大異質性的復雜的系統(tǒng)性疾病，即使是上述指標完全相同的患者，其預后也可能顯著不同。顯然目前使用的臨床、病理學指標仍無法準確預測乳腺癌患者復雜的預后情況，因而需要尋找更多與乳腺癌預后相關的因子。目前，臨床上對乳腺癌患者進行預后的判斷依據(jù)主要是根據(jù)免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等技術的結果，但對乳腺癌患者進行預后的指標往往不止一個，需要進行很多次實驗，費時費力，而且仍無法準確預測乳腺癌患者復雜的預后情況。由于腫瘤的發(fā)生和進展是在全基因組水平發(fā)生的多基因相關的疾病，利用基因芯片對乳腺癌相關基因表達模式可以再分類(分子分型)、疾病預后、預測對治療的反應以及尋找治療的較佳耙點及對應藥物。利用基因芯片技術，國外對乳腺癌預后基因的篩選進行了很多的研究和產(chǎn)品開發(fā)。例如，比利時的Lacroix等在2002年制備了含250個乳腺癌分型相關基因的低密度表達譜芯片，并申請了專利；2002年Merck公司首先應用基因芯片技術建立包含70個基因的能準確進行乳腺癌患者預后的基因表達譜MammaPrint,該基因芯片在2007年2月獲得美國FDA的批準；幾乎同時荷蘭另一研究組開發(fā)出包含76個基因的預測患者預后"Rotterdamsignature"。上述研究綜述均基于歐洲和美國若干研究機構和醫(yī)藥公司對乳腺癌患者的大型實驗和臨床檢驗的權威研究報告。因各國地理環(huán)境、生活習慣的不同，乳腺癌的發(fā)病率有很大差異。鑒于我國乳腺癌發(fā)病的特點，以及人類種族之間存在差異的可能性，國外已有的基因表達譜數(shù)據(jù)在我國乳腺癌患者中的表達情況以及其與預后、個體化治療的關系是否與國外報道一致尚需驗證。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一組用于乳腺癌預后的基因，能對中國人群的乳腺癌患者在手術后5年內復發(fā)和不復發(fā)的情況進行預后和分類，以便及時地進行干預，有效指導臨床治療。本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種用于乳腺癌預后的基因芯片。本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供一種用于乳腺癌預后的試劑盒。本發(fā)明要解決的技術問題之四是提供本發(fā)明用于乳腺癌預后的基因的應用。為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一組用于乳腺癌預后的基因，至少包括SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示核苷酸序列中的一個或兩個以上基因。較佳地，所述用于乳腺癌預后的基因，至少包括SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示核苷酸序列中兩個以上基因。更佳地，所述用于乳腺癌預后的基因，包括SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示核苷酸序列的基因。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于乳腺癌預后的基因芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示基因序列和/或其互補序列進行雜交。較佳地，所述探針包括下列核苷酸序列之一(1)SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列;(2)SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列中每條序列的互補鏈;(3)與SEQIDNo.24SEQIDNo,47所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。更佳地，所述探針包括SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于乳腺癌預后的試劑盒，包含與SEQIDNo.1SEQIDNo.23中至少一個基因序列進行雜交的探針。在本發(fā)明的另一方面，還提供了本發(fā)明的一組基因在乳腺癌預后中的應用，它是通過檢測SEQIDNo.1SEQIDNo.23所示序列的基因的表達變化，對乳腺癌患者術后復發(fā)與不復發(fā)進行分類。所述檢測基因的表達變化采用包括基因芯片的方法。本發(fā)明用于乳腺癌預后的基因，通過分子雜交手段，對乳腺癌組織樣本中該些基因的表達改變狀況進行檢測，從而對中國人群的乳腺癌患者在手術后5年內復發(fā)和不復發(fā)的情況進行準確預后和分類，有效及時地指導臨床用藥。下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明通過訓練組篩選出的23個基因的聚類分析圖；圖2是本發(fā)明驗證組的聚類分析圖。具體實施例方式實施例l樣本的選擇和分組所用乳腺癌組織樣本取自2002年4月至2004年12月復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科收治的乳腺癌患者。其中髓樣癌2例，粘液腺癌2例，浸潤性小葉癌3例，余均為浸潤性導管癌。將病例分為兩組一組為訓練組，共有65例，用于篩選可預后乳腺癌患者復發(fā)轉移的基因表達譜。另一組為驗證組，共有39例，用于驗證基因表達譜的預后效果。隨訪62.5個月，訓練組有29例出現(xiàn)復發(fā)或轉移，驗證組有17例出現(xiàn)復發(fā)或轉移。每一病例取原發(fā)癌組織，并經(jīng)病理組織學證實癌細胞達50%以上。實施例2基因表達譜實驗(1)寡核苷酸探針的設計與合成選取了248個可能與乳腺癌預后相關的基因，使用ArrayDesigner4.1軟件對這些基因進行探針設計，探針主要位于3'端。合成時需用氨基修飾。(2)芯片的制作合成的探針用滅菌的MiliQ水配成100一的濃度，點樣前用200mM、pH7.4的含0.02%SDS的PB溶液稀釋成25pmol/|il,分別排列到384孔板中?；靹蚝?500rpm離心5min。將稀釋好的探針點于玻璃基片之上，UV固定2min。37。C放置在濕盒中過夜，放于干燥處備用。(3)乳腺癌樣本總RNA抽提1)每lOOmg組織樣本加入lmLTrizol，采用電動勻漿器充分打碎組織塊。2)加入約l/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。3)4°C,12,OOOrpm離心15分鐘后小心取出上清液，將上清液轉入新的1.5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置5分鐘(15mL離心管用7，500rpm離心20分鐘)。4)4°C,12，000rpm離心IO分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70%乙醇，4°C，12,OOOrpm離心洗滌沉淀15分鐘(15ml離心管用7，500rpm離心20分鐘)。5)去上清，沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶的水充分溶解沉淀，測定0026。和0D2柳值。6)跑RNA電泳，看有無降解，并且28S的亮度要在18S兩倍以上。(4)總RNA的純化如果總RNA的純度不高，會影響探針的標記效率和芯片雜交結果，因此使用QIAGENRNeasyMiniKit純化總RNA。(5)熒光標記cRNA合成采用低RNA投入線性擴增試劑盒(Agilent)進行，方法參照試劑盒說明書。(6)熒光標記cRNA探針濃度及插入率計算癌組織用Cy3熒光標記，在552nm處測吸光值Abs，再用Abs值除以0.15計算濃度；正常組織用Cy5熒光標記，在650nm處測吸光值Abs，再用Abs值除以0.25計算濃度。(7)芯片雜交1)取出經(jīng)定量的Cy3和Cy5標記的探針，癌Cy3取出80pmo1,正Cy5取出60pmo1,混合后濃縮到4pL。2)濃縮后加入的片斷化試劑，置于94'CPCR儀中保溫15min。同時配制雜交液。3)雜交液的配方如下20XSSC(pH7.0)6)alHumanCot-1DNA5plPolyA80(l嗎/nl)2^12MHEPES1^12.5%SDS2pl無Rnase酶的7JC4^1總體積2(^14)待片斷化反應結束后，加入相同體積的雜交液，混勻后，滴加于5(TC預熱的芯片上，蓋上蓋玻片(50。C預熱)。迅速放入預熱過的雜交盒中，用膠帶封閉，放入溫箱中，5(TC雜交過夜。5)芯片洗滌分別用溶液i、n、ni進行洗滌。洗液配方見表l。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>雜交結束后，用鑷子取出片子，浸入洗液中按照上述順序依次洗滌，上下抽動片子數(shù)次。最后用DEPC水，洗滌12min，1500rpm離心5min，之后用GenePix4000B芯片掃描儀進行掃描。(8)數(shù)據(jù)處理經(jīng)GenePix4000B芯片掃描儀進行掃描，每個探針作為獨立的基因進行處理，選用R軟件包中的marray軟件對數(shù)據(jù)進行標準化，SAM軟件進行數(shù)據(jù)的篩查，選用Cluster3.0軟件進行樣本的層次聚類分析。在聚類之前，利用SAM軟件，每個基因的表達水平在癌患病人和正常組織樣本中相差2倍以上的被篩查出來，基因表達比值經(jīng)對數(shù)(log2)轉化后，對復發(fā)、轉移組與無復發(fā)、轉移組的基因表達值進行獨立樣本t檢驗，依據(jù)p值從小到大排序，選擇P〈0.05的基因。(9)結果基于特異性標志基因組成的基因表達譜對訓練組65例乳腺癌患者進行篩查，篩選出23個基因(SEQIDNo.1SEQIDNo.23)，該23個基因名稱見表2，針對該23個基因設計的探針為SEQIDNo.24SEQIDNo.47所示序列(見表3或序列表)，該23個基因的聚類分析結果如圖l所示。在圖1中，最上方是聚類樹狀圖，可以看出復發(fā)、轉移的樣本和無復發(fā)、轉移的樣本各自聚成一類，說明這23個基因可以很好地把乳腺癌術后復發(fā)和不復發(fā)樣本區(qū)分開，聚類樹狀圖下面是樣本編號，右列是本發(fā)明探針所針對的該23個差異基因的名稱，其中，PGR、PR-1是針對PGR基因的兩條探針，再下面是表達圖譜，紅色表示基因上調(相對于該基因的平均數(shù))，綠色表示下調，黑色表示未變化，灰色表示數(shù)據(jù)缺失。由圖1可知，訓練組中，復發(fā)、轉移的29個患者中有24個被準確分類(正確率為82.76%)。圖2為驗證組的聚類分析圖，該圖的分析結果表明，在驗證組的39例患者中，復發(fā)、轉移的17個患者中有14個被準確分類(正確率為82.35%)，該驗證結果說明本發(fā)明的23個基因能對中國人群的乳腺癌患者術后復發(fā)情況作出較為準確的預測。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序歹i」表<110〉上海華冠生物芯片有限公司〈120〉用于乳腺癌預后的基因及其應用<130〉NP-07-11767<160〉47<170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉2731<212〉腿<213〉Homosapiens<400〉1<sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage11</sequence>tgtggccaggggtgctcctgtgctcaccctctcttggtgcatttttttggaagaataaaa2700ttgcctctctcttaaaaaaaaaaaaaaaaaa2731〈210〉2<211〉1722〈212〉DNA〈213〉Homosapiens〈400〉2gggattttcattactcg肌gagg3ttgtttttgt犯cgcctcttggtgtattttcaacgccfitctttgtggcttccgctcactgtcttgcaactaagtgtctgg犯aaaaatctaccccgaggtgctggccgcccgacgagaaagccgggctgccaccgagcgcgcacgccctgC3ag3tcg鄧gacctactccgaacactgcccccctgccgcgccccgtgctcaaaccttccgctgccaggccgttgagtgatccagccagcatatatatctgCt鄉(xiāng)犯8Lgccctcctccgggtggc咖gtttttaatttacctgttctgagattttaagtccactgcattttttcccctcgtgcacctggggacctgctccgggggccc犯鄉(xiāng)gggcgtatgcggggcgccctctccaggctgctgcatgcgcccaggctgcacggcc3g3g3CtCCCccc犯gatct犯ggaccgcacacccccggaagacacatgggtgtacctgccgtggccgcaatggagtacgtgcgtcccccgcctccctccatcta/tttgaagctgcaaagttttcacccttggg柳犯3cttgatttcacggcgccgcgccgatctcatgcgctgccctcgcaggcaccctgctctacctcttggcccc￡LCt￡l3g3ga￡lcggccc卿gtgtgcccccctgacctgcgcggctgcgctggcggggmggtgagcacgatccggcccaatcatctctgcaggcttccctcc犯ttgtgaagcgtggcatttg3Cgggg3cccaacctttaccccaggacggaaaa犯aacagtgtgggctctccggactgaggtgttagacattttctccaccgctggcaaagataaattatttcggtgcccgctcagggcttcccccaccagccctcctgccagaaattttatccctggatggtgttgcctgggctcccagccccctgcctggccgagcctcccccggcctcaacgaaggagcccaccaceLca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