專利名稱：：主枝片段分蘗法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鼠尾藻的繁育，具體地說是主枝片段分蘗法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法。
背景技術(shù)：
：鼠尾藻藻體黑褐色，形似鼠尾，高350厘米，最高可達(dá)120厘米。生長在中潮帶巖石上或石沼中。全年可見，生長盛期37月。廣分布于我國沿海。鼠尾藻營養(yǎng)豐富，藻膠含量低，是海參等重要海產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)餌料。鼠尾藻以前很少被人利用，但是隨著海參等海產(chǎn)品養(yǎng)殖規(guī)模的急劇擴(kuò)大，自然生長的鼠尾藻被大量采集，目前不少養(yǎng)殖區(qū)域鼠尾藻資源已近枯竭。鼠尾藻資源匱乏，飼料質(zhì)量低劣，在很大程度上限制了我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于市場需求，近來我國沿海的很多地區(qū)開展了鼠尾藻的人工養(yǎng)殖活動，也有有關(guān)養(yǎng)殖成功的報道。然而，人為養(yǎng)殖活動的開展并沒有抑制野生鼠尾藻日益遭受破壞的趨勢。原因是現(xiàn)有的鼠尾藻人工養(yǎng)殖技術(shù)本身的缺陷，海上夾苗養(yǎng)殖需要帶有固著器的整株海藻，因此，養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，反而對自然環(huán)境下的鼠尾藻造成更加嚴(yán)重的破壞作用。自然條件下鼠尾藻的有性繁殖季節(jié)性特別強，而且在自然條件下，鼠尾藻只有在石質(zhì)地質(zhì)的沿岸區(qū)域才能自然生存和繁殖，泥底、沙底、泥沙地質(zhì)的條件都不能滿足它的生存條件。因此，具有營養(yǎng)反之特點的人工夾苗養(yǎng)殖法是發(fā)展鼠尾藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的一個關(guān)鍵途徑，而建立一個快速而節(jié)約資源的育苗方法又是解決人工養(yǎng)殖對自然環(huán)境造成破壞作用的關(guān)鍵。實驗窒K生下.JH門曾經(jīng)成幼他建fr了菜田么日招士害蕪!if尾菡卩+(^沐十畺黎瑭苴~i~zj、iii^11—i~~i/y、-~-/"^——一zi、/i一皿i-，—h乂ik^\j/i_*u、i/i■*—^/、.i>j、丄lz、幼苗的方法，這種方法在很大程度減少了鼠尾藻的育苗對自然環(huán)境的破壞作用。然而這種方法也有自身的缺點，主要是它的培養(yǎng)周期比較長，從幼葉培養(yǎng)到能夠夾苗的長度，至少需要6-8個月的時間。另外，葉片組培法也需要較高的費用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明成功地克服了以上的缺點。篩選出適合營養(yǎng)反之培養(yǎng)類型的藻株，采用培養(yǎng)鼠尾藻主枝片段的方法，在短期內(nèi)可以大量產(chǎn)生適合夾苗養(yǎng)殖的幼苗，而且操作簡單，費用低廉，再生的幼苗可以循環(huán)生產(chǎn)，對自然環(huán)境起到明顯的保護(hù)作用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為主枝片段分蘗法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法，具有如下步驟，1)取鼠尾藻藻株主枝用體積濃度75%的酒精浸泡2523秒，然后用大量消毒海水快速沖洗34次；32)將藻株主枝剪段，片段長2-3cm，片段放入容器中培養(yǎng)，以通用的ES海水培養(yǎng)液為培養(yǎng)基，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2-5天更換一次；培養(yǎng)溫度為1517。C，光照強度為2030iimol/m2pers，光照周期為光照黑暗=12-14:12-10h;當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行到片段的分蘗枝可以達(dá)到1.53.5cm時，將片段從容器中取出，用消毒的手術(shù)刀將分蘗枝切割下來；3)將切割下來分蘗枝采用歩驟2)的條件繼續(xù)增殖培養(yǎng)，或者將切割下來分蘗枝直接用于大規(guī)模夾苗海上養(yǎng)殖。鼠尾藻樣品采集后，用毛刷和鑷子清除表面的雜物和附著生物；用質(zhì)量濃度1%。的KMn04處理1.52分鐘，然后用大量消毒海水沖洗34次。鼠尾藻樣品暫養(yǎng)條件為，培養(yǎng)液為消毒海水，內(nèi)含0.1mol/LNaNO3以及0.1mol/LNaH2PO4;光照周期為光照黑暗=9:15h，光照強度為18-22pmol/m2pers，由白色熒光燈提供。所述步驟2)中的培養(yǎng)基組成為ES培養(yǎng)基+BG-ll海水化營養(yǎng)液。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(1)育苗所用時間短。實驗結(jié)果顯示，要達(dá)到夾苗所用長度，只要將藻株片段培養(yǎng)4個周即可，而且夾苗培養(yǎng)后，新生植株的適應(yīng)能力和生長速度與野生萌芽植株沒有明顯差異。(2)育苗費用低廉。在組織培養(yǎng)前期，需要無菌操作，而一周后可以改用煮沸的海水甚至是天然的過濾海水。另外，培養(yǎng)基費用低廉。(3)產(chǎn)苗量大。藻株片段的成活率為100%。一個3厘米長的片段，培養(yǎng)一個月后可以產(chǎn)生1015株幼苗。(4)對保護(hù)野生鼠尾藻意義重大。本發(fā)明前期無需大量的野生藻株，培養(yǎng)后期可以循環(huán)培養(yǎng)不用采集野生的藻株。(5)發(fā)現(xiàn)了適合人工養(yǎng)殖的鼠尾藻類型。實驗結(jié)果顯示，在相同的組織培養(yǎng)時間內(nèi)，類型B(圖1，B)的分蘗長度與生物量分別是類型A(圖1，A)的1.2倍與1.4倍；海上夾苗培養(yǎng)后，采收期相同繩長的類型B的生物量分別是類型A生物量的1.42.2倍。(6)是鼠尾藻種質(zhì)保存的另一種形式。圖l為不同類型的兩種鼠尾藻圖片；該藻于2005年8月2號采自青島市第二海水浴場潮間帶。A:藻株主枝細(xì)而且葉片稀疏，生物量相對?。籅:藻株主枝粗壯而且葉片密度大，生物量相對大。例標(biāo)尺，lcm。圖2為實驗過程中采用的不同類型的藻株主枝及片段其在前2個周內(nèi)的發(fā)育過程。圖3為切割下的分蘗幼苗及其夾苗后的發(fā)育狀況；A和B:分別為類型A和類型B主枝片段培養(yǎng)23天后的分蘗幼苗；C:類型B分蘗幼苗夾苗養(yǎng)殖1周后的狀況。例標(biāo)尺，lcm。圖4為海上夾苗養(yǎng)殖2個月分蘗幼苗的發(fā)育狀況；A:類型A分蘗幼苗的4發(fā)育狀況；類型B分蘗幼苗的發(fā)育狀況。例標(biāo)尺，1cm。具體實施方式實施例l自然條件下的鼠尾藻雌雄異株，單從形態(tài)特征上很難區(qū)分。然而，從外部形態(tài)上卻可以將鼠尾藻分為兩種不同的類型。一種類型的藻株葉片稀疏，主莖纖細(xì)(圖1A);另一種類型的藻株葉片厚密而主莖粗壯(圖1B)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，同樣長度的兩種不同類型的主枝后者是前者生物量的1.321倍。本發(fā)明挑選兩種不同類型的藻株主枝分別進(jìn)行培養(yǎng)實驗。海藻樣品采集后，用毛刷和鑷子清除表面的雜物和附著生物。挑選出較長的主枝，用質(zhì)量濃度1%。的KMn04處理1.52分鐘，然后用大量消毒海水沖洗34次。若需要暫養(yǎng)，暫養(yǎng)條件為圓形水族缸內(nèi)(r=20cm,h=35cm)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為消毒海水，內(nèi)含O.lmol/LNaN03以及0.1mol/LNaH2P04。光照周期為9:15h(光照黑暗)，光照強度為20^imol/m2pers，由白色熒光燈提供。消毒海水為在0.1MPa-0.15MPa壓力條件下滅菌25-40分鐘的高壓滅菌天然海水；組培實驗在超凈工作臺上進(jìn)行，所有用具器皿均高壓消毒。剪段培養(yǎng)前，將藻株主枝用體積濃度75%的酒精浸泡2523秒，然后用大量消毒海水快速沖洗34次。剪段，片段長2.5-3cm。消毒的片段放入容積為20升的廣口瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為通用的ES海水培養(yǎng)液，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)液每4天更換一次。其它培養(yǎng)條件為溫度1517°C。光照強度為2030^imOl/m2perS。光照周期為14:10h(光照黑暗)。當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行到一個月左右時，大部分片段的分蘗枝可以達(dá)到1.53.5cm。這時，將片段從瓶中取出，用消毒的手術(shù)刀將分蘗切割下來，切割下來分蘗幼苗或者繼續(xù)增殖培養(yǎng)，或者直接用于大規(guī)模夾苗海上養(yǎng)殖。附ES培養(yǎng)基(通用的ES海水培養(yǎng)液)組成<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>biotin5microgTrisbuffer(SigmaCo.)500mgFe-solution:在500毫升溶解351毫克Fe(NH4)2(S04)26H20以及300毫克Na2EDTA.PIImetalsolution:成分100毫升蒸餾水Na2EDTA100mgH3B03114mgFeCl36H204.9mgMnS04H2016.4mgZnS047H202.2mgCoS04.7H200.48mg實驗結(jié)果兩種不同藻株的成活率均為100%。組織培養(yǎng)一個月后可以產(chǎn)生大量適合佳苗養(yǎng)殖的分蘗再生植株。一個3厘米長的片段，培養(yǎng)一個月后可以產(chǎn)生1015株幼苗。發(fā)現(xiàn)了適合人工養(yǎng)殖的鼠尾藻類型。實驗結(jié)果顯示，在相同的組織培養(yǎng)時間內(nèi)，類型B(圖IB)的分蘗長度與生物量分別是類型A(圖1A)的1.2倍與1.4倍；海上夾苗培養(yǎng)后，采收期相同繩長的類型B的生物量分別是類型A生物量的1.42.2倍。實施例2本實驗的進(jìn)行時問為2005年8月7號到2005年il月28號。樣品采自青島第二海水浴場潮間帶G5.35。N,U9.30。E,水面以下10-35cm)。該藻于2005年8月2號采自青島市第二海水浴場潮間帶。實驗采用不同類型的主枝(圖2A)，分別剪段后進(jìn)行培養(yǎng)，在兩周內(nèi)不同類型主枝片段的發(fā)育過程見圖2B和圖2C。培養(yǎng)條件為溫度17。C;光照強度25iamol/mers;光照周期12:12h(光照黑暗)；采用的培養(yǎng)基為ES培養(yǎng)基+BG-11海水化營養(yǎng)液，即于通用的ES海水培養(yǎng)液中加入BG-ll配方的成份；BG-ll配方H3B032.86叫/1，MnC1.4H201.81|ag/l，ZnS04.7H200.222jig/l，NaMo04.2H200.39|tig/l，CuS04.5H200.079嗎/1，Co(N03)2.6H200.0494pg/l;其它培養(yǎng)條件同上述實施例1的實驗操作；圖2中，A:不同類型的藻株主枝，1和3為類型A的主枝，而2和64為類型B的主枝；B:類型A藻株主枝片段的在前兩周的再生過程，l為剛剪段時的片段，2為第6天的再生狀況，3為第10天的再生狀況，4為第14天的再生狀況；和C:類型B藻株主枝片段的在前兩周的再生過程，1為剛剪段時的片段，2為第7天的再生狀況，3為第14天的再生狀況。例標(biāo)尺，1cm。培養(yǎng)3周后，分蘗幼苗生長情況見圖3A和3B。夾苗培養(yǎng)一周后，類型B的分蘗幼苗長度可達(dá)4.35.5cm(圖3B)，而同期的類型A分蘗幼苗僅為2.94.6cm。海上夾苗養(yǎng)殖兩個月后，類型A和類型B的分蘗幼苗分別發(fā)育成熟(圖4)，但單株類型B的生物量為單株類型A的2.07倍。權(quán)利要求1.主枝片段分蘗法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法，具有如下步驟，1)取鼠尾藻藻株主枝用體積濃度75％的酒精浸泡25～23秒，然后用大量消毒海水快速沖洗3～4次；2)將藻株主枝剪段，片段長2-3cm，片段放入容器中培養(yǎng)，以通用的ES海水培養(yǎng)液為培養(yǎng)基，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2-5天更換一次；培養(yǎng)溫度為15～17℃，光照強度為20～30μmol/m2pers，光照周期為光照黑暗＝12-1412-10h；當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行到片段的分蘗枝可以達(dá)到1.5～3.5cm時，將片段從容器中取出，用消毒的手術(shù)刀將分蘗枝切割下來；3)將切割下來分蘗枝采用步驟2)的條件繼續(xù)增殖培養(yǎng)，或者將切割下來分蘗枝直接用于大規(guī)模夾苗海上養(yǎng)殖。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于鼠尾藻樣品采集后，用毛刷和鑷子清除表面的雜物和附著生物；用質(zhì)量濃度1%。的KMn04處理1.52分鐘，然后用大量消毒海水沖洗34次。3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于鼠尾藻樣品暫養(yǎng)條件為，培養(yǎng)液為消毒海水，內(nèi)含O.lmol/LNaN03以及0.1mol/LNaH2P04;光照周期為光照黑暗=9:15h，光照強度為18-22^mol/m2pers，由白色熒光燈提供。4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的培養(yǎng)基組成為ES培養(yǎng)基+BG-ll海水化營養(yǎng)液。全文摘要本發(fā)明涉及鼠尾藻的繁育，具體地說是主枝片段分蘗法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法。具有如下步驟，1)取鼠尾藻藻株主枝用體積濃度75％的酒精浸泡25～23秒，然后用大量消毒海水快速沖洗3～4次；2)將藻株主枝剪段，片段長2-3cm，片段放入容器中培養(yǎng)，以通用的ES海水培養(yǎng)液為培養(yǎng)基，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行到片段的分蘗枝可以達(dá)到1.5～3.5cm時，將片段從容器中取出，用消毒的手術(shù)刀將分蘗枝切割下來；3)將切割下來分蘗枝采用步驟2)的條件繼續(xù)增殖培養(yǎng)，或者將切割下來分蘗枝直接用于大規(guī)模夾苗海上養(yǎng)殖。本發(fā)明操作簡單，費用低廉，再生的幼苗可以循環(huán)生產(chǎn)，對自然環(huán)境起到明顯的保護(hù)作用。文檔編號C12N5/04GK101422125SQ20071011357公開日2009年5月6日申請日期2007年10月29日優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日發(fā)明者于守團(tuán),葉乃好,方建光,毛玉澤,健鄒申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所