專(zhuān)利名稱(chēng)：一種非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型dna探針的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，具體涉及一種非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
探針技術(shù)是生物芯片技術(shù)的核心。發(fā)夾型DNA探針是根據(jù)核酸堿基配對(duì)原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluores-cence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)現(xiàn)象設(shè)計(jì)，空間結(jié)構(gòu)上呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。其中，環(huán)序列是與靶核酸互補(bǔ)的探針；莖臂是由與靶序列無(wú)關(guān)的互補(bǔ)序列構(gòu)成；莖的兩端分別連上一個(gè)熒光分子和一個(gè)淬滅分子。當(dāng)有靶序列存在時(shí)，分子信標(biāo)的環(huán)序列與靶序列特異性結(jié)合，熒光分子發(fā)出的熒光不能被淬滅分子吸收，可檢測(cè)到熒光。與常規(guī)核酸探針相比，發(fā)夾型DNA探針的優(yōu)勢(shì)明顯具有高特異性、高靈敏度、液相雜交檢測(cè)效率高、可實(shí)現(xiàn)核酸的大規(guī)模自動(dòng)化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。在用于核酸分子檢測(cè)的基因芯片領(lǐng)域，目前使用最廣泛的DNA探針主要是寡核苷酸探針Oligo、cDNA探針等。發(fā)夾型DNA探針具有上述諸多其他DNA探針難以具備的優(yōu)勢(shì)，但由于受分子結(jié)構(gòu)的限制，目前發(fā)夾型DNA探針在芯片領(lǐng)域的運(yùn)用幾乎為空白，其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測(cè)效率高等優(yōu)勢(shì)在芯片領(lǐng)域難以得到有效發(fā)揮。為此國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者重點(diǎn)研究怎樣解決發(fā)夾型DNA探針在芯片表面的固定問(wèn)題。但通常都是在發(fā)夾型DNA探針的莖結(jié)構(gòu)修飾上作主研究方向，最常見(jiàn)的是修飾生物素-親和素(biotin-avidin)。其中生物素(biotin)修飾到發(fā)夾型DNA探針的莖臂，親和素(avidin)固定到芯片表面，通過(guò)生物素-親和素(biotin-avidin)之間的結(jié)合力固定發(fā)夾型DNA探針，這種修飾生物素-親和素的發(fā)夾型DNA探針有兩個(gè)主要弱點(diǎn)1、發(fā)夾型DNA探針莖結(jié)構(gòu)的修飾技術(shù)有相當(dāng)難度(國(guó)內(nèi)目前還未見(jiàn)報(bào)道)2、莖臂修飾生物素(biotin)發(fā)夾型DNA探針與芯片表面親和素(avidin)結(jié)合無(wú)特異性對(duì)中、高密度芯片難以做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”。發(fā)夾型DNA探針的優(yōu)勢(shì)在于“液-液相雜交”時(shí)的高特異性和高靈敏性即發(fā)夾型DNA探針與靶序列先在試管里高特異/高靈敏雜交，復(fù)合體再與芯片表面的“探針”(親和素avidin)結(jié)合；由于生物素-親和素(biotin-avidin)結(jié)合方式無(wú)特異性，同樣固定在芯片表面的親和素(avidin)無(wú)特異性，從而導(dǎo)致多樣本靶序列與特異性發(fā)夾型DNA探針雜交體在與芯片表面的親和素(avitin)結(jié)合時(shí)無(wú)特異性，這種無(wú)特異性的芯片結(jié)合使得發(fā)夾型DNA探針對(duì)中、高密度芯片難以做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”。芯片雜交時(shí)是整張芯片表面所有位點(diǎn)同時(shí)浸沒(méi)在雜交液中，依靠探針與靶序列的特異性識(shí)別保證多樣本檢測(cè)的特異性“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”。由于生物素-親和素(biotin-avidin)結(jié)合方式無(wú)特異性，修飾在發(fā)夾探針莖臂上的生物素與固定在芯片表面的親和素之間結(jié)合無(wú)特異性，這種無(wú)特異性的芯片結(jié)合導(dǎo)致所有靶序列樣本都可與芯片表面所有位點(diǎn)結(jié)合，從而引起混亂無(wú)法區(qū)分使用。盡管可以先把特異性發(fā)夾探針?lè)珠_(kāi)點(diǎn)樣固定在芯片表面，依靠特異堿基匹配與多樣本靶序列特異性雜交，但這種雜交成為了“液-固相”雜交，其弊端一是雜交效率非常低；二是不能充分發(fā)揮發(fā)夾探針的“液-液相雜交”高效率、高靈敏及特異的優(yōu)勢(shì)，從而極大地限制了發(fā)夾探針在芯片領(lǐng)域的運(yùn)用。傳統(tǒng)莖臂修飾發(fā)夾型DNA探針由于無(wú)法保證雜交特異性，在高密度芯片領(lǐng)域幾乎無(wú)法實(shí)際使用。由于這兩大技術(shù)缺陷的存在從而極大地限制了發(fā)夾型DNA探針在芯片領(lǐng)域的運(yùn)用。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，更充分發(fā)揮發(fā)夾型DNA探針的優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明提供一種更容易固定在芯片表面的、對(duì)中、高密度芯片可以“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)根據(jù)要檢測(cè)的目標(biāo)序列，構(gòu)建非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的A段堿基序列，其中A段序列是與靶序列匹配堿基序列，A段堿基序列作為環(huán)序列的一部分；(2)構(gòu)建非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的B段堿基序列，其中B段堿基序列是與固定在芯片表面的Oligo DNA探針匹配的堿基序列，B段堿基序列一部分與A段堿基序列共同構(gòu)成非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的整個(gè)環(huán)序列，B段堿基序列的另一部分作為莖臂與淬滅分子或者熒光分子相連；(3)構(gòu)建非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的C段堿基序列，其中C段堿基序列與B段堿基序列的莖臂部分的堿基序列互補(bǔ)，C段堿基序列一端與A段堿基序列相連，另一端與B段堿基序列相對(duì)應(yīng)地與熒光分子或者淬滅分子相連；(4)將上述A、B、C段堿基序列組合，再經(jīng)軟件驗(yàn)證不會(huì)形成除發(fā)夾結(jié)構(gòu)外的其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，并經(jīng)genbank比對(duì)后即完成非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針構(gòu)建。
本發(fā)明的構(gòu)建方法，在步驟(2)所述B段堿基序列一部分與A段堿基序列共同構(gòu)成非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的整個(gè)環(huán)序列中，優(yōu)選為其中A段堿基序列的長(zhǎng)度大于整個(gè)環(huán)序列長(zhǎng)度的2/3并且小于整個(gè)環(huán)序列的長(zhǎng)度。
因?yàn)楸景l(fā)明的方法所構(gòu)建的發(fā)夾型DNA探針的環(huán)序列大部分(＞2/3)與靶序列匹配、小部分(＜1/3)與部分寡核苷酸探針匹配，故命名為非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針。(傳統(tǒng)的發(fā)夾型DNA探針是整個(gè)環(huán)序列與靶序列完全匹配。)本發(fā)明所述的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針構(gòu)建方法將A段堿基序列設(shè)計(jì)為與靶序列完全匹配的堿基序列，是為了在應(yīng)用中利用該段與靶序列的雜交來(lái)檢測(cè)靶序列是否存在。
本發(fā)明所述的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針構(gòu)建方法對(duì)B段堿基序列的設(shè)計(jì)是出于固定的需要。B段堿基序列設(shè)計(jì)成與固定在芯片表面的Oligo DNA探針匹配的堿基序列，通過(guò)B段堿基序列與固定在芯片表面的Oligo DNA探針的雜交，將非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針固定在芯片上。
在對(duì)多樣本靶序列檢測(cè)時(shí)，所述步驟(2)所述B段堿基序列可根據(jù)需要設(shè)計(jì)不同序列和不同長(zhǎng)度。這種設(shè)計(jì)是為了使B段與固定在芯片表面的Oligo DNA探針進(jìn)行特異性雜交，從而對(duì)中、高密度芯片也能做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”。
本發(fā)明相比于現(xiàn)有的發(fā)夾型DNA探針技術(shù)，具有以下有益效果及優(yōu)點(diǎn)(1)保持了發(fā)夾型DNA探針原有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不需做任何修飾或改動(dòng)，技術(shù)難度低，容易操作；(2)陽(yáng)性——陰性熒光信號(hào)差異巨大，非常便于結(jié)果判斷。液相中本發(fā)明的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針與靶序列雜交后莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，暴露出能與芯片表面寡核苷酸探針匹配的堿基序列，然后非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針——靶序列雜交體與芯片表面寡核苷酸探針雜交。由于只有打開(kāi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針——靶序列雜交體(陽(yáng)性產(chǎn)物)才能結(jié)合到芯片表面，未打開(kāi)的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針(陰性對(duì)照無(wú)靶序列，莖環(huán)結(jié)構(gòu)未打開(kāi))不能結(jié)合到芯片表面，沖洗掉游離的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針，檢測(cè)熒光信號(hào)時(shí)陰性對(duì)照熒光背景非常低甚至沒(méi)有熒光背景，陽(yáng)性——陰性熒光信號(hào)差異較之其他發(fā)夾型DNA探針芯片檢測(cè)更為明顯，更利于對(duì)陽(yáng)性——陰性結(jié)果的判斷。其他發(fā)夾型DNA探針的陰性對(duì)照盡管發(fā)夾莖環(huán)未打開(kāi)，但由于結(jié)合在芯片表面發(fā)夾型DNA探針?biāo)鶐晒夥肿拥拇嬖谌杂袩晒獗尘?，干擾性很強(qiáng)。
(3)本發(fā)明的探針還保證發(fā)夾型DNA探針與芯片結(jié)合時(shí)的特異性，對(duì)中、高密度芯片可以做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”。B段(即與芯片探針匹配的堿基序列)可根據(jù)需要(對(duì)多樣本靶序列)設(shè)計(jì)為不同序列和不同長(zhǎng)度，另外設(shè)計(jì)一段與芯片探針匹配堿基序列完全互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸探針Oligo固定在芯片表面，如此，芯片探針匹配堿基序列與固定在芯片表面的寡核苷酸探針依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行特異性雜交，對(duì)中、高密度芯片也同樣可以做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”。
(4)本發(fā)明繞開(kāi)國(guó)內(nèi)外學(xué)者為解決發(fā)夾型DNA探針在芯片表面的固定難題而在探針莖臂修飾上作主研方向的思路，在內(nèi)環(huán)設(shè)計(jì)上突破，在保證了發(fā)夾型DNA探針與芯片結(jié)合時(shí)的特異性(對(duì)中、高密度芯片可以做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”)同時(shí)，較好地解決了發(fā)夾型DNA探針在芯片表面的固定難題?？朔碎L(zhǎng)久以來(lái)發(fā)夾型DNA探針在芯片領(lǐng)域運(yùn)用受到極大限制的痼疾，使其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測(cè)效率高、大規(guī)模自動(dòng)化檢測(cè)等獨(dú)有技術(shù)優(yōu)勢(shì)在生物芯片領(lǐng)域得到充分發(fā)揮。


圖1是莖臂修飾生物素的傳統(tǒng)發(fā)夾型DNA探針的性能示意圖。
圖2是本發(fā)明方法構(gòu)建的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是本發(fā)明方法構(gòu)建的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的性能示意圖。
圖4是應(yīng)用該方法實(shí)際檢測(cè)結(jié)核桿菌芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合本發(fā)明的一些具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
實(shí)施例1本發(fā)明方法所構(gòu)建的探針圖2是本發(fā)明方法構(gòu)建的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針結(jié)構(gòu)示意圖，是針對(duì)如該圖中所示的靶序列所構(gòu)建，由圖2可見(jiàn)，非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的A段與靶序列匹配，B段與固定在芯片表面的Oligo DNA探針匹配。B段堿基序列一部分與A段堿基序列共同構(gòu)成非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的整個(gè)環(huán)序列，B段堿基序列的另一部分作為莖臂與淬滅分子相連；其中C段堿基序列與B段堿基序列的莖臂部分的堿基序列互補(bǔ)，C段堿基序列一端與A段堿基序列相連，另一端熒光分子相連；實(shí)施例2靈敏性試驗(yàn)以不同濃度靶序列做靈敏性試驗(yàn)，先觀察第一組10mg/l、5mg/l、1mg/l；第二組500ug/l、100ug/l、10ug/l、1ug/l；、第三組500pg/l、100pg/l、10pg/l、1pg/l等不同濃度組別靶序列與預(yù)先設(shè)計(jì)好的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針雜交后，在芯片掃描儀上觀測(cè)熒光強(qiáng)度，確定檢測(cè)的最低濃度組別單位(mg\ug\pg)，再往下作某一濃度組別單位的精確濃度靈敏性試驗(yàn)，如pg級(jí)500pg/l、400pg/l、300pg/l、100pg/l、50pg/l、40pg/l、30pg/l、20pg/l、10pg/l…試驗(yàn)結(jié)果在芯片掃描儀上觀測(cè)熒光強(qiáng)度最低濃度與陰性對(duì)照熒光具有明顯區(qū)別。(一般以陽(yáng)性熒光/陰性熒光≥1.5為判斷標(biāo)準(zhǔn))說(shuō)明本發(fā)明的方法構(gòu)建的探針具有高靈敏性。
實(shí)施例3特異性試驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)好靶序列及對(duì)應(yīng)非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針，另外設(shè)計(jì)合成10條與預(yù)先設(shè)計(jì)好的靶序列及非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針無(wú)關(guān)的干擾序列(經(jīng)比對(duì)證明不能雜交結(jié)合)，在雜交條件固定情況下分別與特異性非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針雜交，在芯片掃描儀上觀測(cè)熒光，比較特異性靶序列和無(wú)關(guān)干擾序列與特異探針雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)弱。試驗(yàn)結(jié)果特異性靶序列與特異性非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針雜交熒光信號(hào)強(qiáng)，而無(wú)關(guān)干擾序列與特異探針無(wú)雜交，帶熒光分子的探針被沖洗掉，熒光背境信號(hào)非常弱。說(shuō)明非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針較之其他探針具有非特異雜交干擾小，熒光背境低的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
圖1是莖臂修飾生物素的傳統(tǒng)發(fā)夾型DNA探針的性能示意圖，由圖1可以看出，莖臂修飾生物素的傳統(tǒng)發(fā)夾型DNA探針與芯片表面親和素(avidin)結(jié)合無(wú)特異性，因此對(duì)中、高密度芯片難以做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”(即無(wú)法對(duì)多樣本目標(biāo)進(jìn)行特異性識(shí)別)；圖3是本發(fā)明方法設(shè)計(jì)的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的性能示意圖，由圖3可以看出，本發(fā)明方法設(shè)計(jì)的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針由于對(duì)發(fā)夾型DNA探針設(shè)計(jì)了非對(duì)稱(chēng)環(huán)的模式，保證了發(fā)夾型DNA探針與芯片結(jié)合時(shí)的特異性(對(duì)中、高密度芯片可以做到“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)雜交”)同時(shí)，較好地解決了發(fā)夾型DNA探針在芯片表面的固定問(wèn)題。由二者對(duì)比可見(jiàn)，本發(fā)明方法設(shè)計(jì)的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針，其性能明顯優(yōu)于莖臂修飾生物素的傳統(tǒng)發(fā)夾型DNA探針的性能。
實(shí)施例4本發(fā)明的探針能進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)的試驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)好針對(duì)某病原體(如乙型肝炎病毒HBV)特異片段的靶序列及對(duì)應(yīng)非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針，收集臨床相應(yīng)某病原菌標(biāo)本(如HBV)若干(＞200份)，標(biāo)本處理后分別與對(duì)應(yīng)探針雜交，觀察雜交的熒光信號(hào)，設(shè)陰性對(duì)照，從而證明該探針能大規(guī)模進(jìn)行臨床檢測(cè)。
芯片表面高密度點(diǎn)樣，一份樣本雙份點(diǎn)樣，統(tǒng)一設(shè)陰性對(duì)照，雜交沖洗后，熒光掃描儀下掃描，以陽(yáng)性熒光/陰性熒光≥1.5為判斷標(biāo)準(zhǔn)(以?xún)x器軟件分析)。
實(shí)施例5本發(fā)明的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針設(shè)計(jì)方法及其在對(duì)結(jié)核桿菌基因檢測(cè)上的應(yīng)用步驟一針對(duì)結(jié)核桿菌保守序列IS986通過(guò)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)靶序列(1)下表中間為擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物為245bp(加粗)，兩端為擴(kuò)增引物(字下加線表示)Primer15’-CGTGAGGGATCGAGGTGGC-3’Primer25’-GCGTAGGCTCGGTGACAAA-3’ (2)針對(duì)中間245bp擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)軟件(Beacon Designer)設(shè)計(jì)靶序列上表774-797中斜體文字表示 步驟二設(shè)計(jì)A段堿基序列即以上靶序列的對(duì)應(yīng)互補(bǔ)序列5’-CTGGTGGTCCGAAGCGGcGCTGGA-3’步驟三設(shè)計(jì)B段堿基序列和另外一段與3’端部分B段堿基序列互補(bǔ)的莖臂堿基序列，及與B段堿基序列互補(bǔ)的Oligo，并經(jīng)genebank和DNA star軟件證實(shí)并保證特異性。
B段堿基序列5’-ATGGACTCATCATGGC-3’互補(bǔ)的莖臂堿基序列5’-GCCATG-3’Oligo5’-GCCATGAGTCCAT-3’步驟四選擇M-DABCYL為熒光-淬滅分子對(duì)，在DNA合成儀上(如ABI394高通量DNA合成儀)合成上述針對(duì)結(jié)核桿菌保守序列IS986非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針及Oligo(氨基修飾在5’端)。
結(jié)核桿菌保守序列IS986非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針FAM-5’-GCCATGCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGAATGGACTCATCATGGC-3’-DABCYLOligo氨基-5’-GCCATGAGTCCAT-3’步驟五然后按芯片實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法進(jìn)行擴(kuò)增、純化、雜交、芯片沖洗掃描和進(jìn)行熒光信號(hào)數(shù)據(jù)分析。
分析結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4可見(jiàn)陽(yáng)性熒光信號(hào)較之陰性信號(hào)區(qū)別非常明顯，說(shuō)明該發(fā)明的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針效果非常明顯，完全能夠投入芯片領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法，其特征是，包括以下步驟(1)根據(jù)要檢測(cè)的目標(biāo)序列，構(gòu)建非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的A段堿基序列，其中A段序列是與靶序列匹配堿基序列，A段堿基序列作為環(huán)序列的一部分；(2)構(gòu)建非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的B段堿基序列，其中B段堿基序列是與固定在芯片表面的Oligo DNA探針匹配的堿基序列，B段堿基序列一部分與A段堿基序列共同構(gòu)成非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的整個(gè)環(huán)序列，B段堿基序列的另一部分作為莖臂與淬滅分子或者熒光分子相連；(3)構(gòu)建非對(duì)稱(chēng)發(fā)夾型DNA探針的C段堿基序列，其中C段堿基序列與B段堿基序列的莖臂部分的堿基序列互補(bǔ)，C段堿基序列一端與A段堿基序列相連，另一端與B段堿基序列相對(duì)應(yīng)地與熒光分子或者淬滅分子相連；(4)將上述A、B、C段堿基序列組合，再經(jīng)軟件驗(yàn)證不會(huì)形成除發(fā)夾結(jié)構(gòu)外的其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，并經(jīng)genbank比對(duì)后即完成非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針設(shè)計(jì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法，其特征是，在對(duì)多樣本靶序列檢測(cè)時(shí)，所述步驟(2)所述B段堿基序列可根據(jù)需要設(shè)計(jì)不同序列和不同長(zhǎng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法，其特征是，在步驟(3)組合后的發(fā)夾型DNA探針中，其中A段堿基序列的長(zhǎng)度大于整個(gè)環(huán)序列長(zhǎng)度的2/3并且小于整個(gè)環(huán)序列長(zhǎng)度。
4.權(quán)利要求1所述的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法在基因檢測(cè)方面的應(yīng)用，其特征是，根據(jù)待檢目標(biāo)，運(yùn)用所述方法構(gòu)建對(duì)應(yīng)的非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針，然后按常規(guī)的芯片實(shí)驗(yàn)方法對(duì)待檢目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，具體涉及一種非對(duì)稱(chēng)環(huán)發(fā)夾型DNA探針的構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明所述的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)根據(jù)要檢測(cè)的目標(biāo)序列，構(gòu)建與靶序列匹配的堿基序列A段；(2)構(gòu)建與固定在芯片表面的Oligo DNA探針匹配的堿基序列B段；(3)構(gòu)建C段堿基序列，其中C段堿基序列與B段堿基序列的莖臂部分的堿基序列互補(bǔ)；(4)將上述A、B、C段堿基序列組合。本發(fā)明繞開(kāi)國(guó)內(nèi)外學(xué)者為解決發(fā)夾型DNA探針在芯片表面的固定難題而在內(nèi)環(huán)設(shè)計(jì)上突破，在保證了發(fā)夾型DNA探針與芯片結(jié)合時(shí)的特異性的同時(shí)，較好地解決了發(fā)夾型DNA探針在芯片表面的固定難題。使其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測(cè)效率高、大規(guī)模自動(dòng)化檢測(cè)等獨(dú)有技術(shù)優(yōu)勢(shì)在生物芯片領(lǐng)域得到充分發(fā)揮。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101050475SQ20071009825
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者陳慶海, 府偉靈, 匡紅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 被以下專(zhuān)利引用 (1),