專利名稱：：利用具重組位點(diǎn)的核酸進(jìn)行重組克隆的制作方法利用具重組位點(diǎn)的核酸進(jìn)行重組克隆本案是分案申請，母案申請?zhí)枮?8811695.2(國際申請?zhí)枮镻CT/US98/22589)，申請日為1998年10月26日，發(fā)明名稱為"利用具重組位點(diǎn)的核酸進(jìn)行重組克隆"。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)。提供了具改造重組位點(diǎn)的DNA和載體以用于重組克隆方法中，使得能用重組蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)DNA區(qū)段的有效和特異重組。這些DNA、栽體和方法可用于體外和體內(nèi)的DNA交換，諸如DNA的亞克隆之類。相關(guān)技術(shù)位點(diǎn)特異性重組酶。位點(diǎn)特異性重組酶是存在于許多生物(如病毒和細(xì)菌)中并具內(nèi)切核酸酶和連接酶特性的蛋白質(zhì)。這些重組酶(在某些情況下與相關(guān)蛋白質(zhì)一起)識別DNA中威基的特異序列并交換那些區(qū)段側(cè)翼的DM區(qū)段。這些重組酶和相關(guān)蛋白質(zhì)共同地被稱為"重組蛋白質(zhì)"(參閱，如，Landy,A.，生物技術(shù)中的最新觀點(diǎn)(CurrentOpinioninBiotechnology3:699-707(1993))。來自多種生物的許多重組系統(tǒng)已被描述。參閱，如，Hoess等人，核酸研究14(6):2287(1986);Abremski等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)261(1):391(1986);Campbell,細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)174(23):7495(1992);Qian等人,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267(11):7794(1992);Araki等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)225(1):25(1992);Maeser和Kahnmann,分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)230:170-176(1991);Esposito等人，核酸研究25(18):3605(1997)。這其中的許多屬于重組酶的整合酶家族(Argos等人，EMBOJ.5:433-440(1986)).其中研究得最清楚的可能是來自噬菌體入的整合酶/att系統(tǒng)(Landy，A.遺傳學(xué)及發(fā)育的最新觀點(diǎn)(CurrentOpinionsinGeneticsandDevel.)3:699-707(1993))，來自噬菌體PI的Cre/loxP系統(tǒng)(Hoess和Abremski(1990)，《核酸和分子生物學(xué)》(NucleicAcidsandMolecularBiology),第4巻，Eckstein和Lilley,Berlin-Heidelberg編Springer-Verlag;90-109頁)，及來自釀酒醇母2p質(zhì)粒的FLP/FRT系統(tǒng)(Broach等人，細(xì)胞29:227-234(1982))。盡管對于特殊生物這些重組系統(tǒng)的特征已被描述，相關(guān)技術(shù)只教導(dǎo)了將側(cè)翼有重組位點(diǎn)的重組DNA用于體內(nèi)重組。Backman(美國專利號4,673，640)公開了在體內(nèi)利用X重組酶通過用野生型重組位點(diǎn)attB和attP進(jìn)行酶促位點(diǎn)特異性重組而重組編碼蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。Hasan和Szybalski(基因56:145-151(1987))公開了在體內(nèi)將入Int重組酶用于啟動子旁側(cè)的野生型attP和attB位點(diǎn)之間的分子內(nèi)重組。因?yàn)檫@些位點(diǎn)的取向是互相相反的，這導(dǎo)致啟動子區(qū)相對于目的基因發(fā)生了不可逆翻轉(zhuǎn)。Palazzolo等人，基因88:25-36(1990),公開了具噬菌體入臂的噬菌體入載體，該入臂含有位于所克隆DNA序列之外、野生型loxP位點(diǎn)之間的限制位點(diǎn)。用這些噬菌體載體侵染表達(dá)Cre重組酶的大腸桿菌細(xì)胞，會導(dǎo)致loxP位點(diǎn)之間的重組和質(zhì)粒復(fù)制子，包括被克隆的cDNA的體內(nèi)切除。P6sfai等人(核酸研究22:2392-2398(1994))公開了用于將具選擇標(biāo)記、兩側(cè)有兩野生型FRT識別序列的部分表達(dá)載體插入基因組DNA的方法。存在于細(xì)胞中的FLP位點(diǎn)特異性重組酶被用于將載體整合入基因組的預(yù)定位點(diǎn)。在復(fù)制子有功能的條件下，此克隆基因組DNA可被擴(kuò)增。Bebee等人(美國專利號5，434,066)公開了位點(diǎn)特異性重組酶的使用，例如對于含兩個loxP位點(diǎn)的DNA,Cre可用于這兩位點(diǎn)間的體內(nèi)重組。Boyd(核酸研究21:817-821(1993))公開了使用有助于分子間連接的條件促進(jìn)將平頭DNA克隆至去磷酸化載體的方法，此載體含有受存在于大腸桿菌宿主細(xì)胞中的Cre位點(diǎn)特異性重組酶作用的野生型loxP位占'、"€Waterhouse等人(PCT93/19172和核酸研究21(9):2265(1993))公開了特定抗體的輕和重鏈被克隆入不同噬菌體載體中l(wèi)oxP和loxP511位點(diǎn)之間并用于轉(zhuǎn)染新大腸桿菌細(xì)胞的體內(nèi)方法。Cre在宿主細(xì)胞中作用于兩親代分子上(一質(zhì)粒，一噬菌體)，平衡產(chǎn)生4種產(chǎn)物兩種不同的共合體(通過于loxP或loxP511位點(diǎn)重組而產(chǎn)生)，及兩個子代分子，其中之一是所需的產(chǎn)物。與其它相關(guān)技術(shù)形成對照，Schlake和Bode(生物化學(xué)33:12746-12751(1994))公開了在確定染色體位置上交換側(cè)翼均為野生型和間隔子突變的FRT重組位點(diǎn)的表達(dá)盒的體內(nèi)方法。通過將此FLP/FRT系統(tǒng)用于位點(diǎn)特異性重組，可在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中發(fā)生雙交互交換。轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶這一家族的酶已被用于在復(fù)制子之間傳遞遺傳信息。轉(zhuǎn)座子在結(jié)構(gòu)上可變，被描述為筒單的或復(fù)合的，但一般編碼側(cè)翼為相反取向的DNA序列的重組酶基因。轉(zhuǎn)座子的整合可以是隨機(jī)的或高度特異性的。諸如高度位點(diǎn)特異性的Tn7之類的代表已被應(yīng)用于在復(fù)制子之間體內(nèi)移動DM區(qū)段(Lucklow等人，病毒學(xué)雜志67:4566-4579(1993))。Devine和Boeke，核酸研究22:3765-3772(1994)，公開了構(gòu)建人工轉(zhuǎn)座子以將DNA區(qū)段體外插入受體DNA分子中。該系統(tǒng)使用了酵母TY1類病毒顆粒的整合酶。用標(biāo)準(zhǔn)方法將目的DNA區(qū)段克隆于類轉(zhuǎn)座子元件TY1末端之間。在TY1整合酶的存在下，產(chǎn)生的元件隨機(jī)整合入第二把DNA分子。DNA克隆。DNA區(qū)段的克隆通常在許多研究實(shí)驗(yàn)室中作為日常工作進(jìn)行，并且在許多遺傳分析中是必要的步驟。這些克隆的目的各種各樣，然而可以歸為兩種一般目的(l)從大DNA或RNA區(qū)段(染色體、YAC、PCR片段、mRNA,等等)起始克隆DNA，是在相對少數(shù)的諸如pUC、pGem、pBlueScript之類已知載體中進(jìn)行的，及(2)將這些DNA區(qū)段亞克隆入特化載體以進(jìn)行功能分析。有大量時間和努力花費(fèi)于將DM區(qū)段從起始克隆載體轉(zhuǎn)移至更特化的載體中。此轉(zhuǎn)移被稱為亞克隆.克隆的基本方法已知許多年，且在此期間改變不多。典型的克隆流程如下(1)用一種或兩種限制酶消化目的DNA;(2)在已知的情況下用凝膠純化目的DNA區(qū)段；(3)必要時，通過用恰當(dāng)限制酶酶切、用堿性磷酸酶處理、凝膠純化等制備栽體；(4)將DNA區(qū)段連接至載體，作適當(dāng)?shù)膶φ找韵辞泻妥赃B載體的背景；(5)將產(chǎn)生的栽體引入大腸桿菌宿主細(xì)胞；(6)挑出選擇的菌落并小量培養(yǎng)過夜；(7)小量制備DNA;并(8)在瓊脂糖凝膠上(通常在鑒定性限制酶消化后)或用PCR分析分離的質(zhì)粒。用于亞克隆DNA區(qū)段的特化載體在功能上是多種多樣的。這些載體包括但不局限于用于在各種各樣生物中表達(dá)基因的載體；用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的栽體；用于提供標(biāo)志以協(xié)助蛋白質(zhì)純化或允許在細(xì)胞中追蹤蛋白質(zhì)的載體；用于修飾被克隆DNA區(qū)段(如產(chǎn)生缺失)的載體；用于探針合成(如核糖核酸探針)的載體；用于制備DM測序模板的載體；用于蛋白質(zhì)編碼區(qū)鑒定的載體；用于各種蛋白質(zhì)編碼區(qū)的融合的載體；為了提供大量目的DM的載體，等等。通常一項(xiàng)特定的研究包括將目的DNA區(qū)段亞克隆入數(shù)種不同的特化載體中。如本領(lǐng)域中已知的，簡單的亞克隆可在一天內(nèi)完成(例如，DNA片段不大，且限制位點(diǎn)與亞克隆栽體的限制位點(diǎn)相匹配時)。然而，許多其它的亞克隆需費(fèi)時數(shù)周，尤其是那些涉及未知序列、長片段、毒性基因、限制位點(diǎn)的不合適安插、高背景、不純的酶等等的亞克隆。因而DNA片段的亞克隆經(jīng)常被認(rèn)為是困難的工作，盡可能少次數(shù)進(jìn)行。促進(jìn)DNA區(qū)段克隆的數(shù)種方法已描述于例如以下文獻(xiàn)中。Ferguson,J.等人，基因16:191(1981),公開了用于酵母DNA片段亞克隆的載體家族。這些載體編碼卡那霉素抗性?？蓪⑤^長酵母DNA區(qū)段的克隆部分消化并連接入亞克隆載體。如果最初的克隆載體賦予對氨芐青霉素的抗性，則在轉(zhuǎn)化前無需純化，因?yàn)檫x擇將是針對卡那霉素進(jìn)行。Hashimoto-Gotoh，T.等人,基因41:125(1986)，公開了在鏈霉素敏感性基因內(nèi)有單克隆位點(diǎn)的亞克隆載體；在鏈霉素抗性宿主內(nèi)，只有在顯性的敏感性基因內(nèi)有插入或缺失的質(zhì)粒能在鏈霉素選擇中存活。因此，使用限制酶和連接酶的傳統(tǒng)亞克隆方法費(fèi)時，且相對不可靠。要花費(fèi)大量勞動，如果兩天或更多天后在候選質(zhì)粒中不能找到所需的亞克隆，則整個過程隨后必須嘗試用其它條件重復(fù)。盡管位點(diǎn)特異性重組酶已用于體內(nèi)DNA重組，但這樣的酶在體外成功應(yīng)用預(yù)計(jì)會遇到多個問題。例如，預(yù)計(jì)位點(diǎn)特異性和效率在體外是不同的；預(yù)計(jì)有拓樸學(xué)連接產(chǎn)物；且預(yù)計(jì)DM底物和重組蛋白質(zhì)的拓樸結(jié)構(gòu)在體外顯著不同(參閱如Adams等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.226:661-73(1992))。體內(nèi)能進(jìn)行許多小時的反應(yīng)預(yù)計(jì)在酶喪失活性前只能在體外進(jìn)行明顯較短的時間。在所用生物宿主內(nèi)預(yù)期有多種DNA重組產(chǎn)物，導(dǎo)致亞克隆不能有令人滿意的可靠性、專一性或效率。因此，預(yù)計(jì)體外重組反應(yīng)不足以有效生產(chǎn)所需水平的產(chǎn)物。因而，長期存在具有優(yōu)于已知的限制酶和連接酶使用的其它亞克隆體系的需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在體外或體內(nèi)利用重組蛋白質(zhì)和至少一個重組位點(diǎn)獲得擴(kuò)增的、嵌合的或重組核酸分子的核酸、載體和方法。這些方法是高度特異的、快速的，且勞動強(qiáng)度較標(biāo)準(zhǔn)克隆或亞克隆技術(shù)低。本發(fā)明之改進(jìn)的特異性、速度和產(chǎn)量可促進(jìn)用于任何相關(guān)目的的DNA或RNA克隆或亞克隆、調(diào)節(jié)或交換。本發(fā)明涉及可用于通過利用至少一個重組位點(diǎn)和至少一種重組蛋白質(zhì)移動或交換核酸區(qū)段(優(yōu)選DNA區(qū)段或片段)以提供具所需特性和/或DNA區(qū)段之嵌合DNA分子的核酸、栽體和方法。因而本發(fā)明的使用可使得將這樣的核酸分子克隆或亞克隆入種種載體中。一般地，將一種或多種親代核酸分子(優(yōu)選DNA分子)重組以產(chǎn)生一種或多種子代分子，至少其中之一是所需產(chǎn)物分子，它優(yōu)選是含所需核酸區(qū)段的載體。本發(fā)明因而涉及能達(dá)到交換和/或選擇一種或多種所需產(chǎn)物的核酸分子、載體和方法。本發(fā)明的一實(shí)施方案涉及制備嵌合分子的方法，它包括(a)體外或體內(nèi)聯(lián)合(i)含側(cè)翼有第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)之所需核酸區(qū)段的一種或多種插入物供體分子，其中的第一和第二重組位點(diǎn)基本上不相互重組；(ii)含第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)的一種或多種載體供體分子，其中第三和第四重組位點(diǎn)基本上不相互重組；和(iii)能重組第一和第三重組位點(diǎn)和/或第二和第四重組位點(diǎn)的一種或多種位點(diǎn)特異性重組蛋白質(zhì)；由此使重組發(fā)生，以便產(chǎn)生至少一種共整合核酸分子、至少一種含該所需區(qū)段的所需產(chǎn)物核酸分子，及任選的副產(chǎn)物核酸分子；然后任選地(b)選擇產(chǎn)物或副產(chǎn)物DNA分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備嵌合分子的方法，它包括(a)體外或體內(nèi)聯(lián)合(i)含側(cè)翼有兩個或多個重組位點(diǎn)之所需核酸區(qū)段的一種或多種插入物供體分子，其中所說的重組位點(diǎn)基本上不相互重組；(ii)含兩個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種載體供體分子，其中所說的重組位點(diǎn)基本上不相互重組；和(iii)一種或多種位點(diǎn)特異性重組蛋白質(zhì)；(b)在足以使一個或多個所需區(qū)段轉(zhuǎn)移入一種或多種所說的栽體供體分子的條件下溫育該組合，從而產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物分子。產(chǎn)生的產(chǎn)物分子可任選地選擇出來或與其它分子，諸如共整合分子、副產(chǎn)物分子及未反應(yīng)載體供體分子或插入物供體分子分離。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，將插入物供體分子與一種或多種不同的載體供體分子結(jié)合，從而產(chǎn)生不同產(chǎn)物分子，這樣在一個步驟中將目的核酸轉(zhuǎn)移入許多不同載體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，上述方法可反過來提供最初的插入物供體分子，隨后將它與一種或多種不同載體供體分子聯(lián)合，以產(chǎn)生新產(chǎn)物或副產(chǎn)物分子?；蛘?，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的產(chǎn)物分子可用作插入物供體分子，它可直接與一種或多種不同的載體供體分子結(jié)合使用，從而產(chǎn)生新的產(chǎn)物或副產(chǎn)物分子。因此，目的核酸分子可被轉(zhuǎn)移或移動至許多所需載體中，從而提供了亞克隆目的分子的一種有效方法。因而，本發(fā)明涉及將產(chǎn)物分子與第二載體供體分子結(jié)合以產(chǎn)生第二產(chǎn)物分子。此第二產(chǎn)物DNA分子隨后可與第三載體供體分子聯(lián)合使用，產(chǎn)生第三產(chǎn)物分子。本發(fā)明的此過程可重復(fù)多次以轉(zhuǎn)移或移動目的插入片段至多種不同載體中。在本發(fā)明的此方面，兩個或多個不同載體供體分子的聯(lián)合可再與產(chǎn)物分子聯(lián)合，從而一步產(chǎn)生不同的產(chǎn)物分子，其中所需核酸區(qū)段(來自產(chǎn)物DNA分子)被轉(zhuǎn)移入許多不同載體中。特別是，本發(fā)明涉及用于克隆或亞克隆一種或多種所需核酸分子的方法，包括(a)體外或體內(nèi)聯(lián)合(i)含側(cè)翼有至少兩個重組位點(diǎn)的一個或多個所需核酸區(qū)段的一種或多種插入物供體分子，其中所說的重組位點(diǎn)基本上不相互重組；(ii)含至少兩個重組位點(diǎn)的一種或多種載體供體分子，其中所說的重組位點(diǎn)基本上不相互重組；及(iii)一種或多種位點(diǎn)特異性重組蛋白質(zhì)；(b)在足以允許一個或多個該所需區(qū)段被轉(zhuǎn)移入一種或多種所說載體供體分子的條件下溫育所說的組合，從而產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物分子；(c)任選地選擇或分離所說的產(chǎn)物分子；(d)體外或體內(nèi)結(jié)合(i)含側(cè)翼有兩個或多個重組位點(diǎn)的所說所需區(qū)段的一種或多種所說產(chǎn)物分子，其中所說的重組位點(diǎn)基本上不相互重組；(ii)含兩個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種不同的載體供體分子，其中所說的重組位點(diǎn)基本上不相互重組；及(iii)一種或多種位點(diǎn)特異性重組蛋白質(zhì)；及(e)在足以轉(zhuǎn)移一個或多個該所需區(qū)段入一種或多種所說不同栽體供體分子的條件下溫育所說的組合，從而產(chǎn)生一種或多種不同的產(chǎn)物分子。依據(jù)本發(fā)明，載體供體分子可包含能在種種系統(tǒng)或宿主細(xì)胞中起作用的載體。用于本發(fā)明的優(yōu)選載體包括原核載體、真核載體或可穿梭于多種原核和/或真核系統(tǒng)之間的載體(例如穿梭載體)?？捎糜诒景l(fā)明的優(yōu)選原核載體包括但不局限于在革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細(xì)菌中可增殖和/或復(fù)制的載體，所述細(xì)菌包括埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬及假單胞桿菌屬的細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌?？捎糜诒景l(fā)明的真核載體包括可在酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞(尤其是人)、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、魚類細(xì)胞等等中增殖和/或復(fù)制的載體。感興趣的特殊載體包括但不局限于克隆栽體、測序載體、表達(dá)載體、融合栽體、雙雜交載體(two-hybridvector)、基因治療載體及反向雙雜交載體(reversetwo-hybridvector)。這樣的載體可用于原核和/或真核系統(tǒng)中，這取決于具體的載體。按本發(fā)明使用的插入物供體分子優(yōu)選包括兩個或多個重組位點(diǎn)，可使得供體分子的插入物(如目的核酸區(qū)段)按本發(fā)明被轉(zhuǎn)移或移動入一種或多種載體供體分子。本發(fā)明的插入物供體分子可通過將兩個或多個重組位點(diǎn)加入目的分子的許多技術(shù)制備。加入重組位點(diǎn)以制備本發(fā)明插入物供體分子的這些方法包括核酸分子突變(如隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變)、重組技術(shù)(如，將含重組位點(diǎn)的銜接子或核酸分子連接到線性分子上)、擴(kuò)增(如用含重組位點(diǎn)或其部分的引物)、轉(zhuǎn)座(如用含重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子)、重組(如用含重組位點(diǎn)的一個或多個同源序列)、核酸合成(如含重組位點(diǎn)之分子的化學(xué)合成或用多種聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行的酶促合成)等等。按照本發(fā)明，被添加一個或多個重組位點(diǎn)的核酸分子可以是任何來源的核酸分子，并可包括非天然核酸(如RNA;見美國專利號5,539，082和5,482，836)。特別優(yōu)選的核酸分子是DNA分子(單鏈或雙鏈)。此外，用于產(chǎn)生插入物供體分子的感興趣核酸分子可以是線性或環(huán)狀的，并可進(jìn)一步包含特定的目的序列(如基因)或可以是分子群(如產(chǎn)生自基因組或cDNA文庫的分子)。因此，本發(fā)明涉及許多制備插入物供體分子的方法及用這些方法產(chǎn)生的插入物供體分子.在本發(fā)明的一方面，含一個或多個重組位點(diǎn)或其部分的引物被用于核酸合成或核酸擴(kuò)增以制備本發(fā)明的插入物供體分子。因而，本發(fā)明涉及合成核酸分子的方法，包括(a)將一種或多種核酸模板與具聚合酶活性的多肽和含一個或多個重組位點(diǎn)或其部分的一個或多個引物混合；并(b)在足以合成與所說模板全部或其部分互補(bǔ)并含一個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種核酸分子的條件下溫育所說的混合物。按照本發(fā)明，含一個或多個重組位點(diǎn)的合成核酸分子可在適當(dāng)條件下用作模板以合成與含重組位點(diǎn)之模板全部或其部分互補(bǔ)的核酸分子，從而形成含一個或多個重組位點(diǎn)的雙鏈分子。優(yōu)選地，在含一個或多個重組位點(diǎn)的一個或多個引物存在下完成此第二合成步驟。另一方面，用可含一個或多個重組位點(diǎn)的引物可擴(kuò)增合成的雙鏈分子。在本發(fā)明的另一方面，可以用許多核酸擴(kuò)增技術(shù)將一個或多個重組位點(diǎn)加入核酸分子中。具體地說，這樣的方法包括(a)在一種或多種具聚合酶活性之多肽的存在下將第一核酸分子與互補(bǔ)于該第一核酸分子一部分的第一引物分子接觸，將第二核酸分子與互補(bǔ)于該第二核酸分子一部分的第二引物分子接觸；(b)在足以形成互補(bǔ)于所說第一核酸分子全部或一部分的第三核酸分子及互補(bǔ)于所說第二核酸分子全部或一部分的第四核酸分子的條件下溫育所說的分子；(c)變性所說的第一和第三及所說的第二和第四核酸分子；并(d)重復(fù)步驟(a)至(c)一次或多次，其中所說的第一和/或第二引物分子包括一個或多個重組位點(diǎn)或其部分。在本發(fā)明的另一方面，將一個或多個重組位點(diǎn)加入核酸分子的方法可包括(a)將一種或多種核酸分子與含一個或多個重組位點(diǎn)或其部分的一個或多個銜接子或核酸分子接觸；并(b)在足以加入一個或多個重組位點(diǎn)至該核酸分子的條件下溫育該混合物。優(yōu)選地，對線性分子按本發(fā)明加入這樣的銜接子或分子，且這樣的銜接子或分子優(yōu)選被加入到這種線性分子的一個或多個末端。用包括機(jī)械(如超聲處理或剪切)或酶促(如限制性內(nèi)切核酸酶之類的核酸酶)在內(nèi)的任何技術(shù)可制備線性分子。因此，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括用一種或多種核酸酶(優(yōu)選任何限制性內(nèi)切核酸酶)消化核酸分子并連接含一個或多個重組位點(diǎn)的銜接子或分子至目的分子?？捎闷蕉嘶蛘扯朔肿油瓿蛇B接?；蛘?，按本發(fā)明可以用拓樸異構(gòu)酶引入重組位點(diǎn)。拓樸異構(gòu)酶切開并再連接核酸分子，因而可代替核酸酶和連接酶使用。在另一方面，可通過從頭合成而將一個或多個重組位點(diǎn)加入到核酸分子中。因而，本發(fā)明涉及包括化學(xué)合成一種或多種核酸分子在內(nèi)的方法，其中通過在合成過程中加入恰當(dāng)核苷酸序列而加入重組位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以按下述方法將一個或多個重組位點(diǎn)加入目的核酸分子中，該方法包括(a)將一種或多種核酸分子與含一個或多個重組位點(diǎn)或其部分的一種或多種整合序列接觸；并(b)在足以將含該重組位點(diǎn)之整合序列摻入所說核酸分子的條件下溫育該混合物。按本發(fā)明的此方面，整合序列可包含通過重組或整合將成為目的核酸分子一部分的任何核酸分子。按照本發(fā)明這一方面，可以通過使用轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合病毒、歸巢內(nèi)含子(homingintron)或其它整合元件進(jìn)行體內(nèi)或體外重組(同源重組或非常規(guī)重組)或者進(jìn)行體內(nèi)或體外裝配而將整合序列引入。另一方面，本發(fā)明涉及執(zhí)行本發(fā)明方法的試劑盒，且更特別地涉及克隆或亞克隆試劑盒及用于制備本發(fā)明插入物供體分子的試劑盒。上述試劑盒可包含被區(qū)室化的載體或貯器以在其中接收和保留許多容器。該容器可包含進(jìn)行本發(fā)明方法的許多組分或這些組分的組合。尤其是，本發(fā)明的試劑盒可包含選自一種或多種重組蛋白質(zhì)或重組酶、一種或多種載體供體分子、一種或多種插入物供體分子及一種或多種宿主細(xì)胞(如感受態(tài)細(xì)胞)的一種或多種組分(或它們的組合)。制備本發(fā)明插入物供體分子的試劑盒可包含許多成分，該試劑盒的成分可依所涉及的具體方法而變化。用于通過擴(kuò)增合成插入物供體分子的試劑盒可包含選自具聚合酶活性的一種或多種多肽(優(yōu)選DNA聚合酶，最優(yōu)選耐熱DNA聚合酶)、一種或多種核苷酸及含一個或多個重組位點(diǎn)的一個或多個引物的一種或多種組分(或其組合)。用于插入或添加重組位點(diǎn)至目的核酸分子的試劑盒可包含一種或多種核酸酶(優(yōu)選限制性內(nèi)切核酸酶)、一種或多種連接酶、一種或多種拓樸異構(gòu)酶、一種或多種聚合酶，及含一個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種核酸分子或銜接子。用于將重組位點(diǎn)整合入一種或多種目的核酸分子的試劑盒可包含選自含一個或多個重組位點(diǎn)之一個或多個整合序列的一種或多種組分(或其組合)。上述整合序列可包含一種或多種轉(zhuǎn)座子、整合病毒、同源重組序列、一種或多種宿主細(xì)胞等等。產(chǎn)生的組合物。尤其是，這樣的組合物可包含一種或多種插入物供體分子、一種或多種載體供體分子及一種或多種重組蛋白質(zhì)(或其組合)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的組合物可包含一種或多種共整合分子、一種或多種產(chǎn)物分子及一種或多種副產(chǎn)物分子(或其組合)。涉及制備插入物供體分子的組合物可依應(yīng)用于制備所需插入物供體分子的具體方法而變化。通過擴(kuò)增制備上述分子的組合物可包含一種或多種具聚合酶活性的多肽、一種或多種含一個或多個重組位點(diǎn)的引物、一種或多種核苷酸和一種或多種將擴(kuò)增的核酸分子(或其組合)。涉及插入或添加重組位點(diǎn)至所需核酸分子的組合物可包括含一個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種核酸分子或銜接子、一種或多種連接酶、一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶、一種或多種拓樸異構(gòu)酶、及一種或多種希望含這種重組位點(diǎn)的核酸分子(或它們的組合)。涉及在所需核酸分子中整合重組位點(diǎn)的組合物可包括含一個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種整合序列及希望含重組位點(diǎn)的一種或多種核酸分子。在本發(fā)明特別優(yōu)選的方面，文庫(例如通過從新合成諸如隨機(jī)序列或簡并寡核苷酸之類而產(chǎn)生的基因組DNA或cDNA群或核酸分子群)按本發(fā)明被利用。通過插入或添加重組位點(diǎn)至所說的核酸分子群，產(chǎn)生了插入物供體分子群。通過本發(fā)明的重組方法，可以很容易將文庫移入不同的載體(或載體的組合)中并因而引入不同的宿主系統(tǒng)(原核的和真核的)，以評估和分析該文庫或來自此文庫的特殊序列或克隆。或者，含所需分子的栽體可用于體外系統(tǒng)，例如用于RNA和/或蛋白質(zhì)生產(chǎn)的體外表達(dá)系統(tǒng)。在特別優(yōu)選的方面，一個或多個重組位點(diǎn)被加入到基因文庫的核酸分子中，所用方法包括(a)將線性核酸分子群與含一個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種銜接子混合；并(b)在足以添加一個或多個所說的銜接子至所說線性分子一個或多個末端的條件下溫育該混合物。在優(yōu)選的方面，核酸分子群是雙鏈DNA分子(優(yōu)選基因組DNA或cDNA)。用于本發(fā)明的線性片段群可通過切割(用機(jī)械的或酶促的方法)基因組或cDNA而制備。在優(yōu)選的方面，銜接子被加入到線性分子的一個或多個末端。在本發(fā)明的另一特別優(yōu)逸方面，cDNA文庫被用于制備本發(fā)明的插入物供體DNA分子群。特別地，本發(fā)明此方面涉及的方法包含(a)將RNA、niRNA或polyA+RNA模板群與具逆轉(zhuǎn)錄酶活性的一種或多種多肽和含一個或多個重組位點(diǎn)的一種或多種引物接觸；(b)在足以合成互補(bǔ)于所說模板之第一DNA分子群的條件下溫育該混合物，其中所說的DNA分子包含一個或多個重組位點(diǎn)。本發(fā)明的此方面可進(jìn)一步包括在足以制備互補(bǔ)于所說第一DNA分子群全部或部分之第二DNA分子群的條件下溫育該合成DNA，從而形成含一個或多個重組位點(diǎn)的雙鏈DNA分子群。在特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明的插入物供體分子含至少兩個重組位點(diǎn)，當(dāng)其中的插入物供體分子是線性時，這樣的兩個或多個重組位點(diǎn)優(yōu)選位于分子的兩末端處或附近。按照本發(fā)明，附加重組位點(diǎn)(即兩個以上)的使用可促進(jìn)在插入物供體分子中不同插入物的亞克隆，這依該重組位點(diǎn)的類型和定位而定。其它的實(shí)施方案包括可用于本發(fā)明方法中的DNA和載體。尤其是，在一個實(shí)施方案中提供了載體供體分子，其中在載體供體內(nèi)的DNA區(qū)段被隔開，(i)在環(huán)狀載體供體內(nèi)是由至少兩個重組位點(diǎn)隔開的，或(ii)在線性載體供體內(nèi)是由至少一個重組位點(diǎn)隔開的，其中重組位點(diǎn)優(yōu)選被改造以增強(qiáng)重組的特異性或效率。一個載體供體實(shí)施方案包括第一DNA區(qū)段和第二DNA區(qū)段，該第一或第二區(qū)段包含選擇標(biāo)記.另一個載體供體實(shí)施方案包括第一DNA區(qū)段和第二DNA區(qū)段，該第一或第二DNA區(qū)段含有毒性基因。第三個載體供體實(shí)施方案包括第一DNA區(qū)段和第二DNA區(qū)段，該第一或第二DNA區(qū)段含有至少一個選擇標(biāo)記的無活性片段，當(dāng)?shù)谝换虻诙亟M位點(diǎn)與至少一個選擇標(biāo)記的另一無活性片段重組時，選擇標(biāo)記的無活性片段能重組成有功能的選擇標(biāo)記。根據(jù)本領(lǐng)域已有知識、本發(fā)明的附圖和描述及權(quán)利要求，本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案對常規(guī)技術(shù)人員是顯而易見的。附圖簡述圖1描述了本發(fā)明的一個一般方法，其中起始(親代)DNA分子可以是環(huán)狀的或線性的。其目的是為了用新的亞克隆載體D交換最初的克隆載體B。在一實(shí)施方案中理想的是選擇AD而排除掉所有的其它分子，包括共合體(Cointegrate)。方格和圓團(tuán)是重組位點(diǎn)例如loxP位點(diǎn)、att位點(diǎn)等等。例如，區(qū)段D可包含表達(dá)信號、新藥物標(biāo)記、新復(fù)制起點(diǎn)、或用于繪圖或測序DNA的特化功能。圖2A描述了在體外將插入物供體質(zhì)粒(在此是pEZC705)與載體供體質(zhì)粒(在此是pEZC726)重組并獲得產(chǎn)物(Product)DNA和副產(chǎn)物(Byproduct)子代分子的方法。兩個重組位點(diǎn)是載體供體上的attP和loxP。由這些位點(diǎn)限定的一個區(qū)段上有啟動子已被來自轉(zhuǎn)座子Tnlo之tetOP操縱子/啟動子替代的卡那霉素抗性基因。參閱如Sizemore等人，核酸研究，18(10):2875(1990)。在缺乏tet阻遏物蛋白時，大腸桿菌RNA聚合酶由tetOP轉(zhuǎn)錄卡那霉素抗性基因。如果tet阻遏物存在，則它與tetOP結(jié)合并阻斷卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄。pEZC726的另一區(qū)段具有由組成型啟動子表達(dá)的tet阻遏物基因。因?yàn)樵谂ctetR同一區(qū)段上有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，故由pEZC726轉(zhuǎn)化的這些細(xì)胞是抗氯霉素的，但對卡那霉素敏感。重組酶介導(dǎo)的反應(yīng)導(dǎo)致tetR基因與受調(diào)節(jié)的卡那霉素抗性基因分離。此分離只在接收所需重組產(chǎn)物的細(xì)胞中導(dǎo)致卡那霉素抗性。通過添加被稱為整合酶的重組酶可驅(qū)動第一重組反應(yīng)。通過添加重組酶Cre至共合體(在此是pEZC7共合體)可驅(qū)動第二重組反應(yīng)。圖2B描述了pEZC705的限制性圖譜。圖2C描述了pEZC726的限制性圖譜。圖2D描述了pEZC7Coint的限制性圖譜。圖2E描述了Intprod的限制性圖譜。圖2F描述了Intbyprod的限制性圖諳。圖3A描述了將插入物供體質(zhì)粒(在此是pEZC602)與栽體供體質(zhì)粒(在此是pEZC629)重組并獲得產(chǎn)物(在此是EZC6產(chǎn)物)和副產(chǎn)物(在此是EZC6副產(chǎn)物)子代分子的體外方法。兩個重組位點(diǎn)是loxP和loxP511。由這些位點(diǎn)限定的一個pEZC629區(qū)段是啟動子已被來自轉(zhuǎn)座子TnlO之tetOP操縱子/啟動子替代的卡那霉素抗性基因。在缺乏tet阻遏物時，大腸桿菌RNA聚合酶由tetOP轉(zhuǎn)錄卡那霉素抗性基因。如果tet阻遏物存在，則它與tetOP結(jié)合并阻斷卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄。pEZC629的另一區(qū)段具有由組成型啟動子表達(dá)的tet阻遏物基因。因?yàn)樵谂ctetR相同的區(qū)段上有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，故由pEZC629轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是抗氯霉素的，但對卡那霉素敏感。反應(yīng)導(dǎo)致tetR基因與受調(diào)節(jié)的卡那霉素抗性基因分離。此分離使接收所需重組產(chǎn)物的細(xì)胞有卡那霉素抗性。通過添加同一重組酶Cre驅(qū)動第一和第二重組反應(yīng)。圖3B描述了EZC6Bypr的限制性圖譜。圖3C描述EZC6Prod的限制性圖語。圖3D描述pEZC602的限制性圖請。圖犯描述pEZC629的限制性圖譜。圖3F描述EZC6coint的限制性圖譜。圖4A描述利用重組克隆體外方法將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因亞克隆入載體以便在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。插入物供體質(zhì)粒pEZC843含大腸桿菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，該基因被克隆于loxP和attB位點(diǎn)之間，使得loxP位點(diǎn)位于該基因的5'端。載體供體質(zhì)粒pEZC1003含與IoxP位點(diǎn)并列的巨細(xì)胞病毒真核啟動子。將超螺旋質(zhì)粒與入整合酶和Cre重組酶體外聯(lián)合。溫育后，用重組反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的等分試樣鋪于含卡那霉素的瓊脂平板上以選擇產(chǎn)物分子(在此是C證rod)。圖4B描述pEZC843的限制性圖譜.圖4C描述pEZC1003的限制性圖譜。圖4D描述CMVByprod的限制性圖譜。圖4E描述CMVProd的限制性圖譜。圖4F描述CMVcoint的限制性圖譜。圖5A描述pEZC1301的載體圖。圖5B描述pEZC1305的載體圖。圖5C描述pEZC1309的載體圖。圖5D描述pEZC1313的載體圖。圖5E描述pEZC1317的載體圖。圖5F描述pEZC1321的載體圖。圖5G描述pEZC1405的載體圖。圖5H描述pEZC1502的載體圖。圖6A描述pEZC1603的載體圖。圖6B描述pEZC1706的載體圖。圖7A描述pEZC2901的載體圖。圖7B描述pEZC2913的載體圖。圖7C描述pEZC3101的載體圖。圖7D描述pEZC1802的栽體圖。圖8A描述pGEX-2TK的載體圖。圖8B描述pEZC3501的載體圖。圖8C描述pEZC3601的載體圖。圖8D描述pEZC3609的載體圖。圖8E描述pEZC3617的載體圖。圖8F描述pEZC3606的載體圖。圖8G描述pEZC3613的載體圖。圖8H描述pEZC3621的載體圖。圖81描述GST-CAT的載體圖。圖8J描述GST-phoA的載體圖。圖8K描述pEZC3201的載體圖。圖9A描述5.2kbPCR產(chǎn)物的示意圖。圖9B描述pEZC1202的載體圖。圖9C描述5.2kb克隆的載體圖。圖10A描述pEZC5601的載體圖。圖10B描述pEZC6701的載體圖。圖10C描述attL產(chǎn)物的載體圖。圖IOD描述attR產(chǎn)物。圖11A描述pEZC7102的載體圖。圖11B描述pEZC7501的載體圖。圖IIC描述attL產(chǎn)物。圖12A描述帶末端attB位點(diǎn)的ampPCR產(chǎn)物。圖12B描述帶末端attB位點(diǎn)的tetPCR產(chǎn)物。圖12C描述amp7102的限制性圖譜。圖12D描述tet7102的限制性圖譜。發(fā)明詳述本發(fā)明中出乎意料地發(fā)現(xiàn)，可逆和/或可重復(fù)的克隆和亞克隆反應(yīng)能用于加工核酸，通過重組蛋白質(zhì)和重組位點(diǎn)形成嵌合核酸。按照本發(fā)明的重組克隆使用了重組核酸分子和重組蛋白質(zhì)，該重組核酸分子具至少一個選定的重組位點(diǎn)以在體外和體內(nèi)移動或交換核酸分子區(qū)段。這些方法使用重組反應(yīng)產(chǎn)生具所需特征的DNA或RNA分子和/或核酸區(qū)段。本發(fā)明的方法提供了將目的核酸分子移動或轉(zhuǎn)移到許多載體系統(tǒng)中的一條途徑。按照本發(fā)明，這種向多種載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移可獨(dú)立地、相繼地或大量(例如一步轉(zhuǎn)移到許多不同載體中)地完成。本發(fā)明的特異性、速度和/或產(chǎn)量有改善，這促進(jìn)了可用于任何相關(guān)目的的DNA或RNA克隆、亞克隆、調(diào)節(jié)或交換。這樣的目的包括DNA或RNA區(qū)段的體外重組，轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、分離或基因組DNA或RNA的體外或體內(nèi)插入或修飾。定義在以下敘述中，用于重組DNA技術(shù)的許多術(shù)語被廣泛利用。為便于對說明書和權(quán)利要求清楚和一致地理解，包括給出這些術(shù)語的范圍，提供以下定義.副產(chǎn)物缺少期望被克隆或亞克隆的區(qū)段的子代分子(在重組克隆過程中第二次重組事件后產(chǎn)生的新克隆)。共整合體是含兩親代(起始)分子的至少一個本發(fā)明重組中間核酸分子。它通常為環(huán)狀，但在某些實(shí)施方案中可以是線性。宿主是可作為重組克隆產(chǎn)物受體的任何原核或真核生物。此處所用的術(shù)語"宿主"包括可被遺傳工程改造的原核或真核生物。對于這樣的宿主的例子，參閱Maniatis等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1982)。插入物包括可用本發(fā)明方法加工的所需核酸區(qū)段或核酸區(qū)段群(圖1的區(qū)段A)。因此，術(shù)語插入物意指包括特殊核酸(優(yōu)選DNA)區(qū)段或區(qū)段群。這樣的插入物可包括一個或多個基因。插入物供體是攜帶插入物的本發(fā)明兩親代核酸分子之一(如RNA或DNA)。插入物供體分子含兩側(cè)均有重組位點(diǎn)的插入物。插入物供體可以是線性或環(huán)狀的。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，插入物供體是環(huán)狀DNA分子，并還在重組信號之外包含克隆載體序列(見圖1)。當(dāng)插入物群或核酸區(qū)段群被用于制備插入物供體時，將得到插入物供體群并可按本發(fā)明使用。產(chǎn)物是重組克隆過程中第二次重組事件后產(chǎn)生的含A和D序列的所需子代分子之一。產(chǎn)物包含將被克隆或亞克隆的核酸。按本發(fā)明，當(dāng)使用插入物供體群時，產(chǎn)生的產(chǎn)物分子群將包含插入物供體的插入物群全部或一部分，優(yōu)選包含插入物供體最初分子的代表性群體。啟動子是通常描述為基因5'區(qū)域、位于起始密碼子近側(cè)的DNA序列。相鄰DNA區(qū)段的轉(zhuǎn)錄起始于啟動子區(qū)域。因阻遏劑的作用，誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄速率下降。盡管在一般代謝條件影響下它可變化，但組成型啟動子的轉(zhuǎn)錄速率不受特異調(diào)節(jié)。識別序列識別序列是蛋白質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)、DNA或RNA分子(如限制性內(nèi)切核酸酶、修飾甲基化酶或重組酶)識別并結(jié)合的特殊序列。在本發(fā)明中，識別序列通常指重組位點(diǎn)。例如，Cre重組酶的識別序列是loxP,它是一個34堿基序列，由8堿基對核心序列及位于兩側(cè)的兩個13堿基對反向重復(fù)序列(用做重組酶結(jié)合位點(diǎn))組成.見Sauer，B，，生物技術(shù)最新觀點(diǎn)，5:521-527(1994)中的圖1。識別序列的其它例子是被重組酶——入整合酶識別的attB、attP、at讓和attR序列。attB是含兩個9bp核心型整合酶結(jié)合位點(diǎn)和一個7bp重疊區(qū)的約25bp序列。attP是含核心型整合酶結(jié)合位點(diǎn)和臂型整合酶結(jié)合位點(diǎn)及輔助蛋白質(zhì)—一整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)相關(guān)位點(diǎn)的約240bp序列。參閱Landy,生物技術(shù)的最新觀點(diǎn)3:699-707(1993)。這樣的位點(diǎn)還可按本發(fā)明被改造以增強(qiáng)本發(fā)明方法中產(chǎn)物的生產(chǎn)。當(dāng)所說的改造位點(diǎn)缺少PI或HI結(jié)構(gòu)域使重組反應(yīng)不可逆(如attR或attP)時，這樣的位點(diǎn)可被稱為attR'或attp',以表示這些位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域已按某種方式被修飾。重組酶是催化DNA區(qū)段在特異重組位點(diǎn)交換的酶。重組克隆是此處所述的一種方法，由此可在體外或體內(nèi)交換、插入、取代、置換或修飾核酸分子區(qū)段或這樣的分子群。重組蛋白質(zhì)包括切除或整合蛋白質(zhì)、酶、輔助因子或涉及有關(guān)一個或多個重組位點(diǎn)之重組反應(yīng)的相關(guān)蛋白質(zhì)。參閱Landy(1994)，見上文。阻抑盒是含存在于亞克隆載體中的選擇標(biāo)記的阻抑物的核酸區(qū)段選擇標(biāo)記是使得可選擇到或排除掉含有它的分子或細(xì)胞的DNA區(qū)段(經(jīng)常是在特殊條件下)。這些標(biāo)記可編碼活性，例如但不局限于RNA、肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，或可提供RNA、肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)和有機(jī)化合物或組合物等等的結(jié)合位點(diǎn)。選擇標(biāo)記的例子包括但不局限于(1)編碼提供抗其他有毒化合物(如抗生素)之抗性的產(chǎn)物的DNA區(qū)段；(2)編碼在受體細(xì)胞中原本缺乏的產(chǎn)物的DNA區(qū)段(如tRNA基因、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記)；(3)編碼抑制基因產(chǎn)物活性的產(chǎn)物的DNA區(qū)段；(4)編碼可容易鑒定的產(chǎn)物的DNA區(qū)段(如P-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)和細(xì)胞表面蛋白之類表型標(biāo)記)；(5)可結(jié)合原本對細(xì)胞生存和/或功能有害的產(chǎn)物的DNA區(qū)段；(6)本來會抑制上述1-5中任何DNA區(qū)段的活性的DNA區(qū)段(如反義寡核苷酸)；(7)能與修飾底物的產(chǎn)物(如限制內(nèi)切核酸酶)結(jié)合的DNA區(qū)段；(8)可用于分離或鑒定所需分子的DNA區(qū)段(如特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn))；(9)編碼本來無功能的特異核苷酸序列的DNA區(qū)段(如用于分子亞群的PCR擴(kuò)增)；(10)缺乏時直接或間接賦與對特殊化合物的抗性或敏感性的DNA區(qū)段；和/或(ll)編碼在受體細(xì)胞中有毒的產(chǎn)物的DNA區(qū)段。選擇方案是能夠用來從含插入物供體、栽體供體、任何中間體(如共合體)及/或副產(chǎn)物之混合物中選擇、富集或鑒定所需產(chǎn)物的任何方法。一個優(yōu)選實(shí)施方案的選擇方案具至少兩個組分，它們在重組克隆中連接或不連接在一起。一個組分是選擇標(biāo)記。另一組分控制選擇標(biāo)記的體外或體內(nèi)表達(dá)，或含有攜帶選擇標(biāo)記之質(zhì)粒的細(xì)胞的存活。一般地，該控制元件是選擇標(biāo)記的阻抑物或誘導(dǎo)物，但也可使用能控制選擇標(biāo)記表達(dá)的其它方法。正如對本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，到底使用阻抑物還是激活劑將取決于該標(biāo)記是正選擇還是負(fù)選擇，以及各DNA區(qū)段的正確排列。優(yōu)選的要求是選擇方案能選擇或富集僅一種或多種所需產(chǎn)物。正如本文所表明的，DNA分子的選擇包括(a)對所需DNA分子進(jìn)行選擇或富集，和(b)排除掉非所需DNA分子的DNA分子而進(jìn)行選擇或富集。在一個實(shí)施方案中，選擇方案(可反向進(jìn)行)可采取三種形式之一，這將以圖l的形式論述。因而本文中以選擇標(biāo)記和阻抑物舉例說明的第一種形式可選擇具區(qū)段D并缺乏區(qū)段C的分子。第二種形式選擇排除具區(qū)段C的分子并選擇出具區(qū)段D的分子。第二種形式的可能實(shí)施方案將具有帶對待引入體外反應(yīng)產(chǎn)物的細(xì)胞有毒的基因的DNA區(qū)段。毒性基因可以是表達(dá)為毒性基因產(chǎn)物(毒性蛋白質(zhì)或RNA)的DNA，或可以是其自身有毒的(后一種情況中，毒性基因被理解為帶有其"可遺傳性狀"的經(jīng)典定義。)所說毒性基因產(chǎn)物的例子在本領(lǐng)域中是眾所周知的，包括但不局限于限制性內(nèi)切核酸酶(如Dpnl)、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(如ASK1或bcl-2/ced-9家族成員)、包括人類免疫缺陷病毒(HIV)基因在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因、NP-l之類的防衛(wèi)素、反向重復(fù)或配對的回文DNA序列、例如來自(()X174或噬菌體T4的噬菌體裂解基因、rpsL之類抗生素敏感基因、pheS之類抗微生物敏感基因、質(zhì)粒殺傷基因、產(chǎn)生對細(xì)菌有毒之基因產(chǎn)物的真核轉(zhuǎn)錄載體基因，例如GATA-1,以及在抑制性功能缺乏時可殺死宿主的基因，如kicB或ccdB。毒性基因還可在體外選擇，例如用限制位點(diǎn)。許多有效連接了可誘導(dǎo)啟動子并編碼限制性內(nèi)切核酸酶的基因是已知的，并可用于本發(fā)明中。參閱如美國專利號4,960,707(Dpnl和Dpnn);5，000,333，5，082，784和5，192,675(KpnI);5，147，800(NgoAm和NgoAI);5,179,015(FspI和Haeffl);5,200,333(HaeII和Taql);5,248,605(HpaII);5,312,746(Clal);5,231,021和5，304，480(XhoI和XhoII);5，334，526(AluI);5，470,740(NsiI);5，534，428(SstI/SacI);5，202，248(NcoI);5，139,942(NdeI);和5，098,839(PacI)。還參閱Wilson,G.G.，核酸研究19:2539-2566(1991);和Lunnen，K.D.，等人，基因74:25—32(1988)。在第二種形式中，區(qū)段D攜帶選擇標(biāo)記。毒性基因?qū)⑾d體供體、共合體及副產(chǎn)物分子的轉(zhuǎn)化體，而選擇標(biāo)記可用于選擇出含產(chǎn)物的細(xì)胞并排除掉只含插入物供體的細(xì)胞。第三種形式選擇具有順式位于同一分子上的區(qū)段A和D的細(xì)胞，并排除掉具有反式位于不同分子上的兩區(qū)段的細(xì)胞。這可通過利用分成各位于區(qū)段A和D上的兩無活性片段的選擇標(biāo)記而實(shí)現(xiàn)。這些片段相對于重組位點(diǎn)的排列方式使得當(dāng)區(qū)段通過重組接在一起時，它們能重構(gòu)成有功能的選擇標(biāo)記。例如，重組事件可將啟動子與結(jié)構(gòu)基因連接，可連接結(jié)構(gòu)基因的兩個片段，或可連接編碼存活所需雜二聚體基因產(chǎn)物的基因，或可連接復(fù)制子的各部分。位點(diǎn)特異性重組酶是重組酶的一種類型，一般至少具有以下4種活性(或它們的聯(lián)合)(1)一個或多個特異核酸序列的識別；(2)所述序列的切割；(3)涉及鏈交換的拓樸異構(gòu)酶活性；及(4)重封閉核酸斷裂鏈的連接酶活性。參閱Sauer,B.,生物技術(shù)中的最新觀點(diǎn)5:521-527(1994)。保守位點(diǎn)特異性重組與同源重組和轉(zhuǎn)座的區(qū)別在于后二者的特異性較高。鏈交換機(jī)制包括在DNA合成缺乏時切割和再連接特異DNA序列(Landy,A.(1989)生化年鑒(Ann.Rev.Biochem.)58:913—949)。亞克隆載體是含優(yōu)選包括恰當(dāng)復(fù)制子之環(huán)狀或線性核酸分子的克隆栽體。在本發(fā)明中，亞克隆載體(圖1的區(qū)段D)還可包含希望摻入終產(chǎn)物中以作用于克隆DNA插入物(圖1中的區(qū)段A)或與其一起起作用的功能性和/或調(diào)節(jié)元件。亞克隆載體還可包括選擇標(biāo)記(優(yōu)選DNA)。載體是為插入物提供有用的生物學(xué)或生化特性的核酸分子(優(yōu)選DNA)。例子包括質(zhì)粒、噬菌體、自主復(fù)制序列(ARS)、著絲粒，及能在體外或宿主細(xì)胞中復(fù)制或被復(fù)制、或轉(zhuǎn)運(yùn)目的核酸區(qū)段至宿主細(xì)胞中所需位置的其它序列。載體可具有一個或多個限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)，在該位點(diǎn)處，序列能以可確定方式切開且不喪失載體的基本生物學(xué)功能，并可向其中剪接核酸片段以使其復(fù)制和克隆。載體可進(jìn)一步提供引物位點(diǎn)(例如用于PCR),轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始和/或調(diào)節(jié)位點(diǎn)、重組信號、復(fù)制子、選擇標(biāo)記等等。顯然，不需使用同源重組、轉(zhuǎn)座或限制酶的插入目的核酸片段的方法(例如、但不局限于PCR片段的UDG克隆(美國專利號5,334,575，在此全文引入作為參考)、T:A克隆等等)也可應(yīng)用于將片段克隆入將按本發(fā)明使用的克隆載體。此克隆載體可進(jìn)一步包含一個或多個選擇標(biāo)記，適用于鑒定轉(zhuǎn)化了該克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。載體供體是本發(fā)明兩親代核酸分子(如RNA或DNA)之一，它攜帶含將成為目的產(chǎn)物中一部分的DNA載體的DNA區(qū)段載體供體包含亞克隆載體D(或若插入物體尚不含克隆載體時，它可被稱為克隆載體)及側(cè)翼有重組位點(diǎn)的區(qū)段C(見圖1)。正如上述就選擇方案所述，區(qū)段C和/或D可包含有助于選擇出目的產(chǎn)物子代分子的元件。重組信號可以是相同或不同的，并可通過相同或不同的重組酶起作用。此外，載體供體可以是線性或環(huán)狀的。引物指在核酸分子(如DNA分子)擴(kuò)增或聚合期間可通過核苷酸單體共價(jià)鍵合延伸的單鏈或雙鏈寡核苷酸。在優(yōu)選方面，引物包含一個或多個重組位點(diǎn)或該重組位點(diǎn)的一部分。重組位點(diǎn)的一部分含感興趣重組位點(diǎn)的至少2個堿基、至少5個堿基、至少10個堿基或至少20個堿基。當(dāng)使用重組位點(diǎn)的部分時，重組位點(diǎn)的缺失部分可由新合成核酸分子提供。這樣的重組位點(diǎn)可以位于引物的一端或兩端和/或內(nèi)部。優(yōu)選地，附加序列被加入到鄰近重組位點(diǎn)的引物上，以增強(qiáng)或提高重組和/或在重組過程中穩(wěn)定重組位點(diǎn)。這樣的穩(wěn)定序列可以是任何長度的任何序列(優(yōu)選富含G/C序列)。優(yōu)選地，這樣的序列大小范圍是約1-IOOO個堿基、約1-500個堿基、約1-100個堿基、約1-60個堿基、約1-25個堿基、約1-10個、約2-IO個堿基，并優(yōu)選約4個堿基。優(yōu)選地，這樣的序列長度大于1個堿基并優(yōu)選長度大于2個堿基。模板指將被擴(kuò)增、合成或測序的雙鏈或單鏈核酸分子。在雙鏈分子的情況下，優(yōu)選在這些分子被擴(kuò)增、合成或測序之前進(jìn)行鏈的變性以形成第一和第二鏈，或可直接用雙鏈分子作模板。對于單鏈模板，互補(bǔ)于模板一部分的引物在適當(dāng)條件下雜交，然后具聚合酶活性的一種或多種多肽(如DM聚合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶)可合成與該模板全部或一部分互補(bǔ)的核酸分子?；蛘?，對于雙鏈模板，可將一個或多個啟動子結(jié)合一種或多種聚合酶使用，以制備與模板全部或一部分互補(bǔ)的核酸分子。按照本發(fā)明，新合成分子可與最初模板長度相等或稍短。此外，在合成或擴(kuò)增過程中可使用核酸模板群以生產(chǎn)通常代表最初模板群的核酸分子群。銜接子是含一個或多個重組位點(diǎn)(或這些重組位點(diǎn)一部分)的寡核苷酸或核酸片段或區(qū)段(優(yōu)選DNA),按本發(fā)明可將其加入環(huán)狀或線性插入物供體分子以及本文所述的其它核酸分子中。當(dāng)使用重組位點(diǎn)一部分時，缺失部分可由插入物供體分子提供。盡管銜接子優(yōu)選添加于線性分子的一端或兩端處或者附近，但這樣的銜接子也可添加于環(huán)狀或線性分子內(nèi)的任何位置。優(yōu)選地，銜接子被置于特殊目的核酸分子兩側(cè)(側(cè)翼)。按照本發(fā)明，可用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)(如限制性消化或連接)將銜接子添加入到目的核酸分子上。例如，通過先用適當(dāng)限制酶消化分子、添加銜接子于切割位點(diǎn)處并再形成于切割位點(diǎn)處含銜接子的環(huán)狀分子而將銜接子加入環(huán)狀分子中?；蛘撸蓪暯幼又苯舆B接至線性分子的一端或兩端，并優(yōu)選連接至兩端，從而產(chǎn)生在一端或兩端具銜接子的線性分子。在本發(fā)明的一方面，可將銜接子加入線性分子群(如已被切割或消化的cDNA文庫或基因組DNA)中，以形成在該群的全部或大部分一端、并優(yōu)選兩端含銜接子的線性分子群。文庫指核酸分子(環(huán)狀或線性的)的集合。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，基因文庫代表生物體DNA組成或其基本部分("基因組"文庫)，或?yàn)橐惶状砑?xì)胞、組織、器官或生物體表達(dá)基因全部或基本部分的核酸分子(cDNA文庫)?；蛭膸爝€可包含通過從頭合成、一個或多個序列誘變等制備的隨機(jī)序列。這樣的基因文庫可以包含或不包含于一個或多個載體中。擴(kuò)增指可利用聚合酶增加核苷酸序列拷貝數(shù)的任何體外方法。核酸擴(kuò)增導(dǎo)致核苷酸摻入DNA和/或RNA分子或引物中，從而形成互補(bǔ)于模板的新分子。形成的核酸分子及其模板可用作合成額外核酸分子的模板如此處所用，擴(kuò)增反應(yīng)可由許多輪復(fù)制循環(huán)組成。DNA擴(kuò)增反應(yīng)包括例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。一個PCR反應(yīng)可由5-100個"循環(huán)"的DNA分子變性及合成組成。寡核苷酸指含共價(jià)連接的核苷酸序列的合成或天然分子，各核苷酸通過一核苷酸之脫氧核糖或核糖的3'位置與相鄰核苷酸之脫氧核糖或核糖的5'位置之間的磷酸二酯鍵而連接在一起。核苷酸指堿基-糖-磷酸結(jié)合體。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的單體單元。術(shù)語核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP和脫氧核糖核普三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。所說的衍生物包括例如OS]dATP、7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP。此處所用術(shù)語核苷酸還指雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及它們的衍生物。雙脫氧核糖核普三磷酸的例子包括但不局限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。按照本發(fā)明，"核普酸"可以是未標(biāo)記的或用眾所周知的技術(shù)進(jìn)行了可檢測地標(biāo)記?？蓹z測標(biāo)記包括例如放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和酶標(biāo)記。雜交術(shù)語"雜交反應(yīng)"和"雜交"指兩互補(bǔ)單鏈核酸分子(RNA和/或DNA)的堿基配對形成雙鏈分子。如本文所用，盡管堿基配對不是完全互補(bǔ)的，但兩個核酸分子可以雜交。因此，本領(lǐng)域眾所周知，假若使用恰當(dāng)?shù)臈l件，錯配堿基不能阻止兩核酸分子的雜交。本文所用的重組DNA技術(shù)及分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的其它術(shù)語一般按相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員的理解。重組方案本發(fā)明體外或體內(nèi)方法的一個一般方案如圖l所示，其中插入物供體和載體供體可以是環(huán)狀或線性DNA,但按環(huán)狀顯示。用載體D交換最初的克隆載體B。插入物供體不需包含載體。本發(fā)明的方法可使得插入物A轉(zhuǎn)移入許多載體中。按照本發(fā)明，可將插入物轉(zhuǎn)移入特殊載體或一步轉(zhuǎn)移入許多載體。此外，可將插入物相繼轉(zhuǎn)移入許多載體，例如，通過使用產(chǎn)物DNA分子作為插入物供體與不同載體供體結(jié)合可達(dá)到這個目的?？蓪⒛康暮怂岱肿愚D(zhuǎn)移入新栽體中，從而產(chǎn)生新產(chǎn)物DNA分子。然后可將新產(chǎn)物DNA分子用作起始物質(zhì)以轉(zhuǎn)移目的核酸分子到新載體中。這樣的相繼轉(zhuǎn)移可在許多不同載體中進(jìn)行多次。因而本發(fā)明可用于克隆或亞克隆核酸分子，并由于方便和簡單，這些方法特別適用于高流通量應(yīng)用。按照本發(fā)明，希望的是選擇出含元件A和D的子代分子而排除掉其它分子，包括一個或多個共合體。方塊和圓團(tuán)是不同套的重組位點(diǎn)(如lox位點(diǎn)或att位點(diǎn))。區(qū)段A或D可包含用于檢測、選擇、表達(dá)、繪圖或測序DNA的至少一個選擇標(biāo)記、表達(dá)信號、復(fù)制起點(diǎn)、或特化功能，其中D用于此實(shí)施方案中。如本文所述，按照本發(fā)明，此方案還可反過來進(jìn)行。然后可將反向反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物(如插入物供體)與一種或許多載體結(jié)合使用，以產(chǎn)生其中許多載體內(nèi)含插入物的新產(chǎn)物分子?？勺鳛樵嗀或D—部分的所需DNA區(qū)段例子包括但不局限于PCR產(chǎn)物、大DNA區(qū)段、基因組克隆或片段、cDNA克隆或片段、功能元件等，以及編碼有用核酸或蛋白質(zhì)的基因或不完整基因。此外，本發(fā)明的重組克隆還可用來制備用于蛋白質(zhì)表達(dá)(天然或融合蛋白質(zhì))和/或基因治療的離體和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體。困1中，此方案提供了含A和栽體D的所需產(chǎn)物，如下所述。首先用重組蛋白質(zhì)在方塊重組位點(diǎn)將插入物供體(含A和B)與載體供體(含C和D)重組，以形成具A-D-C-B的共合體。然后，在圃團(tuán)重組位點(diǎn)處發(fā)生重組，形成產(chǎn)物DNA(A和D)和副產(chǎn)物DNA(C和B)。然而，若期望，可形成兩個或多個不同的共合體以產(chǎn)生兩個或多個產(chǎn)物。在本發(fā)明體外或體內(nèi)重組克隆方法的一個實(shí)施方案中，提供了選擇至少一種所需產(chǎn)物DNA的方法。參考圖2所示質(zhì)粒pEZC726的圖譜可理解這一點(diǎn)。兩個作為例證的重組位點(diǎn)是attP和loxP。在由這些位點(diǎn)確定的一個區(qū)段上有卡那霉素抗性基因，它的啟動子已由來自轉(zhuǎn)座子TnlO的tetOP操縱子/啟動子置換.在缺乏tet阻遏物蛋白質(zhì)時，大腸桿菌RNA聚合酶由tetOP轉(zhuǎn)錄卡那霉素抗性基因。如果tet阻遏物存在，它與tetOP結(jié)合并阻斷卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄。pEZC726的另一區(qū)段具有由組成型啟動子表達(dá)的tet阻遏物基因。由于在與tetR相同區(qū)段上有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，這樣由pEZC726轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是抗氯霉素的，但對卡那霉素敏感。重組反應(yīng)導(dǎo)致tetR基因與受調(diào)節(jié)的卡那霉素抗性基因分離開。這一分離導(dǎo)致接受所需重組產(chǎn)物的細(xì)胞具有卡那霉素抗性。為了證實(shí)體外方法，構(gòu)建了兩套不同的質(zhì)粒。只與Cre重組酶一起使用的一套質(zhì)粒(克隆載體602和亞克隆載體629(圖3))含有l(wèi)oxP和1oxP511位點(diǎn)。與Cre和整合酶一起使用的第二套質(zhì)粒(克隆栽體705和亞克隆載體726(圖2))含有l(wèi)oxP和att位點(diǎn)。用兩種酶時得到所需子代質(zhì)粒的效率比只用Cre的高約60倍。對于只用Cre的反應(yīng)，24個菌落中有19個含所需產(chǎn)物，而對于整合酶加Cre的反應(yīng)，38個菌落中38個均含所需產(chǎn)物質(zhì)粒。當(dāng)適于進(jìn)行重組克隆的特殊目的時，可利用本領(lǐng)域已知的各種各樣其它選擇方案。依個別偏愛和需要而定，許多不同類型的選擇方案可用于本發(fā)明的重組克隆或亞克隆方法中。技術(shù)熟練人員可充分利用可供使法。這樣的DNA區(qū)段包括但不局限于編碼活性的那些DNA,這種活性例如但不局限于RNA、肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，或?yàn)樵揜NA、肽或蛋白質(zhì)提供結(jié)合位點(diǎn)。上文在"選擇方案"的定義中給出了用于設(shè)計(jì)選擇方案的DNA分子例子。另外的例子包括但不局限于(i)用于PCR的新引物位點(diǎn)的產(chǎn)生(例如使事先非并置的兩DNA序列并置在一起)；(ii)包括由限制性內(nèi)切核酸酶或其它DNA修飾酶、化學(xué)物質(zhì)、核酶等作用的DNA序列在內(nèi)；(iii)包括DNA結(jié)合蛋白質(zhì)、RNA、DNA、化學(xué)物質(zhì)等所識別的DNA序列在內(nèi)(例如用作親和標(biāo)記以從群體中選擇出或排除掉(Davis,核酸研究24:702-706(1996);病毒學(xué)雜志69:8027-8034(1995))或?yàn)榱瞬⒅脝幼佣M(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；(iv)通過使用隨機(jī)化的和cDNA衍生的RNA文庫體外選擇與EB病毒表達(dá)RNA相關(guān)之核糖體L22蛋白的RNA配基；(vi)其活性要求特殊取向或并置的功能元件的安置(例如，(a)反式時效果很差的重組位點(diǎn)，當(dāng)置于順式狀態(tài)并有適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)存在時，能導(dǎo)致破壞某些分子群的重組；(例如，可允許體外RNA合成的啟動子序列的重構(gòu)))。RNA可直接使用，或被逆轉(zhuǎn)錄以獲得所需DNA構(gòu)建體；(vii)通過分子的大小(如分級分離)或其它物理特性選擇所需產(chǎn)物；并(viii)包含可使其鑒定出來的特異修飾(如，甲基化)所要求的DNA序列。在本發(fā)明方法中產(chǎn)物和副產(chǎn)物形成后，可于體外或體內(nèi)進(jìn)行選擇步驟，這取決于已任選地在特殊重組克隆步驟中設(shè)計(jì)好了的特殊方案。例如，可為插入物供體和載體供體分子設(shè)計(jì)體外選擇方法。這樣的方案可包括改造起始環(huán)狀載體內(nèi)的稀有限制位點(diǎn)，使得重組后稀有切點(diǎn)在副產(chǎn)物中結(jié)束。因此，當(dāng)將結(jié)合并切割稀有限制位點(diǎn)的限制酶加入體外反應(yīng)混合物中時，帶有該稀有切點(diǎn)的所有DNA分子，即起始DNA分子、共合體及副產(chǎn)物均被切割，從而在目的宿主細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制。例如，區(qū)段B和C(見圖l)中的切割位點(diǎn)可用于選擇去除產(chǎn)物之外的所有分子?；蛘撸绻苓x擇區(qū)段D，例如用B中沒有的藥物抗性基因，則只有C中的切點(diǎn)是需要的。類似地，當(dāng)處理線性DNA分子時可設(shè)計(jì)體外選擇方法?？筛脑旎パa(bǔ)于PCR引物序列的DNA序列，使得它們通過重組克隆方法只轉(zhuǎn)移至產(chǎn)物分子。反應(yīng)完成后，將適當(dāng)引物加入反應(yīng)液中并將樣品進(jìn)行PCR。由此擴(kuò)增全部或部分產(chǎn)物分子。可與各種各樣的宿主細(xì)胞，尤其是大腸桿菌細(xì)胞系一起使用其它的體內(nèi)選擇方案。一種方案是將阻遏物基因置于亞克隆質(zhì)粒的一區(qū)段上，并將由該阻遏物控制的藥物標(biāo)記置于同一質(zhì)粒的其它區(qū)段上。另一方案是將殺傷基因置于亞克隆質(zhì)粒的區(qū)段C上(圖1)。當(dāng)然必須有培養(yǎng)該質(zhì)粒的方法，即必須存在殺傷基因不起殺傷作用的環(huán)境。有許多需要特殊大腸桿菌菌抹的這些已知基因.一種這樣的方案是使用限制酶Dpnl,它只在識別序列GATC被甲基化時才切割。許多廣為人知的通用大腸桿菌菌抹可甲基化GATC序列，但存在一些克隆DpnI可被無害表達(dá)的突變抹。其它的限制酶基因還可作為毒性基因用于選擇。在這樣的情況下，含相應(yīng)甲基化酶編碼基因的宿主可提供受保護(hù)的宿主而用于本發(fā)明中。相似地，ccdB蛋白質(zhì)是DNA回旋酶的強(qiáng)毒性劑，可有效捕獲可裂解復(fù)合體中的回旋酶分子，導(dǎo)致DNA鏈斷裂和細(xì)胞死亡。DNA回旋酶的gyrA亞單元中的突變，特別是gyrA462突變，賦與抗ccdB抗性(Bernard和Couturier,分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Bio.)226(1992)735-745)。已構(gòu)建了含gyrA462突變的大腸桿菌菌抹DB2。ccdB不殺傷含表達(dá)ccdB基因之質(zhì)粒的DB2細(xì)胞。此菌抹可獲自LifeTechnologies并已于1997年10月14日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)，1815NorthUniversityStreet,Peoria,IL61604USA，保藏號NRRLB-21852。當(dāng)然，為其它宿主生物可設(shè)計(jì)類似選擇方案。例如，已改造TnlO的tet阻遏物/操縱子以控制真核生物中的基因表達(dá)(Gossen，M.，和Bujard，H.，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:5547-5551(1992))。因而本文舉例說明的用tet阻遏物對藥物抗性進(jìn)行的相同控制或本文所述的其它選擇方案可用于選擇真核細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物。重組蛋白質(zhì)在本發(fā)明中，通過使用重組蛋白質(zhì)，包括重組酶和相關(guān)的輔助因子及蛋白質(zhì)，可完成DNA區(qū)段的交換。本領(lǐng)域中描述了多種重組蛋白質(zhì)。這些重組酶的例子包括Cre:來自噬菌體PI的蛋白質(zhì)(Abremski和Hoess,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Che邁.)259(3):1509-1514(1984))，它催化被稱為loxP位點(diǎn)(交換位點(diǎn))的34bpDNA序列之間的交換(即引起重組)(參閱Hoess等人，核酸研究14(5):2287(1986))。Cre可從商業(yè)途徑得到(Novagen，目錄號69247-1)。Cre介導(dǎo)的重組是隨意可逆的。從熱力學(xué)方面考慮，Cre介導(dǎo)的整合(在兩分子間重組形成一個分子)比Cre介導(dǎo)的切除(同一分子中兩loxP位點(diǎn)之間重組，形成兩子代分子)效率低得多，這并不出乎意料。如本領(lǐng)域眾所周知，Cre在含鎂或亞精胺作為輔因子的簡單緩沖液中可起作用。DNA底物可以是線性的或超螺旋的。已描述了許多突變loxP位點(diǎn)(Hoess等人，見上文)。其中之一的loxP511與另一1oxP511位點(diǎn)重組，但不與loxP位點(diǎn)重組。整合酶來自噬菌體入的一種蛋白質(zhì)，可介導(dǎo)入基因組整命入大腸桿菌染色體。噬菌體入整合酶重組蛋白質(zhì)可促進(jìn)其底物att位點(diǎn)間的重組，這是溶原狀態(tài)形成或誘導(dǎo)的一部分。重組反應(yīng)的可逆性在整合和切除重組中以兩條獨(dú)立途徑發(fā)生。每條途徑使用獨(dú)特但重疊的含att位點(diǎn)DNA的一套15個蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。涉及4種蛋白質(zhì)(Int，Xis，IHF和FIS)的協(xié)同和竟?fàn)幭嗷プ饔脹Q定了重組的方向。整合重組涉及Int和IHF蛋白及位點(diǎn)attP(240bp)和attB(25bp)。重組導(dǎo)致形成兩新位點(diǎn)attL和attR。切除重組需要Int、IHF和Xis及位點(diǎn)attL和attR以產(chǎn)生attP和attB。在一定條件下，F(xiàn)IS刺激切除重組。除了這些正常反應(yīng)之外，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)置于同一分子上時，attP和attB能促進(jìn)切除重組產(chǎn)生兩種切除產(chǎn)物，一種帶attL,—種帶attR。類似地，存在Int、IHF和Xis時含attL和attR的分子間的分子間重組可導(dǎo)致整合重組及attP和attB的產(chǎn)生。因而，通過在DNA區(qū)段側(cè)翼置入改造的att位點(diǎn)的適當(dāng)組合，存在恰當(dāng)重組蛋白質(zhì)時，可互為逆反應(yīng)地進(jìn)行切除或整合重組。每一att位點(diǎn)含15bp核心序列，功能上比較重要的各序列元件位于此共同核心內(nèi)、外及跨越其邊界(Landy，A.,生化年鑒(Ann.Rev.Biochem.)58:913(1989))。多個att位點(diǎn)間的有效重組要求重組雙方間中心共同區(qū)的序列相同，然而，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該具體序列是可被修飾的。因而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)核心內(nèi)有改變的att位點(diǎn)衍生物至少與天然核心序列一樣有效地重組。整合酶可使噬菌體入上的attP位點(diǎn)(約240bp)與大腸桿菌基因組中的attB位點(diǎn)(約25bp)重組(Weisberg，R.A.和Undy，A.《Umbdan》一書,第211頁(1983)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室))，產(chǎn)生側(cè)翼有attL(約100bp)和attR(約160bp)位點(diǎn)的整合入基因組。在缺乏Xis時(見下文)，此反應(yīng)基本上不可逆。由整合酶和IHF介導(dǎo)的整合反應(yīng)在含亞精胺的筒單緩沖液中可于體外進(jìn)行?？砂碞ash,H.A.,酶學(xué)方法(MethodsofEnzymology)100:210-216(1983)所述獲得整合酶。按Filutowicz,M.，等人，基因147:149-150(1994)中所述可獲得IHF。依據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指示，還可使用來自多種生物的許多重組系統(tǒng)。參閱如Hoess等人，核酸研究14(6):2287(1986);Abremski等人，生物化學(xué)雜志261(1):391(1986);Campbell,細(xì)菌學(xué)雜志174(23):7495(1992);Qian等人，生物化學(xué)雜志267(11):7794(1992);Araki等人，分子生物學(xué)雜志225(1):25(1992))。其中的許多屬于重組酶的整合酶家族(Argos等人，EMBOJ.5:433-440(1986))。也許其中研究得最清楚的是來自噬菌體A的整合酶/att系統(tǒng)(Landy,A.(1993)遺傳學(xué)及發(fā)育中的最新觀點(diǎn)(CurrentOpinionsinGeneticsandDevel.)3:699-707)、來自喧菌體PI的Cre/loxP系統(tǒng)(Hoess和Abre邁ski(1990)《核酸和分子生物學(xué)》(NucleicAcidsandMolecularBiology),第4巻,Eckstein和Lilley編，Berlin-Heidelberg:Springer-Verlagi第90-109頁)、及來自釀酒酵母2y環(huán)狀質(zhì)粒的FLP/FRT系統(tǒng)(Broach等人，細(xì)胞29:227—234(1982))。位點(diǎn)特異性重組酶另一家族一一解離酶家族的成員也是已知的(如Y，Tn3解離酶，Hin,Gin和Cin)也是已知的。此重組酶高度相關(guān)家族的成員一般局限于分子內(nèi)反應(yīng)(如倒置和切除)，并可能需要宿主編碼的因子。已分離出了對宿主因子的一些要求(Maeser和Kahnmann(1991)分子與普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)230:170-176)及分子內(nèi)重組的一些約束因素減少的突變體。相似于A整合酶及相似于PICre的其它位點(diǎn)特異性重組酶可替代整合酶和Cre。這樣的重組酶是已知的。許多情況下本領(lǐng)域中已描述了所說的其它重組酶的純化。假使它們不是已知的，則可利用就Cre和整合酶所描述的方法使用細(xì)胞提取物或部分純化這些酶。為舉例需要詳細(xì)描述了Cre和Int，但還有許多相關(guān)重組酶系統(tǒng)，按本發(fā)明也提供了它們在所述發(fā)明中的應(yīng)用。位點(diǎn)特異性重組酶的整合酶家族可用于為本發(fā)明提供可替代的重組蛋白質(zhì)和重組位點(diǎn)，例如由噬菌體入、phi80、P22、P2、186、P4和PI編碼的位點(diǎn)特異性重組蛋白質(zhì)。此組蛋白質(zhì)的序列之間差異極大。盡管存在此多樣性，但所有的重組酶可在它們的C端部分對此排布?？拷麮末端的40殘基區(qū)在所有蛋白質(zhì)中是特別保守的，與酵母2p質(zhì)粒Flp蛋白近C末端的區(qū)域同源。在此家族內(nèi)有三個位置非常保守在高保守C末端區(qū)域內(nèi)相應(yīng)的排布位置396、399和433處發(fā)現(xiàn)有組氨酸、精氨酸和酪氨酸。這些殘基參與此家族重組酶的活性位點(diǎn)，提示在鏈切割和再連接期間酪氨酸433與DNA會形成瞬時共價(jià)連接。參閱，如Argos，P.等人，EMBOJ.5:433-40(1986)。一些轉(zhuǎn)座子的重組酶，例如接合轉(zhuǎn)座子(如Tn916)的重組酶(Scott和Churchward,1995，微生物學(xué)年鑒(AnnRevMicrobiol)49:367;Taylor和Churchward,1997,細(xì)菌學(xué)雜志179:1837)屬于重組酶的整合酶家族，并在某些情況下顯出對特異整合位點(diǎn)的強(qiáng)選擇性(Ike等人1992，細(xì)菌學(xué)雜志174:1801;Trieu-Cuot等人，1993，分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol)8:179)?；蛘撸琁S231和其它蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)座因子可用作重組蛋白質(zhì)和重組位點(diǎn)。蘇云金芽孢桿菌是昆蟲病原菌，其毒性是由于孢子嚢中存在有抗農(nóng)業(yè)害蟲及人和動物疾病載體活性的內(nèi)毒素晶體。編碼這些毒性蛋白的大部分基因是質(zhì)粒產(chǎn)生的，通常在結(jié)構(gòu)上與插入序列(IS231、IS232、IS240、ISBT1和ISBT2)和轉(zhuǎn)座子(Tn4430和Tn5401)有關(guān)。數(shù)個這樣的可移動因子已顯示有活性，并參與晶體基因遷移，從而對細(xì)菌毒性的變化起一定作用。iso-IS231因子的結(jié)構(gòu)分析表明它們與產(chǎn)氣莢膜梭菌的IS1151有關(guān)，與大腸桿菌的IS4和IS186關(guān)系較遠(yuǎn)。象其它的IS4家族成員一樣，它們包含其它IS家族和逆轉(zhuǎn)錄病毒中存在的保守轉(zhuǎn)座酶-整合酶基元。此外，從大腸桿菌中IS231A收集的有用數(shù)據(jù)顯示了轉(zhuǎn)座的一種非復(fù)制方式，對特異目標(biāo)有優(yōu)先性。在枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌中也獲得相似的結(jié)果。參閱，如Mahillon，J.等人，Genetica93:13-26(1994);Campbell,細(xì)菌學(xué)雜志7495-7499(1992)。重組酶的非相關(guān)家族一一轉(zhuǎn)座酶也已用于在復(fù)制子之間轉(zhuǎn)移遺傳信息。轉(zhuǎn)座子在結(jié)構(gòu)上可變，可以是簡單型或復(fù)合型，但一般編碼側(cè)翼有方向相反地組織的DNA序列的重組酶基因。轉(zhuǎn)座子的整合可以是隨機(jī)或高度特異的。諸如Tn7之類高度位點(diǎn)特異的代表已應(yīng)用于在復(fù)制子之間有效移動DNA區(qū)段(Lucklow等人，1993,病毒學(xué)雜志(J.Virol)67:4566-4579)相關(guān)因子一一整合子也轉(zhuǎn)座地促進(jìn)藥物抗性盒從一復(fù)制子移入另一復(fù)制子。這些因子經(jīng)常是缺損轉(zhuǎn)座子的衍生物。轉(zhuǎn)座子Tn21含有稱為In2的I類整合子。來自In2的整合酶(IntIl)對此類的所有整合子是普遍的，可介導(dǎo)兩個59bp因子間或一個59bp因子與attI位點(diǎn)間的重組，能導(dǎo)致插入受體整合子。整合酶還催化切除重組。Hall，1997，CibaFoundSymp207:192;Francia等人，1997，細(xì)菌學(xué)雜志179:4419)。n組內(nèi)含子是編碼催化性RNA及蛋白質(zhì)的可移動遺傳因子。蛋白質(zhì)成分具有逆轉(zhuǎn)錄酶、成熟酶和內(nèi)切核酸酶活性，而RNA具有內(nèi)切核酸酶活性并決定內(nèi)含子將整合的靶位點(diǎn)序列。通過修飾RNA序列部分，可限定因子發(fā)生整合的位點(diǎn)?？蓪⑼庠碊NA序列引入內(nèi)含子末端之間，使得定向于特異位點(diǎn)。稱為反尋靶的此過程通過DNA:RNA中間物進(jìn)行，該中間物被復(fù)制成cDNA，最終復(fù)制成雙鏈DNA(Matsuura等人，基因及發(fā)育(GenesandDev)1997;Guo等人，EMBOJ,1997)。已筌定了許多內(nèi)含子編碼的尋靶內(nèi)切核酸酶(Belfort和Roberts,1997，NAR25:3379)。可容易地采用這樣的系統(tǒng)以應(yīng)用于所述亞克隆方法中?？梢杂靡阎囼?yàn)確定為驅(qū)動重組反應(yīng)而加入的重組酶量。特別是，可以用滴定試驗(yàn)確定純化重組酶的適當(dāng)量或提取物的適當(dāng)量。改造的重組位點(diǎn)以上重組酶及相應(yīng)重組酶位點(diǎn)適于按本發(fā)明在重組克隆中使用。然而，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明方法中時，野生型重組位點(diǎn)可能包含有會降低重組反應(yīng)效率或特異性或者產(chǎn)物分子功能的序列。例如，attB、attR、attP、attL和loxP重組位點(diǎn)中在兩條鏈的多種閱讀框架內(nèi)含有多個終止密碼子，因而翻譯效率降低，如在編碼序列必須通過重組位點(diǎn)的情況下即是如此(在loxP和attB位點(diǎn)的每條鏈上只有一個閱讀框架)，或者不能進(jìn)行翻譯(在attP、attR或at讓內(nèi))因而，本發(fā)明還提供可克服這些問題的改造重組位點(diǎn)。例如，可將att位點(diǎn)改造為具有1個或多個突變，以增強(qiáng)重組反應(yīng)的特異性或效率及產(chǎn)物DNA的特性(如attl、att2和att3位點(diǎn))；降低逆反應(yīng)(如從attR中去除PI和HI)。對這些突變體的檢測可確定哪些突變體有足夠的重組活性，適于按本發(fā)明進(jìn)行重組亞克隆.因此，為了增強(qiáng)位點(diǎn)特異性重組，可將突變引入重組位點(diǎn)。這樣的突變包括但不局限于可使得編碼融合蛋白的無翻譯終止密碼子的重組位點(diǎn)；由相同蛋白質(zhì)識別但堿基序列不同的重組位點(diǎn)，以使它們大量或廣泛地與其同源的對方反應(yīng)，從而發(fā)生多重反應(yīng)；及阻止重組位點(diǎn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的突變。由反應(yīng)混合物中存在的具體重組各方可確定發(fā)生哪種特定反應(yīng)。例如，用含重組位點(diǎn)attRl和attLl;和attB3;attRl;attP3和loxP;和/或attR3與loxP;和/或attR3與attL2的親代質(zhì)粒可完成三聯(lián)蛋白質(zhì)融合。將特異突變引入核酸序列有一些眾所周知的方法。其中的許多已描述于Ausubel，F(xiàn).M.等人,分子生物學(xué)最新方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology),WileyInterscience,紐約(1989-1996)中?？稍诠押塑账嶂性O(shè)計(jì)突變，并用于修飾現(xiàn)有的克隆序列或用于擴(kuò)增反應(yīng)中。如果有恰當(dāng)?shù)倪x擇方法可用于分離所需突變型DNA或RNA，則還可應(yīng)用隨機(jī)誘變。通過用眾所周知的方法將核酸測序可證實(shí)所需突變的存在。以下非限制方法可用于修飾或突變給定重組位點(diǎn)的核心區(qū)，以提供可用于本發(fā)明的突變位點(diǎn)1.用位點(diǎn)特異性(如用attL和attR得到attB)或其它(如同源)重組機(jī)制使兩親代DNA序列重組，其中親代DNA區(qū)段含有導(dǎo)致最終突變核心序列的一個或多個堿基改變；2.直接突變或誘變(位點(diǎn)特異性、PCR、隨機(jī)、自發(fā)等)所需核心序列；3.誘變親代DNA序列(位點(diǎn)特異性、PCR、隨機(jī)、自發(fā)等)，將它們重組以產(chǎn)生所需核心序列；4.逆轉(zhuǎn)錄編碼所需核心序列的RNA;及5.從頭合成(化學(xué)合成)具所需堿基改變的序列。以取決于預(yù)期特殊性質(zhì)的方式可證實(shí)突變體重組位點(diǎn)的功能性。例如，通過表達(dá)適當(dāng)融合蛋白可證實(shí)重組位點(diǎn)中翻譯終止密碼子的缺乏。產(chǎn)物，可證實(shí)同源各方間重組的特異性。重組位點(diǎn)中的其它所需突變可包括限制位點(diǎn)的存在或缺乏、翻譯或轉(zhuǎn)錄起始信號、蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)及核酸堿基序列的其它已知功能性。可按已知方法步驟利用在重組位點(diǎn)中有特殊功能作用的遺傳選擇方案。例如，為(從不相互作用的一對位點(diǎn))提供確實(shí)相互作用的各方而對位點(diǎn)進(jìn)行修飾可通過對編碼毒性物質(zhì)的DNA序列進(jìn)行刪除或在位點(diǎn)間重組達(dá)到。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可容易地設(shè)計(jì)選擇去除了翻譯終止序列的位點(diǎn)、存在或缺乏蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)等等的方案。因此，本發(fā)明提供了含有至少一個DNA區(qū)段的核酸分子，該DNA區(qū)段具有位于選擇標(biāo)記和/或所需DNA區(qū)段側(cè)翼的至少兩個改造重組位點(diǎn)，其中至少一個所說重組位點(diǎn)包含具至少一個改造突變的核心區(qū)，該突變可促進(jìn)共整合DNA或產(chǎn)物DNA形成中的體外重組。雖然在優(yōu)選實(shí)施方案中重組位點(diǎn)序列不同且不相互作用，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到含相同序列的位點(diǎn)可經(jīng)加工而抑制相互重組。這方面內(nèi)容也在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，可在這些位點(diǎn)之一附近加上一個蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在有識別該位點(diǎn)的蛋白質(zhì)存在時，重組酶不能進(jìn)入該位點(diǎn)，因此優(yōu)先使用其它位點(diǎn)。在共合體中，該位點(diǎn)不再起作用，因?yàn)樗驯桓淖儯鐝腶ttB改變?yōu)閍ttL。在共合體的分離中，可滅活該蛋白質(zhì)(如通過抗體、加熱或改變緩沖液)，第二位點(diǎn)可發(fā)生重組。核酸分子可具有賦與該重組至少一種下述增強(qiáng)作用的至少一個突變，該增強(qiáng)作用基本上選自(i)有利于整合；(ii)有利于重組；(ii)減少對宿主因子的需求；(iii)提高該共合體DNA或產(chǎn)物DNA形成的效率；及(iv)提高該共合體DNA或產(chǎn)物DNA形成的特異性。核酸分子優(yōu)選包含書f生自attB、attP、attL或attR的至少一個重組位點(diǎn)，如attR'或attP'。如本文所述，att位點(diǎn)更優(yōu)選選自attl、att2或att3。在優(yōu)選實(shí)施方案中，核心區(qū)包含選自下組的DNA序列(a)RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB(m-att)(SEQIDNO:1);(b)AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB(m-attB)(SEQIDNO:2);(c)GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB(m-attR)(SEQIDNO:3);(d)AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB(m-attL)(SEQIDNO:4);(e)GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB(m-attPl)(SEQIDNO:5);(f)RBYCW6CTTTYTTRTACWAASTKGD(n-att)(SEQIDNO:39);(g)ASCCWGCTTTYTTRTACWAASTKGW(n-attB)(SEQEDNO:40);(h)ASCCWGCTTTYTTRTACWAAGTTGG(n-attL)(SEQIDNO:41);(i)GTTCAGCTTTYTTRTACWAASTKGW(n-attR)(SEQIDNO:42);①GTTCAGCTTTYTTRTACWAAGTTGG(n-attP)(SEQIDNO:43);或者相應(yīng)或互補(bǔ)DM或RNA序列，其中R=A或G;K=G或T/U;Y=C或T/U;W=A或T/U;N=A或C或G或T/U;S=C或G;B=C或G或T/U，如37C.F.R§1.822中所述(該文獻(xiàn)在此全部引用作為參考)，其中核心區(qū)在一個或多個閱讀框架中不包含終止密碼子。核心區(qū)還優(yōu)選包含選自下組的DNA序列(a)AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attB1)(SEQIDNO:6);(b)AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attB2)(SEQIDNO:7);(c)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT(attB3)(SEQIDNO:8);(d)GTTCAGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attRl)(SEQIDNO:9);(e)GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attR2)(SEQIDNO:10);(f)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT(attR3)(SEQIDNO:II);(g)AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attLl)(SEQIDNO:12);(h)AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2)(SEQIDNO:13);(i)ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL3)(SEQIDNO:14);(j)GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attPl)(SEQIDNO:15);(k)GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2,P3)(SEQIDNO:16);或者相應(yīng)或互補(bǔ)DNA或RNA序列。本發(fā)明還提供了用于制備核酸分子的方法，包括提供具至少一個改造重組位點(diǎn)的核酸分子，該重組位點(diǎn)含有與至少上述序列之一具至少80-99%同源性(或其中任何范圍或值)的至少一個DNA序列，或任何適合的重組位點(diǎn)，或在本領(lǐng)域所知的嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與其雜交的序列。顯然，這種眾所周知的體外和體內(nèi)選擇方法有多種類型和可替換方式，為了筒潔的緣故，本文不對它們逐一描述。然而，這樣的變化和替換方式也包括在內(nèi)，視為本發(fā)明不同的實(shí)施方案。尤為重要的是，作為體外重組反應(yīng)優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)果，通過本重組克隆方法可加工PCR產(chǎn)物之類非生物分子。在一個實(shí)施例中，可以將線性分子克隆入環(huán)狀載體中。本發(fā)明有許多應(yīng)用。這些用途包括但不局限于改變載體、安置啟動子和基因、構(gòu)建融合蛋白的基因、改變拷貝數(shù)、改變復(fù)制子、克隆入噬菌體，及克隆如PCR產(chǎn)物(在一端帶attB位點(diǎn)，另一端帶loxP位點(diǎn))、基因組DNA和cDNA。載體供體按照本發(fā)明，任何載體可用于構(gòu)建本發(fā)明的栽體供體。尤其是，可改造成包括可用于本發(fā)明方法中的一個或多個重組位點(diǎn)。這樣的載體可獲處例如VectorLaboratoriesInc.,InVitrogen，Promega,Novagen，NEB，Clontech,BoehringerMannheim,Pharmacia,EpiCenter，OriGenesTechnologiesInc.，Stratagene，PerkinElmer，Pharmingen，LifeTechnologiesInc.及ResearchGenetics。這樣的載體可用于例如克隆或亞克隆目的核酸分子。特殊目的載體的通常種類包括原核和/或真核克隆栽體、表達(dá)載體、融合載體、雙雜交或反向雙雜交栽體、用于不同宿主的穿梭載體、誘變載體、轉(zhuǎn)未載體、用于接收大插入物的載體等等。其它的感興趣載體包括病毒起源載體(M13載體、噬菌體入載體、腺病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)，高、低和可調(diào)節(jié)拷貝數(shù)載體，具有相容性復(fù)制子、可聯(lián)合用于單個宿主的載體(pACYC184和pBR322)以及真核游離型復(fù)制載體(pCDM8)。感興趣的特殊載體包括原核表達(dá)載體，例如pcDNAII,pSL30I'pSE280,pSE380,pSE420,pTrcHis入B,C,pRSET入B,C(InvitrogeAInc.),pGEMEX-l,pGEMEX-2(Promega,Inc.),thepETvectors(Novagen,Inc.),pTrc99入pKK223-3'thepGEXvectors,pEZZ18,pRIT2T'pMC1871(Pharmacia,Inc.),pKK233-2pKK388-l(Clontech,Inc.),和pProEx-HT(LifeTechnologies,Inc.)及其變體和衍生物。載體供體還可由真核表達(dá)載體制備，夯!J如pFastBac,pFastBacHT，pFastBacDUAL,pSFV,pTet-Splice(LifeTechnologies,Inc.),pEUK-Cl,pPUR^pMAM，pMAMneo,pBIlOl，pBI121，pDR2，pCMVEBNA^pYACneo(Clontech),pSVK3,pSVL,pMSG,pCHl10,pKK232-8(Pharmacia,Inc.),p3'SS'pXTl，pSG5,pPbac,pMbac，pMClneo,pOG44(Stratagene,Inc.),pYES2,pAC360,pBlueBacHisA>B，C,pVL1392,pBsueBacIII,pCDM8，pcDNAl,pZeoSV，pcDNA3pREP4,pCEP4，pEBVHis(Invitr。gen,Inc.)及其變體或衍生物。特別感興趣的其它載體包括pUC18，pUC19，pBlueScript,Psport，粘粒，噬菌粒，YAC(酵母人工染色體)，BAC(細(xì)菌人工染色體)，Pl(大腸桿菌噬菌體)，pQE70，pQE60，pQE9(quagan)，pBS載體，PhageScript載體，BlueScript載體，pNH8A,pNH16人pNH18入pNH46A(Stratagene),pcDNA3(InVitrogen),pGEXpTrsfiis,pTrc99入pET-5,pET-9，pKK223-3，pKK233-3，pDR540,pRIT5(Pharmacia),pSPORTl,pSP0RT2,pCMVSPORT2.0pSV-SPORTI(LifeTechnologies,Inc.)及其變體或衍生物.感興趣的其它載體包括:pTrxFus,pThioHis,pLEX,pTrcHis,pTrcHis2,pRSET,pBlueBacHis2,pcDNA3.1/His,pcDNA3.1(-)/Myc-His,pSecTag,pEBVHis,pPIC9K,pPIC3.5K,pA0815,pPICZ，pPICZa,pGAPZ,pGAPZcc,pBlueBac4.5,pBlueBacHis2'plvielBac,pSinRep5'pSinHis,pIND,pIND(SPl),pVgRXR^pcDNA2.1.pYES2,pZErOl.l,pZErO-2.1,pCR-Blunt,pSE280,pSE380,pSE420,pVL1392,pVL1393,pCDM8,pcDNAl.l,pcDNAl.1/Amp,pcDNA3.1,pcDNA3.1/Zeo,pSe,SV2,pRc/CMV2,pRc/RSV，pREP4,pREP7，pREP8，pREP9，pREP10,pCEP4，pEBVHis,pCR3.1,pCR2.1,pCR3.1-Uni,和pCRBac(Invitrogen);久ExCell,入gtll，pT^c99AJpKK223-3,pGEX-UT,pGEX-2T,pGEX-2TK,pGEX-4T-l,pGEX-4T-2,pGEX~4T-3，pGEX-3X，pGEX-5X-l,pGEX-5X-2,pGEX-5X-3'pEZZ18,pRIT2T,pMCl71，pSVK3，pSVL,pMSG,pCH110，pKK232-8，pSL1180,pNEO,和pUC4K(Pharmacia);pSCREEN-lb(+)，pT7Blue(R),pT7Blue-2，pCITE-4abc(+)，pOCUS-2，pTAg,pET-32LIC,pET-30LIC,pBAC-2cpLIC，pBACgus-2cpLIC,pT7Blue-2UC，pT7Blue-2，久SCREEN-l,久BlueSTAR^pET-3abcd,pET糧7abc，pET9abcd，pETllabcd，pET12abc,pET-14b,pET-15b,pET醫(yī)16b,pET-17b-pET-17xb，pET-19b,pET-20b(+)，pET-21abcd(+)，pET-22b(+)，pET-23abcd(+)，pET-24abcd(+)，pET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET-28abc(+),pET-29abc(+),pET-30abc(+),pET-31b(+)，pET-32abc(+)，pET-33b(+),pBAC-1,pBACgus-1，pBAC4x-1，pBACgus4x-1,pBAC-3cp,pBACgus-2cp,pBACsurf-1,pig,Signalpig,pYX^SelectaVecta-Neo,SelectaVecta-Hyg,和SelectaVecta-Gpt(Novagen);pLexA,pB42AD,pGBT9，pAS2-l，pGAD424,pACT2，pGADGL,pGADGH,pGAD10，pGilda，pEZM3，pEGFP，pEGFP-l,pEGFP-N,pEGFP-C,pEBFP，pGFPuv,pGFP，p6xHis-GFPipSEAP2-Basic,pSEAP2-Contra1,pSEAP2-Promoter,pSEAP2-Enhancer，p(5gal-Basic,p卩gal-Control，p卩gal-Promoter,p(3gal-Enhancer,pCMV(3,pTet-Off'pTet-On,pTK-Hyg,pRetro-Off,pRetro-On,pIRESlneo,p!RESlhyg,pLXSN,pLNCX;pLAPSN,pMAMneo,pMAMneo-CAT,pMAMneo-LUC,pPUR^pSV2neo，pYEX4T-l/2/3,pYEX-Sl,pBacPAK-Hi§，pBacPA^8/9,pAcUW31,BacPAJL6，pTrip正x,XgtlO,久gtll,pWE15，和VTriplEx(Clontech);LambdaZAPII，pBK-CMV,pBK-RSV,pBIuescriptIIKS+/-,j)BluescriptIISK+/-,pAD-GAL4，pBD-GAL4Cam,pSurfscript,LambdaFIXII，LambdaDASH，LambdaEMBL3，LambdaEMBL4，SuperCos,pCR-ScrigtAmp,pCR-ScriptCam,pCR-ScriptDirect,pBS+/-,pBCKS+/-，pBCSK+/-,Phagescript,pCAL-n-EK,pCAL-n,pCAL-c,pCAL-kc,pET-3abcd,pET-llabcd,pSPUTKpESP-1,pCMVLacI,pOPRSWMCS,pOPI3CAT,pXTl，pSG5，pPbac,pMbac,pMClneo'pMClneoPoly入pOG44,pOG45，pFRT卩GAL，pNEO(3GAL,pRS403，pRS404,pRS405'pRS406,pRS413,pRS414,pRS415，和pRS416(Stratagene).特別引人注意的雙雜交和反向雙雜交載體包括pPC86，pDBLeu，pDBTrp,pPC97,p2.5，pGADl-3，pGADlO,pACt,pACT2,pGADGL,pGADGH,pAS2-l，pGAD424,pGBT8,pGBT9,pGAD-GAL4,pLexA^pBD-GAL4，pfflSi,pHISi-l，placZi,pB42AD,pDG202,pJK202,pJG4-5,pNLexA,pYESTrp及其變體或衍生物。聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的優(yōu)選多肽(即能催化從RNA模板合成DNA分子的那些多肽)包括但不局限于莫洛尼鼠類白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶、勞氏肉瘤病毒(RSV)逆轉(zhuǎn)錄酶、禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶、勞氏相關(guān)病毒(RAV)逆轉(zhuǎn)錄酶、成髓細(xì)胞瘤相關(guān)病毒(MAV)逆轉(zhuǎn)錄酶、人類免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶、乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、花椰茱花葉病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和細(xì)菌逆轉(zhuǎn)錄酶。特別優(yōu)選的是那些具逆轉(zhuǎn)錄酶活性、而RNaseH活性實(shí)質(zhì)性降低了的多肽(即"RNaseH_"多肽)。"RNaseH活性實(shí)質(zhì)性降低"的多肽表示該多肽的RNaseH活性是諸如野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶之類野生型或RNaseH+酶的RNaseH活性的約20%以下，更優(yōu)選約15%、10%或5%以下，最優(yōu)選約2%以下。可用各種各樣的試驗(yàn)測定RNaseH活^i，例如以下文獻(xiàn)美國專利號5,244,797，Kotewicz,M.L.等人,核酸研究16:265(1988)及Gerard,G.F.，等人，焦點(diǎn)(FOCUS)14(5):91(1"2)中所述的試驗(yàn)，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均在此全文引入作為參考。可用于本發(fā)明的合適RNaseH多肽包括但不局限于M-MLVH—逆轉(zhuǎn)錄酶、RSVH—逆轉(zhuǎn)錄酶、AMVH逆轉(zhuǎn)錄酶、RAVH逆轉(zhuǎn)錄酶、MAVH逆轉(zhuǎn)錄酶、HIVH逆轉(zhuǎn)錄酶及可購自例如LifeTechnologies,Inc.(Rockville，Maryland)的SUPERSCRIPTI逆轉(zhuǎn)錄酶和SUPERSCRIPTn逆轉(zhuǎn)錄酶。具有適用于本發(fā)明之核酸聚合酶活性的其它多肽包括嗜熱DNA聚合酶，例如DNA聚合酶I、DNA聚合酶m、Klenow片段、T7聚合酶及T5聚合酶，和耐熱DNA聚合酶，包括但不局限于嗜熱棲熱菌(7力e27zwstAejr邁o/力jf7〃s,7Y力)DNA聚合酶、水生棲熱菌(7Xer邁iAsa《wa"cws,7^《)DNA聚合酶、那不勒斯棲熱袍菌(r力e27ffoto《azzeo/o7ita/7a,7>e)DNA聚合酶、海棲熱袍菌(r力ei7^to《a邁ariW巡a,7i/a)DNA聚合酶、7^e2"忍ococcM7"c^ah、(77/或VENT)DM聚合酶、激烈熱球菌(/yrococcws/iw/asws,/Yw或DEEPVENT)DNA聚合酶、沃氏熱球菌(/yrococcus『oow'力/Vo)DNA聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(AaciZ/f/sstejrot力er邁o/力〃w;s,Sst)DNA聚合酶、嗜酸熱硫化葉菌(5"W/oA^〃sac!Vocaicfe"'叫5^c)DNA聚合酶、嗜酸熱原菌(r力er邁o/77as邁ascjVo/力j7w2/,rac)DNA聚合酶、黃棲熱菌(7Xer邁ws/7aKWs,7Y7/n/A)DNA聚合酶、紅棲熱菌(7Xer邁tfs7Y/Zer,7iv/)DNA聚合酶、7Xer逝wsZ^och'朋〃s(DYNAZYME)DNA聚合酶、熱自養(yǎng)甲烷桿菌Ufet力朋o》a"e".咖^rer范o卵^tro/7AYc做,i/if力)DNA聚合酶，及其突變體、變體和書1"生物。相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員應(yīng)能理解，本文所述方法和應(yīng)用的合適修飾和改變是很顯而易見的，可不脫離本發(fā)明范圍或其任何實(shí)施方案地進(jìn)行?，F(xiàn)已詳述本發(fā)明，通過參考以下實(shí)施例將對其有更清晰的理解，所附實(shí)施例只為了說明的目的，并非旨在限制本發(fā)明。實(shí)施例本重組克隆方法可達(dá)到核酸區(qū)段的交換，得到對使用者有用的東西，例如克隆載體的改變。這些區(qū)段必須在兩側(cè)有相互為正確取向的重組信號。在以下實(shí)施例中，兩親代核酸分子(如質(zhì)粒)被稱為插入物供體和載體供體。插入物供體包含將與載體供體提供的新載體連接的區(qū)段。含兩始發(fā)分子的重組中間體被稱為共合體。第二次重組產(chǎn)生兩子代分子，稱產(chǎn)物(所需新克隆)和副產(chǎn)物。緩沖液有多種已知緩沖液可用于本發(fā)明的反應(yīng)中。對于限制酶，建議使用制造商推薦的緩沖液。一些可替代的緩沖液可容易地在文獻(xiàn)中找到或可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員設(shè)計(jì)。實(shí)施例1-3。用于A整合酶的一種示范援沖液包含50邁MTris-HCl(pH7.5-7.8)，70邁MKC1，5mM亞精胺，0.5mMEDTA，和0.25mg/ml牛血清白蛋白，及任選的10%甘油。用于P1Cre重組酶的一種優(yōu)選緩沖液含50mMTris-HC1(pH7.5)，33mMNaCl,5mM亞精胺，及0.5mg/ml牛血清白蛋白。用于類似于A整合獰和PlCre的其它位點(diǎn)特異性重組酶的緩沖液是本領(lǐng)域已知的，或可由技術(shù)熟練人員憑經(jīng)驗(yàn)確定，尤其是可參照上述緩沖液確定。實(shí)施例1:用Cre和Cre&Int進(jìn)行重組克隆為了以兩種不同方式進(jìn)行體外重組克隆，構(gòu)建了兩對質(zhì)粒。用loxP和att位點(diǎn)構(gòu)建的一對質(zhì)粒pEZC705和pEZC726(圖2A)與Cre和入整合酶一起使用。另一對質(zhì)粒pEZC602和pEZC629(圖3A)含用于Cre的loxP(野生型)位點(diǎn)，及第二個突變型lox位點(diǎn)1oxP511，它與loxP有一個堿基不同(共34個堿基中)。對本發(fā)明重組克隆的最小要求是每一質(zhì)粒中有兩重組位點(diǎn)，一般是X和Y，及X'和r。如果兩類位點(diǎn)或任一類位點(diǎn)可重組形成共合體(如X和X')，并且兩類位點(diǎn)或任一類位點(diǎn)可重組而從共合體中切出產(chǎn)物和副產(chǎn)物質(zhì)粒(如Y和Y')，則發(fā)生重組克隆。同一質(zhì)粒上的重組位點(diǎn)不重組，這一點(diǎn)是重要的。已發(fā)現(xiàn)可只用Cre進(jìn)行本重組克隆。只用Cre構(gòu)建兩質(zhì)粒以證實(shí)這一觀點(diǎn)(見圖3A)。pEZC629是載體供體質(zhì)粒.它包含組成型藥物標(biāo)記(氯霉素抗性)、復(fù)制起點(diǎn)、loxP和1oxP511位點(diǎn)、條件性藥物標(biāo)記(表達(dá)受轉(zhuǎn)座子TnlO之四環(huán)素抗性操縱子的操縱基因/啟動子控制的卡那霉素抗性)、及編碼tet阻遏物蛋白質(zhì)的組成型表達(dá)基因tetR。含pEZC629的大腸桿菌細(xì)胞抗30pg/ml的氯霉素，但對100yg/ml的卡那霉素敏感。pEZC602是插入物供體質(zhì)粒，含不同的藥物標(biāo)記(氨芐青霉素抗性)、起點(diǎn)及位于多克隆位點(diǎn)側(cè)翼的loxP和1oxP511位點(diǎn)。此實(shí)驗(yàn)包含以下兩部分第一部分將pEZC602和pEZC629各約75ng混合于總體積30p1的Cre緩沖液(50mMTris-HClpH7.5，33mMNaCl，5mM亞精胺-HCl,500Pg/ml牛血清白蛋白)中。將兩10/i1等份試樣轉(zhuǎn)移入新管中。一管中加入0.5n1Cre蛋白質(zhì)(約4個單位/p1;按Abremski和Hoess,生物化學(xué)雜志259:1509(1984)部分純化)。兩管均于37"C溫育30分鐘，然后70TCIO分鐘。稀釋每一反應(yīng)的等份試樣并將其轉(zhuǎn)化入DH5ct。表達(dá)后，將等分試樣鋪于30Mg/ml氯霉素；100pg/ml氨芐青霉素加200pg/ml二甲氧基笨青霉素；或100ng/ml卡那霉素的板上。結(jié)果見表1。無Cre的反應(yīng)物得到1.llx106個氨千青霉素抗性菌落(來自插入物供體質(zhì)粒pEZC602);7.8x105個氯霉素抗性菌落(來自載體供體質(zhì)粒pEZC629);及140個卡那霉素抗性菌落(背景)。加入Cre的反應(yīng)物得到7.5x105個氨千青霉素抗性菌落(來自插入物供體質(zhì)粒pEZC602);6.1x105個氯霉素抗性菌落(來自載體供體質(zhì)粒pEZC629);及760個卡那霉素抗性菌落(背景菌落和來自重組克隆產(chǎn)物質(zhì)粒的菌落的混合物)。分析因?yàn)榇嬖贑re時卡那霉素平板上的菌落數(shù)高得多，預(yù)計(jì)它們中的許多或絕大多數(shù)含所需產(chǎn)物質(zhì)粒。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>第二部分從"+Cre"卡那霉素平板上挑出24個菌落，接種于含100Hg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中。進(jìn)行小量制備，并將用SmaI或Hindffl切割或未切割的小量制備DNA進(jìn)行電泳。結(jié)果24個小量制備物中有19個顯示有產(chǎn)物質(zhì)粒預(yù)計(jì)大小的超螺旋質(zhì)粒。所有的19個均顯示有預(yù)計(jì)的Smal和Hindm限制片段。分析這證實(shí)了只有Cre的方案。具體地說，測出得到約70%(24個中有19個)的產(chǎn)物克隆。效率約為O.1%(從6.1x105個氯霉素抗性菌落得到760個卡那霉素抗性克隆)。Cre加整合酶用于證明此方法的質(zhì)粒與上文所用質(zhì)?；旧项愃疲皇禽d體供體質(zhì)粒pEZC726不含1oxP511，而代之以attP位點(diǎn)插入物供體質(zhì)粒pEZC705不含1oxP511，而代之以attB位點(diǎn)(圖2A)。此實(shí)驗(yàn)包括以下三部分第一部分用Seal切約500ng的pEZC705(插入物供體質(zhì)粒)，在氨芐青霉素抗性基因內(nèi)將質(zhì)粒線性化。(這樣做是因?yàn)檫^去已用線性狀態(tài)的attB質(zhì)粒進(jìn)行了入整合酶反應(yīng)(H.Nash，私人通信)。可是，后來發(fā)現(xiàn)兩種質(zhì)粒均是超螺旋時也可很好地進(jìn)行整合酶反應(yīng)。)然后，將線性質(zhì)粒乙醇沉淀并溶于20m1入整合酶緩沖液(50mMTris-HC1(約pH7.8)，70mMKC1，5mM亞精胺-HCl,0.5mMEDTA，250Mg/ml牛血清白蛋白)中。此外，將約500ng載體供體質(zhì)粒pEZC726乙醇沉淀并溶于20[il入整合酶緩沖液中。臨用前，將入整合酶(2Ml，393jig/ml)解凍并通過加入18p1冷X整合酶緩沖液進(jìn)行稀釋。將1p1IHF(整合宿主因子，2.4mg/ml，一種輔助蛋白質(zhì))稀釋到150p1冷入整合酶緩沖液中。將各DNA等分試樣(2pl)與含或不含入整合酶和IHF各lpl的入整合酶緩沖液混合，總體積10p1。將混合物于25"C溫育45分鐘，然后70t:IO分鐘。將每種反應(yīng)液的一半加到瓊脂糖凝膠上。結(jié)果存在整合酶和IHF時，約5%的總DNA轉(zhuǎn)變成線性共合體形式。分析整合酶和IHF的活性得到證實(shí)。第二部分將每種反應(yīng)液(即含或不含整合酶和IHF)3ml稀釋劑27MlCre緩沖液(上述)中，然后將各反應(yīng)液分成兩個10p1的等分試樣(共4份)。往這些反應(yīng)液的兩份中加0.5|i1Cre蛋白質(zhì)(上述)，并將所有反應(yīng)液于37"C溫育30分鐘，然后70rIO分鐘。往每份反應(yīng)液中加TE緩沖液(90m1;TE:10mMTris-HC1，pH7.5，lmMEDTA),并用各1M1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot將轉(zhuǎn)化混合物鋪于含100pg/ml氨芐青霉素加200pg/ml二甲氧基笨青霉素；30yg/ml氯霉素；或100[ig/ml卡那霉素的平板上。結(jié)果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*整合酶反應(yīng)液還包含IHF分析Cre蛋白質(zhì)削弱了轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)校正這種效果時，與對照反應(yīng)相比，使用Cre和整合酶時，卡那霉素抗性菌落數(shù)目增加超過100倍。這顯示特異性大于99%。第三部分從整合酶加Cre平板上挑出38個菌落，小量制備DNA,并用Hindm酶切以得到診斷作圖信息。結(jié)果所有38個菌落均具有預(yù)期片段大小。分析觀察到與只用Cre相比，Cre加入整合酶的方法具有高得多的特異性。結(jié)論Cre加入整合酶的方法得到證實(shí)。其效率和特異性比只用Cre時高得多。實(shí)施例2:用體外重組克隆法將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因亞克隆入用于真核細(xì)胞表達(dá)的載體(圖4A)構(gòu)建插入物供體質(zhì)粒pEZC843，其中含有克隆于loxP和attB位點(diǎn)之間的大腸桿菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，使得loxP位點(diǎn)置于該基因的5'端(圖4B)。構(gòu)建載體供體質(zhì)粒pEZC1003,它包含與loxP位點(diǎn)并置的巨細(xì)胞病毒真核啟動子(圖4C)。在10pl反應(yīng)液中混合ln1等分試樣各超螺旋質(zhì)粒(約50ng小量制備粗DNA)，該反應(yīng)液含等份入整合酶緩沖液(50mMTris-HC1，pH7.8，70mMKC1，5mM亞精胺，0.5mMEDTA,0.25mg/ml牛血清白蛋白)和Cre重組酶緩沖液(50mMTris—HC1，pH7.5，33mMNaCl，5mM亞精胺，0.5mg/ml牛血清白蛋白)，2個單位Cre重組酶，16ng整合宿主因子及32ngA整合酶。30X3溫育30分鐘再溫育10分鐘后，用lMl轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a(LifeTechnologies,Inc)。將轉(zhuǎn)化反應(yīng)等分試樣鋪于含200pg/ml卡那霉素的瓊脂平板上，37t:溫育過夜。另一幾乎相同的對照反應(yīng)只含載體供體質(zhì)粒。接受10%對照反應(yīng)轉(zhuǎn)化液的平板長出一個菌落；接受10%重組克隆反應(yīng)液的平板長出144個菌落。這些數(shù)字表明超過99%的重組克隆菌落含所需產(chǎn)物質(zhì)粒。6個重組克隆菌落的小量制備DNA有預(yù)期大小質(zhì)粒(5026個堿基對)一一CMVProd。對所有6個質(zhì)粒用Ncol進(jìn)行限制消化，均有預(yù)計(jì)克隆于CMV啟動子下游的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶片段。實(shí)施例3:側(cè)翼為無終止密碼子的attB位點(diǎn)的亞克隆DNA區(qū)段第一部分背景以上實(shí)施例適于轉(zhuǎn)錄融合，其中轉(zhuǎn)錄貫穿重組位點(diǎn)進(jìn)行。然而，attR和loxP位點(diǎn)二者在兩條鏈上均包含多個終止密碼子，因此當(dāng)編碼序列必須跨越重組位點(diǎn)時，翻譯融合就很困難(在loxP位點(diǎn)的每條鏈上均只有一個閱讀框架可利用)或是不可能的(在attR或attL中)。亞克隆的主要原因是為了融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。例如，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)結(jié)構(gòu)域與目的蛋白質(zhì)融合可使得該蛋白質(zhì)能通過在谷胱甘肽瓊脂糖(Pharmacia,Inc.,1995目錄)上親和層析而進(jìn)行純化。如果將目的蛋白質(zhì)與連續(xù)組氨酸產(chǎn)品(例如His6)融合，則可以在含金屬離子的螯合樹脂(Qiagen，Inc.)上通過親和層析純化該融合蛋白質(zhì)。經(jīng)常期望比較氨基端和羧基端融合的活性、溶解度、穩(wěn)定性等等。檢查噬菌體A整合系統(tǒng)的attB位點(diǎn)能否作為loxP位點(diǎn)的替換物，因?yàn)樗鼈冚^小(25bp)，且具有一些序列靈活性(Nash,H.A.等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)84:4049-4053(1987))。以前并未指出進(jìn)行多重突變除去所有終止密碼子可得到適用于重組亞克隆的重組位點(diǎn)。利用入噬菌體位點(diǎn)特異性重組中的標(biāo)準(zhǔn)命名法(Weisber,《Lamdaffl》〉，Hendrix等人編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1989))，可將參與大腸桿菌宿主細(xì)胞中重組反應(yīng)的核苷酸區(qū)域表示如下attP--P1--H1--P2--X--H2--C-0-C,--H,--P,l--P,2--P，3-_attB—B-O-B,--Int,IHFHtXis,Int,工HFattR—PI—HI—P2—X—H2—C-O-B1—+attL—B-O-C,—H,--P,l—P'2—P,3—,其中0代表在噬菌體和大腸桿菌基因組中均發(fā)現(xiàn)有的15bp核心DNA序列；B和B'代表與大腸桿菌基因組核心鄰近的約5個堿基；Pl、Hl、P2、X、H2、C、C'、H'、P'1、P'2和P'3代表噬菌體人基因組內(nèi)編碼蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的已知DNA序列。存在蛋白質(zhì)Xis(切除酶)時反應(yīng)是可逆的；在attL和attR之間的重組準(zhǔn)確地從其整合狀態(tài)中切除A基因組，再生出含attP的環(huán)狀入基因組和含attB的線性大腸桿菌基因組。第二部分構(gòu)建和檢驗(yàn)含突變型att位點(diǎn)的質(zhì)粒構(gòu)建突變型attL和attR位點(diǎn)。重要的是，Landy等人(生化年鑒58:913(1989))觀察到attP的PI和HI結(jié)構(gòu)域缺失可促進(jìn)切除反應(yīng)并消除整合反應(yīng)，從而使切除反應(yīng)不可逆地進(jìn)行。因此，當(dāng)在attR中引入突變時，還刪除掉P1和H1結(jié)構(gòu)域。本實(shí)施例中attR'位點(diǎn)無Pl和Hl區(qū)，并除去了Ndel位點(diǎn)(堿基27630從C改變成G),它包含相當(dāng)于噬菌體X同等序列27619-27738的序列(GenBankrelease92.0,bg:LAMCG,"噬菌體X的完整序列")。野生型at讓和attR位點(diǎn)重組產(chǎn)生的attB序列是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>弟乂麥竭f為斜體字并用下劃線標(biāo)出。注意attL、attR和attP的序列可來自attB序列及attL和attR中所含的入噬菌體邊界(同等序列27619-27818)。當(dāng)突變型attR1—(attR')和attLl位點(diǎn)重組時，產(chǎn)生序列attBl(突變用粗體、大鉛字表示)B0B，attBl:5,agcctGCTTTTTtGtAcAaACTTGT33，tcggaCGAAAAAaCaTgTtTGAACAs(SEQ.IDNO:6)(SEQ.IDNO:45)注意4個終止密碼子已去除。當(dāng)將附加突變引入attRl(attR')和attLl序列(粗體)中時，產(chǎn)生attR2(attR')和attL2位點(diǎn)。attR2和attL2重組產(chǎn)生attB2位點(diǎn)B0attB2:5'AGCCTGCTTtGtTGTACAAA3,tcggaCGAAAGaACATGTTTCTTGT3'(SEQ'IDNO:7)GAACA5'(SEQ'ID上述attL和attR，位點(diǎn)的重組活性鑒定如下。用attLwt、attLl或attL2替代質(zhì)粒pEZC705(圖2B)的attB位點(diǎn)。用attRwt、attRl(attR，，缺乏P1和H1區(qū))或attR2(attR，，缺乏Pl和Hl區(qū))置換質(zhì)粒pEZC726(圖2C)的attP位點(diǎn)。因此，所得質(zhì)?？捎蒀re介導(dǎo)通過它們的loxP位點(diǎn)重組，由Int、Xis和IHF介導(dǎo)通過它們的attR'和attL位點(diǎn)重組。混合各對質(zhì)粒，并與Cre、Int、Xis和IHF反應(yīng)，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并鋪于含卡那霉素的瓊脂上。結(jié)果如表3所示表3<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>C各轉(zhuǎn)化物的1%鋪于卡那霉素平板上)以上數(shù)據(jù)顯示雖然野生型att和attl位點(diǎn)重組程度較小，而attl和att2位點(diǎn)相互間的重組水平檢測不到。第三部分當(dāng)目的DNA區(qū)段側(cè)翼的兩attB位點(diǎn)之核心區(qū)不含終止密碼子時，證實(shí)有重組。已發(fā)現(xiàn)參加質(zhì)粒的物理狀態(tài)影響重組效率。將適當(dāng)?shù)腶tt位點(diǎn)移入pEZC705和pEZC726以制備質(zhì)粒pEZC1405(圖5G)(attR'1和att!T2)和pEZC1502(圖5H)(attLl和attL2)。此實(shí)驗(yàn)中的所需DNA區(qū)段是克隆于pEZC1502兩attL位點(diǎn)之間的一拷貝氯霉素抗性基因。用Int、Xis和IHF(不用Cre，因?yàn)椴淮嬖?oxP位點(diǎn))體外重組質(zhì)粒對。每種質(zhì)粒各100ng溫育于lOpl反應(yīng)液中，該反應(yīng)液含50inMTrisHC1pH約7.8，16.5mMNaCl，35mMKC1，5roM亞精胺，0.25mMEDTA，0.375mg/mlBSA，3%甘油，還包含有8.lngIHF、43ngInt、4.3ngXis和2個單位Cre。反應(yīng)液251C溫育45分鐘，65"IO分鐘，將lpl等分試樣轉(zhuǎn)化入DH5a細(xì)胞，并鋪于卡那霉素平板上。測定了兩親代質(zhì)粒均為環(huán)狀或一質(zhì)粒環(huán)狀另一線性時所需卡那霉素抗性菌落的得率，如表4所示表4載體供體1插入物供體1卡那霉素抗性菌落2環(huán)狀pEZC1405無30環(huán)狀pEZC1405環(huán)狀pEZC15022680線性pEZC1405無90線性pEZC1405環(huán)狀pEZC1502172000環(huán)狀pEZC1405線性pEZC1502730001用Qiagen柱純化DNA，以A260測濃度，用XbaI(pEZC1405)或AlwNI(pEZC1502)線性化。每反應(yīng)液含100ng所示DNA。所有的反應(yīng)液(共10pl)含3pl酶混合物(Xis，Int，和IHF)。溫育后(25C45分鐘，65°CIO分鐘)，將lp1用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞。2整個轉(zhuǎn)化反應(yīng)液(lml)鋪于平板上時預(yù)計(jì)產(chǎn)生的菌落數(shù)。實(shí)際上用100p1或1ji1轉(zhuǎn)化液鋪板。分析使用突變型attR和attL位點(diǎn)進(jìn)行重組克隆已證實(shí)。將所需DNA區(qū)段亞克隆于任一條鏈上均不含任何終止密碼子的attB位點(diǎn)之間。產(chǎn)物DNA(當(dāng)一親代是線性時)得率的增加是未預(yù)料到的，因?yàn)楦绲臅r候觀察到當(dāng)兩參加分子均為超螺旋且蛋白質(zhì)有限時，切除反應(yīng)更有效(Nunes-Duby等人，細(xì)胞50:779-788(1987)。實(shí)施例4:無反向重復(fù)序列之重組克隆的證明第一部分基本原理以上實(shí)施例3顯示含恰當(dāng)重組位點(diǎn)(例如，在質(zhì)粒pEZC1502中的attLl和attL2)(圖5H)反向重復(fù)序列的質(zhì)粒可重組以產(chǎn)生側(cè)翼有無終止密碼子、且取向相反的attB位點(diǎn)的所需DNA區(qū)段。所研究的是反向重復(fù)序列的體內(nèi)和體外影響，例如，側(cè)翼有相反取向之a(chǎn)ttB位點(diǎn)的所需DNA區(qū)段的轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生可能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)從而抑制翻譯的單鏈RNA分子。通過將位點(diǎn)置于正向重復(fù)排列形式，可避免相似重組位點(diǎn)的相反取向。如果每個親代質(zhì)粒均具有正向重復(fù)的野生型attL和野生型attR位點(diǎn)，Int、Xis和IHF蛋白質(zhì)將簡單的在分子內(nèi)反應(yīng)中去除側(cè)翼有那些位點(diǎn)的DNA區(qū)段。然而，以上實(shí)施例3中所述突變位點(diǎn)表明抑制分子內(nèi)反應(yīng)而使分子間重組按預(yù)計(jì)進(jìn)行是可能的。第二部分用于重組克隆之無反向重復(fù)序列的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)用相反取向的attL2置換質(zhì)粒pEZC1405(圖5G)中的attR2序列以制備pEZC1603(圖6A)。用相反取向的attR2置換pEZC1502(圖5H)的attL2序列以制備pEZC1706(圖6B)。這些質(zhì)粒中的每一個在核心區(qū)內(nèi)含突變，使attl和att2核心間的分子內(nèi)反應(yīng)非常4氐效(見實(shí)施例3，上文)。在Qiagen柱(Qiagen，Inc.)上純化質(zhì)粒pEZC1405、pEZC1502、pEZC1603和pEZC1706。用XbaI將質(zhì)粒pEZC1405和pEZC1603樣品線性化。用AlwNI將質(zhì)粒pEZC1502和pEZC1706樣品線性化。將100ng質(zhì)?；旌先牒琁nt(43.5ng)、Xis(4.3ng)和IHF(8.lng)、終體積10g1的緩沖液(50mMTrisHC1pH約7.8，16.5mMNaCl，35mMKC1，5mM亞精胺，0.25mMEDTA，0.375mg/mlBSA,3%甘油)中。反應(yīng)液25匸溫育45分鐘，65X:IO分鐘，用lp1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。表達(dá)后，將等分試樣鋪于含200ng/ml卡那霉素的瓊脂平板上并于371C溫育。結(jié)果用菌落數(shù)/pl重組反應(yīng)液表示，如表5所示表5<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>分析在所有的構(gòu)型，即環(huán)狀或線性中，pEZC1405xpEZC1502對(att位點(diǎn)為反向重復(fù)構(gòu)型)比pEZC1603xpEZC1706對(att位點(diǎn)突變以避免發(fā)夾形成)更有效。pEZC1603xpEZC1706對比pEZC1405xpEZC1502對背景更高，效率更低。盡管效率較低，但預(yù)計(jì)從pEZC1603xPEZC1706反應(yīng)液得到的80%或更多菌落含所需質(zhì)粒產(chǎn)物。在所有情況下，將其中一個成員線性化激發(fā)了反應(yīng)。第三部分產(chǎn)物質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的證實(shí)將來自線性pEZC1405(圖5G)x環(huán)狀pEZC1502(圖5H)、環(huán)狀pEZC1405x線性pEZC1502、線性pEZC1603(圖6A)x環(huán)狀pEZC1706(圖6B)和環(huán)狀pEZC1603x線性pEZC1706反應(yīng)液各6個菌落分別挑出并接種于豐富培養(yǎng)基中，小量制備DNA。用Sspl進(jìn)行診斷性酶切，產(chǎn)生了所有24個菌落的預(yù)計(jì)限制片段。分析同一分子上帶突變型attL和attR位點(diǎn)的質(zhì)粒間的重組反應(yīng)以高度特異性得到所需質(zhì)粒產(chǎn)物。實(shí)施例5:用毒性基因進(jìn)行重組克隆第一部分背景只有在A被dam甲基化酶甲基化的情況下，限制酶DpnI才識別序列GATC并切開該序列。最通常使用的大腸桿菌菌抹是dam+。大腸桿菌dam+菌抹內(nèi)Dpnl的表達(dá)是致死的，因?yàn)榧?xì)胞染色體被切成許多小段。然而，在dam細(xì)胞中Dpnl的表達(dá)是無害的，因?yàn)槿旧w不被DpnI酶切。在通常的重組克隆方案中，載體供體含由重組位點(diǎn)分隔的兩區(qū)段C和D,此時所需產(chǎn)物的選擇取決于對存在區(qū)段D并缺乏區(qū)段C進(jìn)行選擇。在最初的實(shí)施例中，區(qū)段D含有由區(qū)段C上存在阻遏物基因負(fù)調(diào)控的藥物抗性基因(Km)。當(dāng)C存在時，含D的細(xì)胞不能抗卡那霉素，因?yàn)榭剐曰虮魂P(guān)閉了。Dpnl基因是可替代上文實(shí)施方案中的阻遏物基因的毒性基因例子。如果區(qū)段C表達(dá)DpnI基因產(chǎn)物，則轉(zhuǎn)化質(zhì)粒CD到dam+宿主中將殺死該細(xì)胞。如果將區(qū)段D轉(zhuǎn)移入新質(zhì)粒，例如通過重組克隆，則隨后的藥物標(biāo)記選擇將是成功的，因?yàn)槎拘曰虿辉俅嬖凇５诙糠钟肈pnI作為毒性基因構(gòu)建載體供體利用引物5'CCACCACAAACGCGTCCATGGMTTACACTTTAATTTAG3'(SEQIDNO:17)和5'CCACCACAAGTCGACGCATGCCGACAGCCTTCCAAATGT3'(SEQIDNO:18)，并以含DpnI基因的質(zhì)粒(衍生自從SanfordA.Lacks,BrookhavenNationalLaboratory,Upton，紐約得到的質(zhì)粒；也可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號ATCC67494)作為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼DpnI內(nèi)切核酸酶的基因。通過用含所需堿基改變的引物擴(kuò)增已有的attL和attR'結(jié)構(gòu)域，將另外的突變分別引入attL和attK'的B和B'區(qū)。突變型attL3(用寡聚Xis115制備)和attR'3(attR'，用寡聚Xis112制備)的重組產(chǎn)生具以下序列的attB3(粗體為與attBl不同處)BOB'ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT(SEQIDNO:8)TGGGTCGAAAGAACATGTTTCACCA(SEQIDNO:47)將attL3序列克隆于已有的基因供體質(zhì)粒中代替attL2，產(chǎn)生質(zhì)粒pEZC2901(圖7A)。將attR'3序列克隆于已有的載體供體質(zhì)粒中代替attR'2,產(chǎn)生質(zhì)粒pEZC2913(圖7B)。將Dpnl基因克隆入質(zhì)粒pEZC2913中，以置換tet阻遏物基因。產(chǎn)生的載體供體質(zhì)粒被稱為pEZC3101(圖7C)。當(dāng)將pEZC3101轉(zhuǎn)化入dam—菌抹SCSllO(Stratagene)時，產(chǎn)生了數(shù)以百計(jì)的菌落。當(dāng)將同一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入dam+菌抹DH5a時，只產(chǎn)生了1個菌落，即使DH5a細(xì)胞的感受態(tài)能力比SCS110細(xì)胞高約20倍。當(dāng)將不含Dpnl基因的相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入相同的這兩個細(xì)胞系中時，從SCS110細(xì)胞產(chǎn)生了28個菌落，而從DH5a細(xì)胞產(chǎn)生了448個菌落。這表明Dpnl基因在質(zhì)粒pEZC3101(圖7C)上得到表達(dá)且它殺死dam+DH5a細(xì)胞而非damSCS110細(xì)胞。第三部分用DpnI選擇證明重組克隆用一對質(zhì)粒通過依賴于毒性基因Dpnl選擇產(chǎn)物而證實(shí)重組克隆。用MluI將質(zhì)粒pEZC3101(圖7C)線性化并與環(huán)狀質(zhì)粒pEZC2901(圖7A)反應(yīng)。第二對質(zhì)粒用做對照，所用選擇方法基于通過阻遏物基因?qū)λ幬锟剐赃M(jìn)行控制用Xbal將質(zhì)粒pEZC1802(圖7D)線性化并與環(huán)狀質(zhì)粒pEZC1502(圖5H)反應(yīng)。將含緩沖液(50mMTrisHC1pH約7.8，16.5mMNaCl，35mMKC1,5mM亞精胺，0.375mg/mlBSA,0.25mMEDTA，2.5%甘油)和蛋白質(zhì)Xis(2.9ng)、Int(29ng)和IHF(5.4ng)的8yl反應(yīng)液25"C溫育45分鐘，然后75"C10分鐘，用1p1等分試樣轉(zhuǎn)化DH5a(即dam+)感受態(tài)細(xì)胞，如表6中所示。表6反應(yīng)號載體供體選擇基礎(chǔ)插入物供體菌落1pEZC3101/MluDpnI毒性…32pEZC3101/MluDpnI毒性環(huán)狀pEZC290140003pEZC1802/XbaTet阻遏物…04pEZC1802/XbaTet阻遏物環(huán)狀pEZC150212100從反應(yīng)#2的4個菌落中小量制備DNA，并用限制酶SspI酶切。所有菌落均得到預(yù)計(jì)片段。分析以毒性基因進(jìn)行選擇的亞克隆得到證實(shí)。產(chǎn)生了具預(yù)計(jì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒。實(shí)施例6:用尿嘧啶DNA糖基化酶克隆基因及通過重組克隆亞克隆該基因以制備融合蛋白質(zhì)第一部分將現(xiàn)存表達(dá)載體轉(zhuǎn)變成用于重組克隆的載體供體可用于將現(xiàn)存載體轉(zhuǎn)變成有功能的載體供體的DNA盒制備如下。用Apal和KpnI消化質(zhì)粒pEZC3101(圖7C)，用T4DNA聚合酶和dNTP處理以使末端變平，再進(jìn)一步用Smal、Hpal和AhrNI消化使不期望有的DNA片段變小，并將含attR'1-CfflR-DpnI-attR'-3結(jié)構(gòu)域的2.6kb盒進(jìn)行凝膠純化。被純化盒的濃度估計(jì)約為75ngDNA/m1。質(zhì)粒pGEX-2TK(圖8A)(Pharmacia)可使得谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和能讀框一致地插入其多克隆位點(diǎn)的任何第二編碼序列之間融合。用S邁al消化pGEX-2TKDNA并以堿性磷酸酶處理。將約75ng的以上純化DNA盒與約100ngpGEX-27K載體在5jil連接液中連接2.5小時，然后用lpl轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BRL3056細(xì)胞(DH10B的dam—衍生物；可購得的dam—菌抹包括來自LifeTechnologies,Inc.的DM1和來自Stratagene的SCSllO)。將轉(zhuǎn)化混合物的等分試樣鋪于含lOOng/ml氨千青霉素(存在于pGEX-2TK中的抗性基因)和30mg/ml氯霉素(存在于DNA盒中的抗性基因)的LB瓊脂板上。挑出菌落并小量制備DNA。通過用EcoRI進(jìn)行診斷性酶切確定pGEX-2TK中盒的取向。具所需取向的質(zhì)粒被稱為pEZC3501(圖8B)。第二部分以三種閱讀框架將報(bào)道基因克隆入重組克隆基因供體質(zhì)粒尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)克隆是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入克隆載體的一種方法(美國專利號5,334,515,在此全文引入作為參考)。簡潔地說，就是用在其5'末端胸腺嘧啶堿基位置處含尿嘧啶堿基的引物進(jìn)行所需DNA區(qū)段的PCR擴(kuò)增。當(dāng)將該P(yáng)CR產(chǎn)物與酶UDG溫育時，尿嘧啶堿基被特異除去。這些堿基的丟失削弱了PCR產(chǎn)物DM末端的堿基配對，當(dāng)于合適溫度(如371C)溫育時，所說產(chǎn)物的末端主要是單鏈。如果在含與PCR產(chǎn)物3'端互補(bǔ)之突出3'尾部的線性克隆載體存在時進(jìn)行所說的溫育，堿基配對使PCR產(chǎn)物有效地與克隆載體退火。當(dāng)通過轉(zhuǎn)化將退火產(chǎn)物引入大腸桿菌細(xì)胞時，體內(nèi)加工有效地將其轉(zhuǎn)變成重組質(zhì)粒。能將任何PCR產(chǎn)物克隆于所有三個閱讀框架中的UDG克隆載體如下制備自pEZC3201(圖8K)。8個寡核苷酸均獲自LifeTechnologies,Inc.(書寫方向均為5'—3'):rfl上(GGCCGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTAT丁TTCAGGGT)(SEQ.IDNO:19),rfl下(CAGGTTTTCGGTCGTTGGGATATCGTAATC)(SEQ.IDNO:20),rf2上(GGCCAGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGT)(SEQ.IDNO:21)，rf2下(CAGGTTTTCGGTCGTTGGGATATCGTAATCT)(SEQ.IDNO:22),rf3上(GGCCAAGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGT)(SEQ.EDNO:23)'rl3下(CAGGTTTTCGGTCGTTGGGATATCGTAATCTT)(SEQ.IDNO:24),羧基上(ACCGTTTACGTGGAC)(SEQ.IDNO:25)和羧基下(TCGAGTCCACGTAAACGGTTCCt)ACTTATTA)(SEQ.IDNO:26).用T4多核苷酸激酶將rfl、2和3頂鏈和羧基底鏈在其5'端磷酸化，然后雜交每對互補(bǔ)鏈。用NotI和SalI切質(zhì)粒pEZC3201(圖8K),將所切質(zhì)粒的等分試樣與羧基-寡核苷酸雙鏈體(SalI末端)和任一rfl、rf2或rf3雙鏈體(NotI末端)混合(10pg被切質(zhì)粒(約5pmol)與250pmol羧基寡核苷酸雙鏈體混合，分成3個20m1的等分，往每份反應(yīng)液中加5p1(250pmol)的rfl、rf2或rf3雙鏈體和1=2個單位T4DNA連接酶)。室溫連接90分鐘后，將各反應(yīng)液加到制備瓊脂糖凝膠上，洗脫2.lkb載體帶并溶于50m1TE中第三部分CAT和phoA基因的PCR引物獲自LifeTechnologies,Inc.，用于從質(zhì)粒pACYC184中擴(kuò)增氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因及從大腸桿菌中擴(kuò)增phoA—堿性磷酸酶基因。引物具有含尿嘧啶堿基的12堿基5'延伸，以致用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)處理PCR產(chǎn)物會削弱DNA各個末端的堿基配對，并允許3'鏈與上述rfl、2和3載體的突出3'端退火。引物的序列(書寫方向5'-3')是CAT左，UAUUUUCAGGGUATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACC(SEQ.IDNO:27);CAT右，UCCCACUUAUUACGCCCCGCCCTGCCACTCATC(SEQ.IDNO:28);phoA左，UAUUUUCAGGGUATGCCTGTTCTGGAAAACCGG(SEQ.IDNO:29);phoA右，UCCCACUUAUUATTTCAGCCCCAGGGCGGCTTTC(SEQ.IDNO:30).然后將引物用于以已知方法步驟進(jìn)行的PCR反應(yīng)中(見，如美國專利號5,334,515，在此全文引入作為參考)，用這些引物獲得聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物含具起始ATG但無任何轉(zhuǎn)錄信號的CAT或phoA基因。此外，在氨基末端含尿嘧啶的序列編碼TEV蛋白酶切割位點(diǎn)(LifeTechnologies,Inc.),在羧基末端上的那些含尿嘧啶序列編碼連續(xù)TAA無義密碼子。將未純化PCR產(chǎn)物(約30ng)與凝膠純化的線性rfl、rf2或rf3克隆栽體(約50ng)混合于含1XKEact4緩沖液(LTI)和1個單位UDG(LTI)的10pl反應(yīng)液中。37TC30分鐘后，將各反應(yīng)1/i1等分試樣轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5a細(xì)胞(LTI)并鋪于含50g/ml卡那霉素的瓊脂板上。挑出菌落并小量制備DNA，DNA的分析顯示CAT基因已克隆于閱讀框架l(pEZC3601)(圖8C)、閱讀框架2(pEZC3609)(圖8D)和閱讀框架3(pEZC3617)(圖8E)中，phoA基因已克隆于閱讀框架1(pEZC3606)(圖8F)、閱讀框架2(pEZC3613)(圖8G)和閱讀框架3(pEZC3621)(圖8H)。第4部分將來自UDG克隆載體的CAT或phoA亞克隆入GST融合載體用如下重組克隆構(gòu)建以所有3種閱讀框架編碼GST和CAT或phoA之間融合體的質(zhì)粒。用ClaI線性化GST載體供體pEZC3501(圖8B)的小量制備DNA(如上所迷來自Pharmacia質(zhì)粒pGEX-2TK)。將約5ng載體供體與含CAT或phoA的適當(dāng)環(huán)狀基因供體載體各約10ng混合于含緩沖液和重組蛋白質(zhì)Int、Xis和IHF(實(shí)施例5)的8pl反應(yīng)液中。溫育后，將lMl各反應(yīng)液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌抹DH5a并鋪于含氨千青霉素平板上，如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>第5部分融合蛋白質(zhì)的表達(dá)將來自各個轉(zhuǎn)化的2個菌落接種于在17xl00咖塑料管(Falcon2059，BectonDickinson)中含lOOpg/ml氨,青霉素的2邁1豐富培養(yǎng)基(CircleGrow,Bio101Inc.)里并37C劇烈振蕩約4小時，此時培養(yǎng)物可見為混濁的。將lffll各培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入含10|1110%(w/v)IPTG的新會中以誘導(dǎo)GST的表達(dá)。追加溫育2小時后，所有培養(yǎng)物具有大約相同的混濁度，培養(yǎng)物的A600是1.5。收獲來自各培養(yǎng)物約0.35ml的細(xì)胞并用樣品緩沖液(含SDS和P-巰基乙醇)處理，將相當(dāng)于約0.15A600單位的細(xì)胞加到Novex4-20%梯度聚丙烯酰胺凝膠上。電泳后用考馬斯蘭將凝膠染色。結(jié)果從所有12種培養(yǎng)物中可觀察到單蛋白質(zhì)帶表達(dá)提高。所觀察到的這些蛋白質(zhì)大小與以三個閱讀框架(通過無終止密碼子的attB重組位點(diǎn))和CAT(圖81)或phoA(圖8J)融合的GST的預(yù)計(jì)大小很好地相關(guān)CATrfl=269個氨基酸；CATrf2二303個氨基酸；CATrf3=478個氨基酸；phoArfl=282個氨基酸；phoArf2=280個氨基酸；及phoArf3=705個氨基酸。分析將CAT和phoA基因均以所有三個閱讀框架亞克隆入GST融合載體，6個融合蛋白質(zhì)的表達(dá)得到證實(shí)。實(shí)施例7:反向重組和通過重組進(jìn)行亞克隆構(gòu)建兩個質(zhì)粒以證實(shí)按本發(fā)明進(jìn)行的反向重組。如上所述，含attB重組位點(diǎn)并被稱為attB親代質(zhì)粒(此栽體可相應(yīng)于產(chǎn)物DNA)的載體pEZC5601(圖IOA)進(jìn)一步含氨節(jié)青霉素抗性基因、復(fù)制起點(diǎn)、attB2位點(diǎn)、四環(huán)素抗性基因和attB0位點(diǎn)。含attP重組位點(diǎn)并稱為attP親代質(zhì)粒(該載體可相應(yīng)于副產(chǎn)物DNA或可相應(yīng)于不同的載體供體DNA)的質(zhì)粒pEZC6701(圖IOB)還包括卡那霉素抗性基因、復(fù)制起點(diǎn)、attP2位點(diǎn)、編碼毒性蛋白ccdB的基因及attP0位點(diǎn)。10X濃度的整合酶緩沖液含0.25MTrisHC1pH7.5、0.25MTrisHC1p朋.0、0.7M氯化鉀、50mM亞精胺HC1、5mMEDTA及2.5mg/mlBSA。注意attPO和attP2含Pl和Hl結(jié)構(gòu)域。將整合酶(1.5pl，435ng/Vl)和IHF(在1X整合酶緩沖液中16ng/pl,1.5m1)與13.5jilIXInt緩沖液混合制成重組酶混合物。配制兩份8pl反應(yīng)液。反應(yīng)A在lx整合酶緩沖液中含300ngpEZC6701質(zhì)粒及1重組酶混合物。反應(yīng)B在IX整合酶緩沖液中含300ngpEZC5601、300ngpEZC6701和1重組酶混合物。兩個反應(yīng)均于25X:溫育45分鐘，然后70t:5分鐘，然后冷卻。將TE緩沖液(792[il10mMTrisHC1pH7.5，lmMEDTA)加入各反應(yīng)中，用lnl該稀釋反應(yīng)液轉(zhuǎn)化入DH5aUltraMax感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(LifeTechnologies,Inc.,Rockville,MD)。在非選擇性培養(yǎng)基中表達(dá)1小時后，將各個轉(zhuǎn)化的十分之一(lOOpl)鋪于含lOOug/ml卡那霉素的瓊脂板上。37t:溫育過夜后，來自反應(yīng)A的平板有1個菌落，而來自反應(yīng)B的平板含392個菌落。從反應(yīng)B平板中挑出12個菌落接種于豐富液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)過夜。將這些培養(yǎng)物的小量制備DM未經(jīng)切割而在瓊脂糖凝膠上電泳，所有的12個均含約3.8kb的質(zhì)粒。用限制酶Clal切割6個小量制備DNA,并與也用Clal切割的pEZC6701(卡那霉素抗性親代質(zhì)粒)一起電泳。Clal切割質(zhì)粒pEZC6701—次，產(chǎn)生約3.8kb的片段。Clal切割6個小量制備DNA兩次，產(chǎn)生約900bp和約2900bp的片段。分析pEZC6701上attP位點(diǎn)與pEZC5601上attB位點(diǎn)之間的重組導(dǎo)致產(chǎn)生了兩子代質(zhì)粒，即含氨千青霉素抗性和ccdB基因的attL產(chǎn)物質(zhì)粒(圖10C)(可相當(dāng)于栽體供體DNA或新的副產(chǎn)物DNA)及含卡那霉素和四環(huán)素抗性基因的attR產(chǎn)物質(zhì)粒(圖10D)(也可相當(dāng)于插入物供體DNA或新的產(chǎn)物DNA)。接受attL產(chǎn)物質(zhì)粒、attP親本質(zhì)粒pEZC6701或重組中間物的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞被毒性ccdB基因產(chǎn)物殺死。接受attB親本質(zhì)粒pEZC5601的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞被卡那霉素選擇殺死。只有接受含卡那霉素和四環(huán)素抗性基因之所需attR產(chǎn)物質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞存活，形成菌落。與只含1種親代質(zhì)粒的反應(yīng)相比，含兩親代質(zhì)粒的反應(yīng)得到大量克隆，表明了選擇策略的成功。反應(yīng)機(jī)制預(yù)計(jì)所需產(chǎn)物質(zhì)粒將包含兩Clal限制位點(diǎn)，一個在來自pEZC6701attP親本質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因中，另一個在來自pEZC5601attB親本質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因中。兩位點(diǎn)的存在及Clal消化產(chǎn)生的片段大小可證實(shí)反應(yīng)機(jī)制。因而，本發(fā)明涉及圖1所示的反向重組反應(yīng)，其中產(chǎn)物DNA和副產(chǎn)物DNA可結(jié)合產(chǎn)生插入物供體DNA和載體供體DNA。此外，本發(fā)明為亞克隆重組作了準(zhǔn)備，其中產(chǎn)物DNA(按圖1產(chǎn)生)可與新載體供體DNA結(jié)合以產(chǎn)生新的產(chǎn)物DNA(在不同的栽體背景下)和新的副產(chǎn)物。實(shí)施例8:線性化片段的亞克隆質(zhì)粒pEZC7102(圖11A),即attP親本質(zhì)粒(可相當(dāng)于載體供體DNA),含區(qū)段attPl、復(fù)制起點(diǎn)、卡那霉素抗性基因、attP3、氯霉素抗性基因及毒性基因ccdB,在本文所述實(shí)驗(yàn)中是超螺旋的。質(zhì)粒pEZC7501(圖IIB)，即attB親本質(zhì)粒(可相當(dāng)于插入物供體DNA或產(chǎn)物DNA),包括克隆于含pCMVSP0RT2.0(LifeTechnologies,Inc.)功能結(jié)構(gòu)域之載體的attBl和attB3位點(diǎn)之間的GFP基因。attP位點(diǎn)含PI和HI結(jié)構(gòu)域。質(zhì)粒pEZC7501使用未切割形式的，或用Seal在氨,青霉素抗性基因內(nèi)線性化，或用Xbal和SalI切割得到含SalI末端、22bp、attBl位點(diǎn)、GFP基因、attB3位點(diǎn)及14bp至Xbal末端的片段SalI末端--22bp--attBl--GFP--attB3--14bp--Xbal末端反應(yīng)(8p1終體積)含DNA各約40ng、IXInt緩沖液(25mMTrisHC1pH7.5,25mMTrisHC1pH8.0，70mMKC1、5mM亞精胺HC1、0.5mMEDTA、和0.25mg/ffllBSA)、12.5%甘油、8ngIHF和43ng入整合酶。反應(yīng)在25"C溫育45分鐘，然后在70TC5分鐘，然后冷卻。將各反應(yīng)液lpl等分試樣兩份轉(zhuǎn)化入DH5aUltraMax細(xì)胞，并雙份鋪于卡那霉素瓊脂板上。只含(超螺旋)pEZC7102的反應(yīng)平均得到2個菌落(約為l-4個)。含pEZC7102和超螺旋pEZC7501的反應(yīng)平均為612個菌落(約為482-762個)。含pEZC7102和線性(Scal切割)pEZC7501的反應(yīng)平均為360個菌落(在約127-605個之間)。含有在具attB位點(diǎn)并在attB位點(diǎn)之外22bp和14bp的片段上的GFP基因(用SalI和XbaI切割pEZC7501)和pEZC7102的反應(yīng)平均得到274個菌落(約為243-308個)。從來自pEZC7102X超螺旋pEZC7501反應(yīng)的4個菌落和來自pEZC7102xpEZC7501/SalI+XbaI反應(yīng)的10個菌落小量制備DNA。將所有14個未切DNA電泳于瓊脂糖凝膠上，用NcoI和PstI混合物酶切割來自pEZC7102xpEZC7501/SalI+XbaI反應(yīng)的10個DNA后電泳于瓊脂糖凝膠上。所有的未切質(zhì)粒大小約為2.8kb。所有10個用Ncol和PstI混合物酶切的質(zhì)粒得到約為700和2100bp的片段。結(jié)果如表8所示表8<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>分析預(yù)計(jì)在質(zhì)粒pEZC7501上的attB位點(diǎn)和質(zhì)粒pEZC7102上的attP位點(diǎn)之間的整合反應(yīng)將產(chǎn)生含有來自pEZC7501之GFP區(qū)段和來自pEZC7102之卡那霉素起點(diǎn)區(qū)段的attL產(chǎn)物質(zhì)粒(圖11C)(相應(yīng)于插入物供體DNA)。預(yù)計(jì)在attP親本質(zhì)粒pEZC7102(相應(yīng)于副產(chǎn)物DNA)上毒性基因ccdB的存在會殺死接受該質(zhì)粒的細(xì)胞。當(dāng)pEZC7501存在時菌落數(shù)目的大大增加表明發(fā)生了預(yù)期反應(yīng)，且即使attB親本質(zhì)粒(相應(yīng)于產(chǎn)物DNA)是線性的(ScaI切)或attB位點(diǎn)和GFP基因存在于除attB位點(diǎn)外僅含很小附加序列的片段上，反應(yīng)的效率也是足夠的。這些結(jié)果表明用本發(fā)明的方法可將線性片段恰當(dāng)?shù)貋喛寺∪氩煌d體中。實(shí)施例9:長PCR片段的克隆設(shè)計(jì)一種PCR產(chǎn)物，使其在一端具有attBO(野生型)位點(diǎn)而在另一端有l(wèi)oxP位點(diǎn)。基本原理是用線性attBO分子(PCR產(chǎn)物)可很好地進(jìn)行attPOxattBO反應(yīng)，(因?yàn)樯婕耙徽５娜胝戏磻?yīng))，且共合體的loxPxloxP切除也是有效的(單分子切除反應(yīng)效率高，用Cre進(jìn)行的雙分子整合反應(yīng)效率低)。含attB之PCR引物的序列是5'-TCCGTTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGMGCCTCGGGGTCAGCATAAGG-3'(SEQIDNO:31)。loxP引物的序列是5'-CCAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGMGTTATTGCCCCTTGGTGACATACTCG-3'(SEQIDNO:32)。這些引物擴(kuò)增人肌球蛋白重鏈的一部分。利用ELONGASETm并以K562人DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行如下。反應(yīng)液(50p1)在ELONGASES叩erMix(LifeTechnologies,Inc.)中含lOOngK562人DNA(LifeTechnologies,Inc.)、0.2PM各引物及0.2mM各dNTP。薄壁管中礦物油下的反應(yīng)液在94"1分鐘，然后按941C30秒、65C30秒、68*C8分30秒循環(huán)35次。熱循環(huán)后，反應(yīng)液4*0保存。凝膠純化5.2kb的PCR產(chǎn)物(圖9A)。質(zhì)粒pEZC1202(圖9B)含野生型attP位點(diǎn)、氯霉素抗性基因、編碼tet阻遏物的基因、野生型loxP位點(diǎn)、復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控轉(zhuǎn)錄卡那霉素抗性基因的tet操縱基因/啟動子。該質(zhì)粒有氯霉素抗性但無卡那霉素抗性，因?yàn)橛少|(zhì)粒某元件產(chǎn)生的tet阻遏物使卡那霉素抗性基因保持關(guān)閉。該實(shí)驗(yàn)中所用pEZC1202DNA是小量制備物，其濃度估計(jì)約為50ng/n1。將約40ng凝膠純化的5.2kbPCR產(chǎn)物加入10p1反應(yīng)液中，該反應(yīng)液于50mMTrisHClpH約7.8、16mMNaCl、35mMKC1、0.25mMEDTA、0.375mg/ml牛血清白蛋白中包含約50ng超螺旋pEZC1202、0.2個單位的Cre重組酶、3.6ngIHF、及l(fā)lngInt。不含PCR產(chǎn)物的第二反應(yīng)作為對照。27X:溫育45分鐘隨后70"C5分鐘后，將1P1等分試樣轉(zhuǎn)化入DH5ctUltraMax感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(LifeTechnologies,Inc.)。將各反應(yīng)混合物的五分之一鋪于含100yg/ml卡那霉素的瓊脂上并37t:溫育平板過夜。含PCR產(chǎn)物的反應(yīng)液得到34個菌落，而缺少PCR產(chǎn)物的反應(yīng)液得到31個菌落。平板室溫放置4天后，在陽性(+PCR產(chǎn)物)反應(yīng)液平板上可見26個額外的小菌落，而在陰性(無PCR產(chǎn)物)反應(yīng)液平板上只見1個額外的小菌落。將26個小菌落中的12個在含25Mg/ml卡那霉素的豐富肉湯培養(yǎng)基(CircleGrow)中培養(yǎng)過夜，并從這些培養(yǎng)物中小量制備DNA。所有的12個小量制備質(zhì)粒大小約為8kb，符合用5.2kbPCR產(chǎn)物置換氯霉素抗性及tet阻遏物基因后的預(yù)期大小。預(yù)計(jì)的重組產(chǎn)物如圖9C中所示。用Aval(預(yù)計(jì)8個位點(diǎn))和BamHI(預(yù)計(jì)4個位點(diǎn))切割這些質(zhì)粒中的兩個。所有的預(yù)計(jì)Aval片段均顯出存在。在兩小量制備DNA中均缺乏PCR產(chǎn)物中預(yù)計(jì)的BamHI位點(diǎn)之一(離attB端最近的一個)，但其它BamHI片段與克隆5.2kbPCR產(chǎn)物的預(yù)期結(jié)構(gòu)一致。分析用5.2kbPCR產(chǎn)物(人肌球蛋白重鏈的一部分)置換pEZC1202中的氯霉素抗性和tet阻遏物基因賦與宿主大腸桿菌細(xì)胞適度的抗卡那霉素抗性，但該抗性不足以使菌落在過夜溫育后長出。因而，含所需重組產(chǎn)物的菌落生長于卡那霉素平板上，但過夜溫育后觀察不到，只有在另外室溫溫育后才可見。在從核苷酸序列預(yù)計(jì)的12個AvaI和BamHI限制位點(diǎn)中，ll個已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因而以下3個觀察結(jié)果證實(shí)了通過重組克隆5.2kbPCR產(chǎn)物的結(jié)論(a)只在含PCR產(chǎn)物之反應(yīng)液的平板上顯現(xiàn)緩慢生長的小菌落；(b)來自這些菌落的小量制備質(zhì)粒是預(yù)計(jì)大小的；和(c)診斷性限制酶切得到了預(yù)計(jì)片段(有一個上文所提及的例外)。實(shí)施例10:PCR片段的克隆設(shè)計(jì)三套PCR引物對(表9)以擴(kuò)增質(zhì)粒pEZC7501(圖IIB)內(nèi)的830bp序列，該序列包含attBl--GFP--attB3，在25bpattBl和attB3重組位點(diǎn)外端有或無附加的核苷酸。(此處"外"指不與GFP基因序列相鄰的attB序列末端。)A套引物在attBl上游加17個核普酸，而在attB3下游加15個核苷酸；B套引物分別加5和8個核苷酸至attBl和attB3;而C套引物不添加核苷酸至任一attB重組序列。引物序列如表9中所示表9<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>PCR反應(yīng)A套和C套引物首先用于以下PCR反應(yīng)，50nl，雙份。終濃度是20mMTrisHCl,pH8.450mMKC10.2niM所有4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)400ng/邁lpEZC7501超螺旋DNA模板0.5nM各引物重組TaqDNA聚合酶(BRL-GIBCO)100U/ml雙份以上反應(yīng)液含IM甜菜堿。反應(yīng)液首先94X:加熱1分鐘，然后在94*C45〃、55TC30〃及72"Cr循環(huán)25次。在TAE緩沖液中、含0.5ng/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物的大小.所有反應(yīng)均產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，這樣合并雙份反應(yīng)液。因?yàn)閹Щ虿粠鸩藟A的相應(yīng)反應(yīng)液無顯著差異，也將它們合并，得到終合并體積各為200n1的A套和C套引物反應(yīng)液。然后將B套引物用于與上述相同的反應(yīng)液中，只是將反應(yīng)液體積增加至100pl。合并雙份反應(yīng)液及加和不加甜菜堿的反應(yīng)液，帶B套引物的反應(yīng)終體積為400m1。三種合并的引物反應(yīng)產(chǎn)物在-20t:貯存4周。PCR產(chǎn)物純化用等體積Tris平衡酚、異戊醇和氯仿混合物抽提三種合并PCR產(chǎn)物的每一種一次。然后用等體積異丁醇提取水相上清液兩次，用兩倍體積乙醇、0.1M乙酸鈉p朋.2沉淀水相。13,OOOrpm室溫離心10分鐘回收乙醇沉淀，丟棄上清液。將抽干的沉淀溶于TE:用A和C套引物制備的反應(yīng)液是溶于100p1;用B套引物的反應(yīng)液是溶于200p1。為了去除PCR引物及無關(guān)的小PCR產(chǎn)物，用聚乙二醇(PEG)沉淀PCR產(chǎn)物，這是通過添加1/2體積的30%PEG8000(Sigma)、30MMgCl2溶液，混勻，并在13,OOOrpm離心10'(均于室溫)進(jìn)行的。丟棄上清液，沉淀溶于原體積的TE緩沖液中。在196瓊脂凝膠上檢測三種PCR產(chǎn)物各1m1等分試樣以確定回收率，估計(jì)為超過90%。用TE將各PCR產(chǎn)物濃度調(diào)節(jié)至40ng/p1。用A、B和C套引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)在IX整合酶緩沖液(25inMTrisHC1pH7.5、25mMTrisHC1pH8.0、80mMKC1、5mM亞精胺、0.5mMEDTA、0.25mg/mlBSA)中配制5個8n1反應(yīng)，該緩沖液包括40ngpEZC7102DNA、2pl重組酶混合物(8ng/ylIHF、22ng/plInt于IXInt緩沖液中、50%甘油)，各反應(yīng)因添加A套引物的PCR產(chǎn)物(反應(yīng)A)、B套引物的PCR產(chǎn)物(反應(yīng)B)、或C套引物的PCR產(chǎn)物(反應(yīng)C);不添加PCR產(chǎn)物(反應(yīng)D),或添加40ngpEZC7501SC(超螺旋)DNA(反應(yīng)E)作為陽性對照而不同。所有的反應(yīng)均雙份反應(yīng)。反應(yīng)液于25t!溫育45'，70*C10',然后保存于0-5lC.將反應(yīng)液各2p1等分試樣轉(zhuǎn)化入MaxEfficiencyDH5a，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液50[i1，在50C培養(yǎng)基中表達(dá)后，將1/5(100m1)和4/5(400pl)反應(yīng)液鋪于含卡那霉素(50ng/ml)的LB培養(yǎng)皿上。雙份反應(yīng)的結(jié)果如表IO所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>所獲菌落的分析從A、B或C套引物的各重組反應(yīng)液的8個菌落小量制備DNA。在1%瓊脂糖凝膠上分析所獲的超螺旋DNA:來自A套和B套引物之重組產(chǎn)物的所有8個菌落均為PCR產(chǎn)物(約824bp)和pEZC7102(l恥？bp)所提供attBl--ori--kanr--attB3序列之間正確重組的預(yù)計(jì)大小(2791bp)'C套引物之8個反應(yīng)產(chǎn)物中的3個為預(yù)計(jì)大小的；另5個均稍大于4kb。用兩種不同的限制酶Aval和Pvun進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的進(jìn)一步分析，在預(yù)計(jì)重組產(chǎn)物內(nèi)每種酶切割兩次(但在不同的位置)，一次在PCR產(chǎn)物序列內(nèi)，而另一次在pEZC7102提供的序列內(nèi)。這些酶均應(yīng)在兩位點(diǎn)切割完整pEZC7102重組配偶體質(zhì)粒，從而產(chǎn)生容易區(qū)別于預(yù)期重組產(chǎn)物的片段。從產(chǎn)生自具A套和B套引物之重組反應(yīng)液的菌落，兩個限制酶消化產(chǎn)生了預(yù)計(jì)大小的片段(對于Aval為2373和430bp;對于Pvun為2473和330bp)，對于來自C套引物展示預(yù)計(jì)大小的超螺旋DNA的3個菌落，有相同結(jié)果。但來自C套引物、產(chǎn)生更大SCDNA的另5個菌落，Pvun消化顯出與從pEZC7102消化所預(yù)計(jì)相似大小的片段，而Aval消化顯示只有單個片段，約為線性pEZC7102(4161bp)的大小。分析這些結(jié)果表明產(chǎn)生自含側(cè)翼有attB位點(diǎn)之基因的模板的PCR產(chǎn)物可作為逆重組反應(yīng)的有效底物。添加更短的DNA序列至attBl和attB3位點(diǎn)或核心區(qū)(如在B套引物內(nèi)分別為5bp和8bp)末端可刺激此反應(yīng)100倍或更多。令人驚奇的是，用在attB位點(diǎn)外含附加序列之PCR產(chǎn)物進(jìn)行的逆重組反應(yīng)，顯示在這些反應(yīng)中是比超螺旋陽性對照質(zhì)粒pEZC7501更有效的重組配偶體。所有的重組產(chǎn)物均如實(shí)產(chǎn)生。C套引物的相對低效重組反應(yīng)呈現(xiàn)低水平的背景菌落，該重組反應(yīng)缺乏25bpattB位點(diǎn)外的附加序列。該背景顯示是由于大量完整pEZC7102(編碼卡那霉素抗性)缺乏活性ccdB致死基因，從而使其可存活。與此解釋相一致的是，在此質(zhì)粒內(nèi)的兩AvaI限制位點(diǎn)之一也改變了。Aval位點(diǎn)之一存在于pEZC7102的ccdB區(qū)內(nèi)。因此該位點(diǎn)的改變很可能是ccdB基因突變失活的附屬性質(zhì)。實(shí)施例11:PCR片段的進(jìn)一步克隆以質(zhì)粒pBR322為模板用兩套6個引物制備PCR產(chǎn)物一套(表11)與TetR基因側(cè)翼的序列，包括TetR啟動子退火。另一套(表12)與A邁pR基因側(cè)翼的序列，包括其啟動子退火。所用引物"tet"和"amp"不含attB序列，只含PBR322質(zhì)粒固有序列；除pBR322序列之外，"attB"引物還含25bp的attBl或attB3序列；"attB+4"引物含pBR322特異序列，加上25bpattBl或attB3序列，每個均在外端帶4個G。(在此"外端"指不與模板特異引物序列相鄰的attB序列末端。)pBR322模板的制備為了提高PCR反應(yīng)的效率，通過在含15個單位限制酶NdeI及終濃度50mMTris-HClpH8.0、10mMMgCD50mMNaCl的200p1反應(yīng)液中于37€溫育3.5|ig超螺旋(SC)pBR322DNA1小時而將超螺旋pBR322DNA線性化。用酚、異戊醇和氯仿抽提被消化的pBR322DNA1次，用異丁醇抽提2次，并通過加入2倍體積乙醇及0.15M乙酸鈉沉淀。用100%乙醇洗沉淀1次，晾干，然后溶于TE緩沖液中。在于TAE緩沖液中、含O.5Pg/ml溴化乙錠中的196瓊脂糖凝膠上確定DNA回收率，估計(jì)大于80%。表11tet引物引物序列NO:tet-LAATTCTCATGTTTGACAGCTTATC48tet誦RCGATGGATATGTTCTGCCAAG49attBl-tetLACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-AATTCTCATGTTTGACAGCTTATC50attB3-tetRACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CGATGGATATGTTCTGCCAAG51attBl+4-tetLGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCA-GGCTAATTCTCATGTTTGACAGCTT-ATC52attB3+4-tetRGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT-GGGTCGATGGATATGTTCTGCCAAG53表12amp引物引物序列NO:amp-LAATACATTCAAATATGTATCCGC54amp-R""XACCAATGCTTAAT*CAGT-GAG55attB1-ampLACAAG*TTTGTACAAAAAAGCAGGCT-AATACATTCAAATATGTATCCGC56attB3-ampRACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-TTACCAATGCTTAATCAGTGAG57attBl+4-ampLGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCA-GGCTAATACATTCAAATATGTATCC-GC58attB3+4-咖oRGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT-GGGTTTACCAATGCTTAATCAGTGAG59tet和amp基因序列的PCR擴(kuò)增在由20mMTris-HClpH8.4、50mMKC1、1.5mMMgCl2、0.2mMdNTP、2ng線性化pBR322、2.5個單位TaqDNA聚合酵(GIBCO-BRL)及表3和4所列PCR引物對各O.5yM組成的100Ml體系中進(jìn)行6個PCR反應(yīng)。反應(yīng)液首先在94t:加熱3分鐘，然后941:45秒、55"C30秒、72"C1分鐘進(jìn)行25個循環(huán)?；?%瓊脂糖凝膠分析，所有的反應(yīng)均產(chǎn)生合適產(chǎn)量的預(yù)計(jì)大小產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的純化合并雙份反應(yīng)產(chǎn)物；用等體積酚、異戊醇和氯仿抽提；用等體積異丁醇抽提2次；并如上所述用2倍體積乙醇沉淀。用10096乙醇洗6份沉淀1次，干燥并溶于IOOm1TE中。在PEG沉淀前取ln1等分試樣用于產(chǎn)物的凝膠分析。每管中加入50pi30%PEG8000、30mMMgCl2。溶液混勻并于13，000rpm室溫離心10分鐘。小心去除上清液，沉淀溶于lOOplTE中。在1%瓊脂糖凝膠上確定回收率，估計(jì)超過90%。凝膠分析還顯示小于約300個核苷酸的核酸產(chǎn)物已通過PEG沉淀步驟有效去除了。重組反應(yīng)進(jìn)行7個重組反應(yīng)，每個總體積8/i1,含IX整合酶緩沖液、40ngpEZC7102(圖11A)和2^1重組酶混合物(見上文，實(shí)施例IO)。各反應(yīng)液還包含約40ng6種上述PCR產(chǎn)物之一或作為陽性對照的40ngpEZC7501(圖11B)。在其末端帶attB位點(diǎn)的amp和tetPCR產(chǎn)物如圖12A和12B中所示。反應(yīng)液于25t;溫育45分鐘，10分鐘，然后于0-5"保持1-2小時直至用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌將1M1各重組反應(yīng)液在50n1轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中轉(zhuǎn)化入MaxEfficiencyDH5a中，在SOC培養(yǎng)基中表達(dá)后，將1/5(100ai1)和4/5(400^l)各反應(yīng)液鋪于含50ng/ml卡那霉素的培養(yǎng)板上。平板溫育過夜并將菌落計(jì)數(shù)。獲自每套雙份反應(yīng)液的菌落數(shù)列于表13中表13<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>所獲菌落的分析為進(jìn)行快速表型篩選，將來自tetEZC反應(yīng)液的IO個菌落和來自attB+4-tetEZC反應(yīng)液的33個菌落劃線接種于含四環(huán)素(15pg/ml)的LB培養(yǎng)板上。作為四環(huán)素效力的對照，將缺乏TetR基因的pUC19轉(zhuǎn)化細(xì)胞的3個菌落也劃線于平m上。所有來自attB+4-tetEZC反應(yīng)的菌落生長良好；來自tetEZC反應(yīng)的菌落只很少量地生長，而pUC19菌落根本不生長。通過將來自ampPCR反應(yīng)的菌落劃線于含氨千青霉素(100yg/inl)的培養(yǎng)m上得到類似的結(jié)果。產(chǎn)生自attB+4-amp重組反應(yīng)液的所有21個菌落均生長良好，而存在氨,青霉素時來自attB-a即反應(yīng)液的13個菌落中只有1個生長。來自含ampPCR產(chǎn)物之重組反應(yīng)液的15個菌落中任何一個都未見生長。為了鑒定質(zhì)粒DNA，挑出產(chǎn)生自PCR產(chǎn)物之6個EZC反應(yīng)液的8個菌落并接種于含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)過夜。從0.9inl各培養(yǎng)物中小量制備DNA，并在含0.5pg/ml溴化乙錠之TAE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠上分析超螺旋DNA的大小。結(jié)果列于表14。重組產(chǎn)物的預(yù)計(jì)結(jié)構(gòu)如圖12C和12D中所示。200710110125.X說明書第69/89頁表14<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>分析基于質(zhì)粒pBR322中兩不同基因序列tet和amp的擴(kuò)增，這些結(jié)果清楚地表明用含25bpattBl和attB3重組序列之引物產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物可作為高效底物用于重組反應(yīng)。添加短序列至各25bpattB位點(diǎn)之外端可刺激重組反應(yīng)超過100倍，如同在實(shí)施例IO的實(shí)驗(yàn)中也觀察到的一樣。與實(shí)施例10也類似的是，用帶attB位點(diǎn)之線性PCR產(chǎn)物進(jìn)行的重組反應(yīng)的效率超過用陽性對照SCDNA質(zhì)粒pEZC7501獲得的效率。此外，如所預(yù)計(jì)有高比率的反應(yīng)產(chǎn)物，因?yàn)闄z測的來自attB+4-tet反應(yīng)的所有33個菌落顯示有功能的四環(huán)素抗性，而來自attB+4-amp反應(yīng)的所有21個菌落均顯示氨芐青霉素抗性。由pEZC7102與attB+4-tet或attB+4-ampPCR產(chǎn)物進(jìn)行的重組反應(yīng)的所有16種小量制備DNA,均產(chǎn)生正確大小的超螺旋DNA和限制性消化片段。實(shí)施例12:用拓樸異構(gòu)酶刺激重組通過將一個或兩個親代質(zhì)粒線性化而對重組反應(yīng)的刺激作用在意料之外。如果刺激是因兩重組反應(yīng)(共合體形成及分解成兩子代分子)期間引起的一些構(gòu)象限制解除而導(dǎo)致的，那么當(dāng)一個或兩個親代質(zhì)粒為環(huán)狀時用拓樸異構(gòu)酶解開質(zhì)?？赡芤彩怯写碳ぷ饔玫?。插入物供體是pEZC2901(圖7A),而載體供體是pECZ3101(圖7B)。用MluI線性化一部分pEZC3101。20ngpEZC2901和/或pECZ3101用于各,1反應(yīng)中(29ngInt、2.9ngXis、5.4ngIHF，在50mMTrisHC1pH約7.8、16.5mMNaCl、35mMKC1、5mM亞精胺、0.375mg/mlBSA、0.25mMEDTA、2%甘油)。用IXEZC緩沖液將拓樸異構(gòu)酶I(來自小牛胸腺；LifeTechnologes,Inc.)從15個單位/y1稀釋至表15中所示濃度。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>這些反應(yīng)液以以下次序配制緩沖液；TE;DNA;Clonase;拓樸異構(gòu)酶。該反應(yīng)在22。-28°溫育45分鐘，然后70t!5分鐘。用1M1等分試樣轉(zhuǎn)化入U(xiǎn)ltraMaxDH5a感受態(tài)大腸桿菌(LifeTechnologies,Inc.)。表達(dá)后，等分試樣鋪于含100pg/ml卡那霉素的平板上并于30D溫育48小時。結(jié)果見表16。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>分析載體供體線性化使菌落數(shù)增加了約IO倍(反應(yīng)2相比于反應(yīng)7)。添加O.5-5個單位拓樸異構(gòu)酶I至含環(huán)狀插入物供體和線性載體供體的反應(yīng)中，對菌落數(shù)僅有微小影響或無影響(反應(yīng)2與反應(yīng)3、4和5相比；最大為L4倍)。相比之下，如果兩親代質(zhì)粒均為環(huán)狀(反應(yīng)7-10),拓樸異構(gòu)酶的添加可刺激菌落數(shù)增加至5-9倍。因此，添加拓樸異構(gòu)酶I至兩親代質(zhì)粒均為環(huán)狀的反應(yīng)中對重組反應(yīng)的剌激作用幾乎與線性化載體供體親本的一樣高。當(dāng)在重組緩沖液中與三種重組蛋白質(zhì)結(jié)合使用時，拓樸異構(gòu)酶I是有活性的。將拓樸異構(gòu)酶I添加至重組反應(yīng)解除了為達(dá)到重組反應(yīng)的剌激作用而需線性化載體供體的必需性為了理解清楚的目的，現(xiàn)已用舉例和實(shí)施例的方式完整詳述了本發(fā)明，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很明顯的是，可以在不影響本發(fā)明范圍或其任何特異實(shí)施方案的前提下，在廣泛及相等范圍的條件、配方及其他參數(shù)內(nèi)修飾或改變本發(fā)明而達(dá)到相同目的，這樣的修飾或改變也包括于附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。本說明書中所提及的所有出版物、專利和專利申請是本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)熟練人員技術(shù)水平的指示，各出版物、專利或?qū)＠暾埦嗤潭鹊鼐唧w并獨(dú)立引入本文作為參考。序列表<110〉LifeTechnologies,Inc.〈120〉利用具重組位點(diǎn)的核酸進(jìn)行重組克隆〈130〉0942.285PC04<140>〈141〉<150>US60/065,930〈151〉1997-10-24<150>US(待轉(zhuǎn)讓)〈151〉1998-10-23〈160〉60〈170〉PatentlnVer.2.0〈210〉1〈211〉25〈212〉DNA〈213〉未知〈220〉<223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉1rkycwgctttyktrtacnaastsgb<210>2〈211〉25〈212〉腿<213>未知<220〉<223>未知生物描述重組產(chǎn)物<400〉2agccwgctttyktrtacnaactsgb〈210>3〈211〉25〈212>腿〈213〉未知〈220〉〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉3gttcagcttt<pktrtacnaactsgb25〈210>4<211>25〈212〉DM<213〉未知<220>〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400〉4agccwgctttcJctrtacnaagtsgb25<210〉5<211〉25<212〉謹(jǐn)〈213〉未知<220〉〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400〉5gttcagctttyktrtacnaagtsgb25<210〉6<211〉25<212>DM<213>未知〈220〉〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉6agcctgcttttttgtacaaacttgt〈210〉7〈211〉25〈212>腿〈213〉未知<220>〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400〉7agcctgctttcttgtacaaacttgt〈210>8<211>25〈212〉腿〈213〉未知<220〉<223〉未知生物描迷重組產(chǎn)物<柳〉8acccagctttcttgtacaaagtggt〈210〉9<211〉25〈212〉DNA<213〉未知〈220>〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<柳>9gttcagcttttttgtacaaacttgt25<210>10<211>25〈212>DNA〈213〉未知<220><223〉<柳>〈210〉<211>〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉<400><210><211>〈212〉<213><220〉〈223〉〈400〉<210〉<211>〈212〉<213>〈220〉〈223〉<400〉〈210〉〈211〉未知生物描述重組產(chǎn)物10gttcagctttcttgtacaaacttgt251125腿未知未知生物描述重組產(chǎn)物11gttcagctttcttgtacaaagtggt251225腿未知未知生物描述重組產(chǎn)物12agcctgcttttttgtacaaagttgg251325DNA未知未知生物描述重組產(chǎn)物13agcctgctttcttgtacaaagttgg251425<212>DNA〈213〉未知〈220〉〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉14acccagctttcttgtacaaagttgg25〈210〉15〈211〉25〈212〉腿〈213〉未知<220><223>未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉15gttcagcttttttgtacaaagttgg<210>16<211>25<212〉腿<213>未知〈220><223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400>16gttcagctttcttgtacaaagttgg25<210〉17<211>39〈212〉腿<213〉未知〈220〉<223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉17cc3ccacaa^acgcgtccstggssttacsctttastttag39〈210〉18〈211〉39<212〉薩〈213〉未知〈220>〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉18ccaccacaagtcgacgcatgccgacagccttccaaatgt39〈210>19<211>46〈212〉醒〈213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列描迷合成寡核苷酸<柳〉19ggccgattacgatatcccaacgaccgaaaacctgtattttcagggt46<210〉20<211〉30<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400〉20csggttttcggtcgttgggatatcgtaatc30〈210〉21<211>47〈212〉DNA〈213>人工序列〈220>〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400>21ggccagattacgatatcccaacgaccgaaaacctgtattttcagggt47〈210〉22<211>31<212>纖〈213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉22caggttttcggtcgttgggatatcgtaatct31〈210〉23〈211〉48<212>腿〈213〉人工序列〈220><223〉人工序列描迷合成寡核苷酸〈400〉23ggccaagsttacgatatcccaacgaccgaaaacctgtattttcagggt48〈210〉24〈211〉32<212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400>24caggttttcggtcgttgggatatcgtaatctt32<210>25<211>15<212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉25accgtttacgtggac15〈210〉26<211〉31<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉26tcgagtccacgtaaacggttcccacttatta31〈210>27〈211〉39〈212〉腿<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400>27uauuuucaggguatggagaaaaaaatcactggatatacc39<210〉28<211〉33〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400〉28ucccacuuauuacgccccgccctgccactcatc33〈210〉29〈211〉33〈212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400>29uauuuucaggguatgcctgttctggaaaaccgg"〈210〉30〈211〉34〈212〉腿<213〉人工序列<220><223>人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉30ucccacuuauuatttcagccccagggcggctttc34<210>31<211>58〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400>31tccgttgaagcctgcttttttatactaacttgagcgaagcctcggggtcagcataagg58<210>32〈211〉58<212〉DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成寡核苷酸<400>32ccaataacttcgtatagcatacattatacgaagttattgccccttggtgacatactcg58<210>33<211>20〈212>腿〈213>人工序列〈220〉〈223>人工序列描述合成寡核苷酸〈400>33tcactagtcggcggcccaca^〈210〉34<211>20<212〉腿<213>人工序列<220>〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉34gagcggcccccgcggaccac20〈210〉35〈211〉21<212〉藤〈213〉人工序列<220>〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400〉35ggcccacaagtttgtacaaaa21<210>36<211>20〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223>人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉36ccccgcggaccactttgtac〈210>37〈211>21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉37acaagtttgtacaaaaaagca〈210〉38〈211〉21〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400〉38sccactttgtacaagaaagct<210〉39<211〉25<212〉靈<213〉未知<220>〈223〉未知生物描迷重組產(chǎn)物<400〉39rbycwgctttyttrtacwaastkgd<210〉40<211〉25〈212〉藤<213〉未知90202121<220〉〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈柳〉40asccwgctttyttrtacwaastkgw<210〉41<211〉25〈212〉腿〈213〉未知〈220〉〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400〉41asccwgctttyttrtacwaagttgg<210>42<211〉25<212>DNA<213〉未知<220><223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400>42gttcagctttyttrtacwaastkgw252525<210〉43〈211〉25〈212〉腿〈213〉未知<220〉<223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400>43gttcagctttyttrtacwaagttgg25〈210〉44〈211〉25<212>DNA<213>未知〈220〉〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<柳〉44tcggacgaaaaaatatgattgaact<210〉45〈211〉25<212〉DNA<213〉未知<220>〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400〉45tcggacgaaaaaacatgtttgaaca<210〉46<211〉25〈212〉腿〈213〉未知〈220〉<223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<柳〉46tcggacgaaagaacatgtttgaaca〈210〉47〈211〉25<212>DNA<213〉未知<220>〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物<400〉47tgggtcgaaagaacatgttt'caeca2-<210>48〈211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223>人工序列描述合成寡核普酸〈400〉48aattctcatgtttgacagcttatc2'<210〉49〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400〉4921cgatggatatgttctgccaag<210>50〈211〉49〈212>靈〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉50acaagtttgtacaaaaaagcaggctaattctcatgtttgacagcttatc49<210>51〈211〉46<212>薩〈213〉人工序列〈220><223>人工序列描述合成寡核苷酸<400>51accactttgtacaagaaagctgggtcgatggatatgttctgccaag46〈210〉52<211>53<212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400〉52ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaattctcatgtttgacagcttatc53<210>53〈211〉50〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸<400〉53ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgatggatatgttctgccaag50<210>54<211>23〈212〉腿〈213〉人工序列〈220><223>人工序列描述合成寡核苷酸<400>54satscattcaaatatgtatccgc23〈210〉55〈211>22〈212〉薩<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成寡核苷酸〈柳>55ttaccaatgcttaatcagtgag22〈210〉56<211>48<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉人工序列描述合成寡核普酸<400〉56acaagtttgtacaaaaaagcaggctaatacattcaaatatgtatccgc48〈210〉57〈211〉47<212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉57accactttgtacaagaaagctgggtttaccaatgcttaatcagtgag47〈210〉58〈211〉52〈212〉腿<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成寡核苷酸〈400>58ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaatacattcaaatatgtatccgc52〈210〉59<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉人工序列描述合成寡核苷酸〈400〉59ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaccaatgcttaatcagtgag51〈210〉60<211〉25<212>薩<213〉未知<220>〈223〉未知生物描述重組產(chǎn)物〈400〉60agcctgcttttttatactaacttga25關(guān)于保藏的微生物的說明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二)<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于生成連接的核酸分子的方法，包括將含有重組位點(diǎn)的第一核酸分子和第二核酸分子連接，該方法包括在拓?fù)洚悩?gòu)酶存在下，使第一核酸分子和第二核酸分子在允許所述第一核酸分子和所述第二核酸分子連接的條件下接觸。2.—種用于制M有至少一個重組位點(diǎn)的連接的核酸分子的方法，該方法包括(a)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成第一核酸分子；(b)在允許第一核酸分子和第二核酸分子連接以形成所述連接的核酸分子的條件下，使所述第一核酸分子和拓樸異構(gòu)酶以及所述第二核酸分子接觸，其中所述第二核酸分子含有重組位點(diǎn)。3.—種用于制M有至少一個重組位點(diǎn)的連接的核酸分子的方法，該方法包括(a)在拓樸異構(gòu)酶存在的條件下，將第一核酸分子和含有一個或多個重組位點(diǎn)的一個或多個銜接子混合，其中所述銜接子是第二核酸分子；和(b)在足以使一個或多個所述銜接子添加至所述第一核酸分子的一個或多個末端以生成所述連接的核酸分子的條件下，孵育所述混合物。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述第一核酸分子是平末端的。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述第一核酸分子還含有選擇標(biāo)記或復(fù)制起點(diǎn)。6.權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二核酸分子含有選擇標(biāo)記或復(fù)制起點(diǎn)。7.權(quán)利要求l-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組位點(diǎn)選自/ojr位點(diǎn)、a"L位點(diǎn)、s"R位點(diǎn)、a〃Bl(SEQIDNO:6)、a〃B2(SEQIDNO:7)、"出3(SEQIDN0:8)、a〃Pl(SEQIDN0:15)和a"P2(SEQ訓(xùn)0:16),8.組合物，含有(a)包含一個或多個重組位點(diǎn)的分離的核酸分子；和(b)與所述分離的核酸分子相關(guān)的一種或多種拓樸異構(gòu)酶，其中所述一個或多個重組位點(diǎn)選自/oj位點(diǎn)、a"L位點(diǎn)、a"R位點(diǎn)、fl"Bl(SEQIDNO:6)、fl"B2(SEQIDNO:7)、a"B3(SEQIDNO:8)、a〃Pl(SEQIDNO:15)和a"P2(SEQIDNO:16)。9.組合物，含有(a)包含兩個或多個重組位點(diǎn)的分離的核酸分子；和(b)與所述分離的核酸分子相關(guān)的一種或多種拓樸異構(gòu)酶，其中所述兩個或多個重組位點(diǎn)不互相重組。10.位于宿主細(xì)胞外的組合物，包含具有一個或多個重組位點(diǎn)的分離的核酸分子，以及一種或多種拓樸異構(gòu)酶。11.位于宿主細(xì)胞外的組合物，包含核酸分子，其為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物；具有一個或多個重組位點(diǎn)的分離的核酸分子；以及一種或多種拓樸異構(gòu)酶。12.分離的核酸分子，包含(a)—個或多個重組位點(diǎn)；和(b)—個或多個拓樸異構(gòu)酶識別位點(diǎn)，其中所述一個或多個重組位點(diǎn)選自/ojr位點(diǎn)、a"L位點(diǎn)、a"R位點(diǎn)、a"Bl(SEQIDN0:6)、a"B2(SEQIDN0:7)、a"B3(SEQIDN0:8)、a"Pl(SEQIDN0:15)和a"P2(SEQIDNO:16)。13.分離的核酸分子，包含(a)兩個或多個互相不重組的重組位點(diǎn)；和(b)—個或多個拓樸異構(gòu)酶識別位點(diǎn)。14.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的組合物或者權(quán)利要求12或13的分離的核酸分子，其中所述核酸分子是環(huán)狀的。15.權(quán)利要求8-11和14中任一項(xiàng)的組合物或者權(quán)利要求12、13或14的分離的核酸分子，其中所述核酸分子還包含復(fù)制起點(diǎn)。16.權(quán)利要求15的組合物或分離的核酸分子，其中所述核酸分子還含有選擇標(biāo)記。17.權(quán)利要求16的組合物或分離的核酸分子，其中所iti^擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。18.權(quán)利要求8-11和14-17中任一項(xiàng)的組合物或者權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述重組位點(diǎn)是/or位點(diǎn)。19.權(quán)利要求18的組合物或分離的核酸分子，其中所述Ajt位點(diǎn)是/otP位點(diǎn)。20.權(quán)利要求19的組合物或核酸分子，其中所述7ojtf位點(diǎn)選自/oaP和/orP511。21.權(quán)利要求8-11和14-17中任一項(xiàng)的組合物或者權(quán)利要求12或13的核酸分子，其中所述重組位點(diǎn)是a^位點(diǎn)。22.權(quán)利要求21的組合物或核酸，其中所述a"位點(diǎn)是a"L位點(diǎn)或a〃R位點(diǎn)，a"L位點(diǎn)選自a〃Ll(SEQIDN0:12)、a"L2(SEQIDN0:13)和a"L3(SEQIDNO:14),所述a"R位點(diǎn)選自a"Rl(SEQIDNO:9)、a〃R2(SEQIDNO:10)和a〃R3(SEQIDNO:11)。23.權(quán)利要求8的組合物或權(quán)利要求12的分離的核酸分子，包含兩個或多個重組位點(diǎn)。24.權(quán)利要求23的分離的核酸分子，其中所述兩個或多個重組位點(diǎn)中的至少一個位于每一所述拓樸異構(gòu)酶識別位點(diǎn)的側(cè)翼。25.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的組合物或者權(quán)利要求12或13的分離的核酸分子，其中所述拓樸異構(gòu)酶是I型拓樸異構(gòu)酶。26.權(quán)利要求12或13的分離的核酸分子，其中所述拓樸異構(gòu)酶識別位點(diǎn)由I型拓樸異構(gòu)酶識別并結(jié)合。27.載體，包含權(quán)利要求12或13的分離的核酸分子。28.宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求27的載體。29.試劑盒，包含權(quán)利要求12或13的分離的核酸分子。30.權(quán)利要求29的試劑盒，還包含一種或多種選自下列的組分一種或多種拓樸異構(gòu)酶，一種或多種重組蛋白，一種或多種載體，一種或多種具有聚合酶活性的多肽以及一種或多種宿主細(xì)胞。31.權(quán)利要求29的試劑盒，還包含一種或多種選自下列的組分一種或多種拓樸異構(gòu)酶，一種或多種重組蛋白，一種或多種栽體，一種或多種具有聚合酶活性的多肽以及一種或多種宿主細(xì)胞。32.—種體外克隆擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，其中包括(a)獲得包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)相互間不發(fā)生重組；和(b)在第一和第三重組位點(diǎn)間以及第二和第四重組位點(diǎn)間能夠發(fā)生重組的條件下，在體外將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與包含第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)的載體混合，由此形成產(chǎn)物栽體，其中所述第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)之間不發(fā)生重組。33.權(quán)利要求32的方法，其中還包含將所述產(chǎn)物載體插入宿主細(xì)胞中。34.權(quán)利要求32的方法，其中所述載體是表達(dá)載體。35.權(quán)利要求32的方法，其中所述載體包含選自下組的至少一個額外核酸序列選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、限制性位點(diǎn)、啟動子、操縱子、復(fù)制起點(diǎn)和基因或者部分基因。36.權(quán)利要求32的方法，其中所述栽體包含至少一個復(fù)制起點(diǎn)。37.權(quán)利要求32的方法，其中所述載體包含至少一個啟動子。38.權(quán)利要求32的方法，其中所述栽體包含至少一個選擇標(biāo)記。39.權(quán)利要求32的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的。40.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一、第二、第三或第四重組位點(diǎn)是lox位點(diǎn)或者其功能性突變體。41.權(quán)利要求39的方法，其中所述lox位點(diǎn)選自loxP位點(diǎn)和1oxP511位點(diǎn)。42.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一、第二、第三或第四重組位點(diǎn)是att位點(diǎn)或者其功能性突變體。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述att位點(diǎn)選自由下述組成之組attB位點(diǎn)、attP位點(diǎn)、attL位點(diǎn)和attR位點(diǎn)。44.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一、第二、第三或第四重組位點(diǎn)選自由下述組成之組lox位點(diǎn)、att位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)和其功能性突變體。45.權(quán)利要求32的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物和所述栽體在有至少一種重組蛋白質(zhì)存在下相混合。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述重組蛋白質(zhì)是Cre。47.權(quán)利要求45的方法，其中所述重組蛋白質(zhì)選自Int、Xis和IHF.48.權(quán)利要求32的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述聚合im式反應(yīng)產(chǎn)物是線性的。50.—種克隆或亞克隆已擴(kuò)增核酸分子的方法，其中包括(a)在有助于生成與模板的全部或一部分互補(bǔ)、并包含第一和第二重組位點(diǎn)的產(chǎn)物核酸分子的條件下，用包含至少第一重組位點(diǎn)的第一引物和包含至少第二重組位點(diǎn)的第二引物擴(kuò)增核酸模板，其中所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)相互間不發(fā)生重組；和(b)在第一和第三重組位點(diǎn)間以及第二和第四重組位點(diǎn)間能夠發(fā)生重組的條件下，將所述產(chǎn)物核酸分子與包含至少第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)的至少一種栽體混合，由此形成產(chǎn)物載體，其中所述第三和第四重組位點(diǎn)相互間不發(fā)生重組。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述擴(kuò)增是通過PCR擴(kuò)增完成的。52.權(quán)利要求50的方法，其中還包含將所述產(chǎn)物載體插入宿主細(xì)胞中。53.權(quán)利要求50的方法，其中所述載體是表達(dá)載體。54.權(quán)利要求50的方法，'其中所述載體包含選自下組的至少一個額外核酸序列選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、限制性位點(diǎn)、啟動子、操縱子、復(fù)制起點(diǎn)和基因或者部分基因。55.權(quán)利要求50的方法，其中所述載體包含至少一個復(fù)制起點(diǎn)。56.權(quán)利要求50的方法，其中所述載體包含至少一個啟動子。57.權(quán)利要求50的方法，其中所述栽體包含至少一個選擇標(biāo)記。58.權(quán)利要求50的方法，其中所述核酸分子和所述載體是在體外混合的。59.權(quán)利要求50的方法，其中所述產(chǎn)物核酸分子是線性的。60.權(quán)利要求50的方法，其中所述第一、第二、第三或第四重組位點(diǎn)是lox位點(diǎn)或者其功能性突變體。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述lox位點(diǎn)選自loxP位點(diǎn)和1oxP511位點(diǎn)。62.權(quán)利要求50的方法，其中所述第一、第二、第三或第四重組位點(diǎn)是att位點(diǎn)或者其功能性突變體。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述att位點(diǎn)選自由下述組成之組aUB位點(diǎn)、attP位點(diǎn)、attL位點(diǎn)和attR位點(diǎn)。64.權(quán)利要求50的方法，其中所述第一、第二、第三或第四重組位點(diǎn)選自由下述組成之組lox位點(diǎn)、att位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)和其功能性突變體。65.權(quán)利要求50的方法，其中所述產(chǎn)物核酸分子和所述載體在有至少一種重組蛋白質(zhì)存在下相混合。66.—種核酸分子，其中包含編碼ccdB蛋白的核酸序列和至少一個重組位點(diǎn)。67.權(quán)利要求66的核酸分子，其中至少一個重組位點(diǎn)是加工的重組位點(diǎn)。68.權(quán)利要求66的核酸分子，其中至少一個重組位點(diǎn)選自att重組位點(diǎn)和lox重組位點(diǎn)。69.權(quán)利要求66的核酸分子，其中至少一個重組位點(diǎn)是att位點(diǎn)。70.權(quán)利要求66的核酸分子，其中至少一個重組位點(diǎn)包含能夠提高共整合DNA或產(chǎn)物核酸分子形成中的體外重組效率或特異性的核心區(qū)。71.權(quán)利要求66的核酸分子，其中所述核酸分子包含選自下組的至少一個重組位點(diǎn)attBl、attB2、attB3、attPl、attP2、attP3、attLl、attL2、attL3、attRl、attR2、和attR3重組位點(diǎn)。72.權(quán)利要求66的核酸分子，其中至少一個重組位點(diǎn)包含選自下組的核列RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB(m-att)(SEQIDNO:1);AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB(m-attB)(SEQIDNO:2);GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB(m-attR)(SEQIDNO:3);AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB(m-attL)(SEQIDNO:4);GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB(m-attPl)(SEQIDNO:5);AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attBl)(SEQIDNO:6);AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attB2)(SEQIDNO:7);ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT(attB3)(SEQIDNO:8);GTTCAGCTTTTTTGTACAAACTTGT(attRl)(SEQIDNO:9);GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT(attR2)(SEQIDNO:10);GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT(attR3)(SEQIDNO:l1);AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attLl)(SEQIDNO:12);AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attL2)(SEQIDNO:13);ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(aUL3)(SEQIDNO:14);GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG(attPl)(SEQIDNO:15);GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG(attP2,P3)(SEQIDNO:16)RBYCWGCTTTYTTRTACWAASTKGD(n-att)(SEQIDNO:39);ASCCWGCTTTYTTRTACWAASTKGW(n-attB)(SEQIDNO:40);ASCCWGCTTTYTTRTACWAAGTTGG(n-attL)(SEQIDNO:41);GTTCAGCTTTYTTRTACWAASTKGW(n-attR)(SEQIDNO:42);GTTCAGCTTTYTTRTACWAAGTTGG(n-attP)(SEQIDNO:43);或者其相應(yīng)的或互補(bǔ)的DM或RNA序列，其中R-A或G;K=G或T/U;Y-C或T/U;W-A或T/U;N=A或C或G或T/U;S=C或G;并且B=C或G或T/U。73.權(quán)利要求66的核酸分子，其中還包含選自下組的至少一個額外核酸序列選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、限制性位點(diǎn)、啟動子、操縱子、復(fù)制起點(diǎn)和基因或部分基因。74.權(quán)利要求73的核酸分子，其中所述選擇標(biāo)記包含選自下組的至少一種標(biāo)記抗生素抗性基因，tRNA基因，營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，毒性基因，表型標(biāo)記，反義寡核苷酸，限制性內(nèi)切酶，限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。75.權(quán)利要求72的核酸分子，其中還包含選自下組的至少一個第二核酸序列SEQIDN0:1-16和39-43，其互補(bǔ)DNA序列及相應(yīng)的RNA序列。76.權(quán)利要求73的核酸分子，其中所述基因或部分基因包含編碼標(biāo)簽序列的核酸序列。77.權(quán)利要求76的核酸分子，其中所述標(biāo)簽序列選自GST標(biāo)簽和His標(biāo)簽。全文摘要本發(fā)明提供了用核酸、載體及體外和體內(nèi)方法進(jìn)行的重組克隆方法，可用來經(jīng)改造過的重組位點(diǎn)和重組蛋白質(zhì)移動或交換DNA分子區(qū)段，得到具有預(yù)期特性的嵌合DNA分子和/或DNA區(qū)段。文檔編號C12N15/64GK101125873SQ20071011012公開日2008年2月20日申請日期1998年10月26日優(yōu)先權(quán)日1997年10月24日發(fā)明者D·K·?？怂?G·F·潭普爾,J·L·哈特雷,M·A·布拉什申請人:茵維特羅根公司