專利名稱：一種測定核糖核酸活性的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種測定核糖核酸活性的方法。
背景技術(shù)：
核糖核酸是動物體內(nèi)一種生物大分子，是一種重要的免疫觸發(fā)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。近年來，核糖核酸的研究日益深入，核糖核酸已廣泛應用于臨床并取得了一定的療效。為了進一步提高療效專一性，人們又研制出具有組織特異性的免疫核糖核酸，具有特異免疫活性。1967年通過肉瘤免疫綿羊制取的淋巴細胞核糖核酸對大鼠進行試驗，發(fā)現(xiàn)核糖核酸能抑制荷瘤鼠腫瘤的生長，甚至消除，首次證實了免疫核糖核酸能傳遞免疫信息。1982年林單坤等人把從免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成制劑注入體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)對腫瘤與癌癥有明顯的療效并能提高機體的免疫功能，而且未出現(xiàn)不良的副作用。從脾臟中提取得到的免疫核糖核直接制成針注入體內(nèi)，可激活人體的T細胞及B細胞的活性；同時有提高人體免疫功能的作用，對一些與人體免疫功能下降有關(guān)的疾病，如慢性支氣管炎、哮喘病、慢性乙型肝炎等，以及胃癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤有顯著的療效。但目前還沒有可行的核糖核酸活性測定方法來保證核糖核酸的活性和臨床藥效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定核糖核酸活性的方法。
本發(fā)明測定核糖核酸活性的方法，是將核糖核酸用培養(yǎng)液制成每1ml中含核糖核酸0.01～50mg的溶液，作為供試品溶液，以培養(yǎng)液作為對照組溶液，測定供試品溶液和對照組溶液的粘附前細胞的吸收值和粘附后細胞的吸收值，然后，按照如下公式計算粘附率和粘附抑制率粘附率＝(粘附前細胞的吸收值-粘附后細胞的吸收值)/粘附前細胞吸收值×100％；粘附抑制率＝(對照組粘附率-供試品粘附率)/對照組粘附率×100％；其中，粘附前細胞的吸收值和粘附后細胞的吸收值的測定按如下過程進行1)測定粘附前細胞的吸收值取測試溶液50μl，加小鼠脾細胞懸液50μl混勻，再加50μl培養(yǎng)液，在360～550nm波長處測定吸收值，作為粘附前細胞的吸收值；2)測定粘附后細胞的吸收值取測試溶液50μl，加小鼠脾細胞懸液50μl；將培養(yǎng)板于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃孵化0.5～2小時，使細胞在培養(yǎng)板底部粘附；取出細胞培養(yǎng)板，振蕩15～120秒，將未粘附細胞搖起，吸出上清液；再加入培養(yǎng)液液50μl洗一次，將洗液與上清液合并，在360～550nm波長下測定吸收值，作為粘附后細胞的吸收值。
其中，測定吸收值的波長優(yōu)選為405nm；培養(yǎng)液為含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，用Hepes和碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。
按如下過程制備小鼠脾細胞懸液將小鼠拉脫頸椎或放血而死，用碘酒、酒精處理皮毛，剪開皮膚，打開腹腔。在胃底部找到紅色的脾，用鑷子分離后摘除；脾經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后，置50～300目不銹鋼網(wǎng)上，用剪刀剪成數(shù)塊，用注射器柄擠壓研磨，1000r/min離心，懸起沉淀部分即得小鼠脾細胞懸液。
本發(fā)明采用白細胞粘附抑制試驗來測定核糖核酸活性，測定方法要求低，儀器設備簡單，操作簡便、安全、易于掌握，而且可以使細胞與接觸面充分接觸黏附，未黏附細胞也便于洗去，測定結(jié)果穩(wěn)定、重復性較好。
具體實施例方式
實施例1、制備核糖核酸一、配制溶液(1)提取緩沖液(0.02M Tris-乙酸緩沖液)900ml純化水，加2.42克Tris，用乙酸調(diào)pH5.0，定容至1000ml。
(2)飽和酚液體將苯酚在50℃融化，加入等體積提取緩沖液，攪拌均勻制成飽和酚溶液，避光保存。
(3)助沉淀緩沖液3M乙酸鈉溶液，pH5.0(4)溶解緩沖液1M NaCl溶于0.05M Tris-HCl緩沖液中，pH9.5。
二、提取過程1、原材料選擇和預處理取小牛(1歲半以下)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及結(jié)締組織等非胰腺組織，用純化水清洗干凈，切成3～5cm小塊。
2、組織及細胞的破碎用干凈絞肉機將胰腺小塊絞碎，將絞碎的小牛胰腺移入膠體磨中，加入等量提取緩沖液，第一次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液應較易通過200目不銹鋼網(wǎng)，得到100kg左右的勻漿液。
3、有效成份提取勻漿液加入1倍體積飽和酚液體的上層水相，加入0.5倍體積飽和酚液體的下層酚相，加熱到60℃，恒溫120分鐘，迅速冷卻，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上清液，棄去沉淀(回收苯酚)。
上清液加入0.6倍體積氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，搖勻15分鐘，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上層的上清液，棄去中間層沉淀，回收底層氯仿層。
上清液加入0.3倍體積氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，搖勻15分鐘，在4～10℃離心4000g，30分鐘)，收集含核糖核酸的上層上清液，棄去中間層沉淀，回收底層氯仿層。
上清液加入1倍體積助沉淀緩沖液，再加入2倍體積乙醇(95％)，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，上層的上清液為乙醇，回收乙醇。
為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質(zhì)含量，核糖核酸沉淀以溶解緩沖液溶解，加入乙醇至終濃度75％(質(zhì)量)，在4～10℃下離心(4000g，30分鐘)。
用75％乙醇反復洗滌沉淀2次，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，置50℃水中放置到無醇味(約1小時)。
實施例2、活性測定目前，如何對核糖核酸生物活性進行檢測，尚未得到滿意的解決方案。正常白細胞都具有粘附于玻璃、塑料表面的特性，但在特異因子作用下，正常白細胞的這種粘附能力可顯著降低，這種反應稱為白細胞粘附抑制反應，一般以抑制率＞20％為有意義。本發(fā)明采用正常白細胞給予一定濃度的核糖核酸而誘發(fā)白細胞粘附抑制反應，通過小鼠白細胞粘附的抑制率來表征核糖核酸的生物活性，粘附抑制率越高，說明核糖核酸的生物活性越高。
1、溶液配制培養(yǎng)液含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，用Hepes和碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.4，過濾除菌后-20℃保存。
紅細胞分離液(0.83％NH4Cl-Tris緩沖溶液)0.17mol/L Tris(20.60g/1000ml)10.0ml與0.16mol/L NH4Cl(8.30g/1000ml)90.0ml混勻，用1mol/L HCl調(diào)pH至7.2，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 供試品溶液用培養(yǎng)液制成每1ml中含核糖核酸(實施例1所得)5mg的溶液，作為供試品溶液；對照組溶液培養(yǎng)液。
2、小鼠脾細胞懸液的制備取小鼠拉脫頸椎或放血而死，用碘酒、酒精處理皮毛。剪開皮膚，打開腹腔。在胃底部找到紅色的脾，用鑷子分離后摘除。
脾經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后，置200目不銹鋼網(wǎng)上，用剪刀剪成數(shù)塊，用注射器柄擠壓研磨，低速離心(1000r/min)，懸起沉淀部分即得脾細胞懸液。若其中有較多紅細胞，可將脾細胞懸液放在5ml預冷的0.83％NH4Cl-Tris緩沖溶液中，置37℃水浴中10min，低速離心(1000r/min)收集沉淀白細胞。
3、測定法在96孔培養(yǎng)板中進行，供試品孔及對照組孔各做三孔。
每孔各加溶液50μl，然后每孔加小鼠脾細胞懸液50μl；將培養(yǎng)板于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃孵化2小時，使細胞在培養(yǎng)板底部粘附，取出細胞培養(yǎng)板，用震蕩器在低強度下?lián)u30～60秒，將未粘附細胞搖起，吸出上清液(組間再震蕩一次保證均勻)，移至另一孔，每孔再加入培養(yǎng)液液50μl按上法洗一次，將洗液與上清液合并(注意勿起氣泡)，在酶標儀上，在405nm波長下測定每孔的吸收值，作為粘附后細胞的吸收值。
另取溶液50μl，加小鼠脾細胞懸液50μl混勻，再加50μl培養(yǎng)液，在405nm波長下測定吸收度值，做為粘附前細胞的吸收值。
按下式計算粘附率和粘附抑制率粘附率＝(粘附前細胞的吸收度值-粘附后細胞的吸收度值)/粘附前細胞吸收度值×100％粘附抑制率＝(對照品粘附率-供試品粘附率)/對照粘附率×100％4、測定結(jié)果對照組粘附率＝(對照組粘附前細胞的吸收度值-對照組粘附后細胞的吸收度值)/對照組粘附前細胞吸收度值×100％＝1.405-0.912/1.405＝35％供試品粘附率＝(供試品粘附前細胞的吸收度值-供試品粘附后細胞的吸收度值)/供試品粘附前細胞吸收度值×100％＝0.701-0.528/0.701＝24.6％粘附抑制率＝(對照組粘附率-供試品粘附率)/對照組粘附率×100％＝35％-24.6％/35％＝29.7％結(jié)果表明，核糖核酸有良好的生物活性。經(jīng)多次重復，粘附抑制率結(jié)果穩(wěn)定，重復性好。
權(quán)利要求
1.一種測定核糖核酸活性的方法，是將核糖核酸用培養(yǎng)液制成每1ml中含核糖核酸0.01～50mg的溶液，作為供試品溶液，以培養(yǎng)液作為對照組溶液，測定供試品溶液和對照組溶液的粘附前細胞的吸收值和粘附后細胞的吸收值，然后，按照如下公式計算粘附率和粘附抑制率粘附率＝(粘附前細胞的吸收值-粘附后細胞的吸收值)/粘附前細胞吸收值×100％；粘附抑制率＝(對照組粘附率-供試品粘附率)/對照組粘附率×100％；其中，粘附前細胞的吸收值和粘附后細胞的吸收值的測定按如下過程進行1)測定粘附前細胞的吸收值取測試溶液50μl，加小鼠脾細胞懸液50μl混勻，再加50μl培養(yǎng)液，在360～550nm波長處測定吸收值，作為粘附前細胞的吸收值；2)測定粘附后細胞的吸收值取測試溶液50μl，加小鼠脾細胞懸液50μl；將培養(yǎng)板于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃孵化0.5～2小時，使細胞在培養(yǎng)板底部粘附；取出細胞培養(yǎng)板，振蕩15～120秒，將未粘附細胞搖起，吸出上清液；再加入培養(yǎng)液液50μl洗一次，將洗液與上清液合并，在360～550nm波長下測定吸收值，作為粘附后細胞的吸收值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于測定吸收值的波長為405nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)液為含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，用Hepes和碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述小鼠脾細胞懸液的密度為103～106細胞/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述小鼠脾細胞懸液按如下過程制備將小鼠拉脫頸椎或放血而死，用碘酒、酒精處理皮毛，剪開皮膚，打開腹腔。在胃底部找到紅色的脾，用鑷子分離后摘除；脾經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后，置50～300目不銹鋼網(wǎng)上，用剪刀剪成數(shù)塊，用注射器柄擠壓研磨，1000r/min離心，懸起沉淀部分即得小鼠脾細胞懸液。
全文摘要
本發(fā)明公開了測定核糖核酸活性的方法，包括如下步驟1)測定粘附前細胞的吸收值；2)測定粘附后細胞的吸收值；3)計算核糖核酸活性將核糖核酸用培養(yǎng)液制成每1ml中含核糖核酸0.01～50mg的溶液，作為供試品溶液，以培養(yǎng)液作為對照組溶液，測定供試品溶液和對照組溶液的粘附前細胞的吸收值和粘附后細胞的吸收值，按照如下公式計算粘附率和粘附抑制率粘附率＝(粘附前細胞的吸收值－粘附后細胞的吸收值)/粘附前細胞吸收值×100％；粘附抑制率＝(對照組粘附率－供試品粘附率)/對照組粘附率×100％。
文檔編號C12Q1/68GK101063175SQ200710099980
公開日2007年10月31日 申請日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日 公開號200710099980.發(fā)明者孫德軍, 霍英, 李夏, 李秉安, 禹學軍 申請人:吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司