專利名稱：產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌快速檢測(cè)試劑盒的制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及-種禾傭環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣盼決速檢測(cè)的方法，具 體是一種產(chǎn)氣刻莫梭狀芽孢桿菌快速檢測(cè)試劑盒的制備和^柳方法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperft，ingens)廣泛分布于自然生境中，如土 壤、千草、沙、 -些大型動(dòng)物(牛、驢和馬)的糞便，及狗、貓、嚙齒動(dòng)物和人的糞便。 該菌是人和動(dòng)物腸道的正常菌群，亦是^i牛性致病菌。該菌感染主要由毒素導(dǎo)致的毒血 癥致病，是導(dǎo)致壞死性腸炎的一種普遍存在的厭氧性微生物。在一定的條件下，該菌能 在腸道中繁殖，產(chǎn)生毒性較強(qiáng)的a毒素。家禽對(duì)a毒薪艮敏感?；寂R床性或亞臨床性壞死性腸炎的家禽還會(huì)發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)動(dòng)旦管性肝炎的病癥。只有在加工生產(chǎn)線j^發(fā)mx鳥(niǎo)肉顏色差和黃疸、肝腫大，外觀呈褐色和表面有結(jié)節(jié)或斑點(diǎn)、肉質(zhì)等級(jí)明顯下降(3%至5%)。 梭狀芽孢桿菌通常棲息于盲腸，但是如果腸道菌群的平衡發(fā)生改變，梭狀:ff包桿菌在消 化道前段大量增殖，導(dǎo)致壞死性腸炎和雞的死亡，由于膽f^結(jié)著膽囊與腸道，梭狀芽 孢桿菌可能會(huì)轉(zhuǎn)移到腸道上部而進(jìn)入膽管，隨后阻塞膽囊或iSA肝臟，導(dǎo)致上述癥狀。C 型產(chǎn)氣刻莫芽孢桿菌產(chǎn)生的B毒素可致腸道組織壞死，造成急性出血性壞死性腸炎。
診斷產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌依靠觀^^:狀還，歐佳判斷，必須采用血清學(xué)方法或通過(guò)病原的分離鑒定。目前病原性產(chǎn)氣莢膜梭狀射包桿菌的檢測(cè)方法主要有、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和16srRNA基因探針雜交技術(shù)，這些方法在檢測(cè)時(shí)間、穩(wěn)定性、 敏感性等方面存在著一些不足。以往檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的主要方法有三種1. 生理生化鑒定技術(shù)，該法費(fèi)時(shí)，操作繁瑣，不飽臠足病害防治的需要；2.酶聯(lián)免疫吸附 i&驗(yàn)，3.聚合酉敏連式反應(yīng)法(PCR法)，該方法較前兩禾中方法決速、靈敏，但需要昂貴的 PCR儀。目前尚未見(jiàn)用環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增方法檢測(cè)產(chǎn)氣刻莫梭狀芽孢桿菌的試劑敘方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是掛共一種產(chǎn)氣刻莫梭狀芽孢桿菌決速檢測(cè)試劑盒的制備SH頓方法， 以克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)，從而為水產(chǎn),舒喰品安全衛(wèi)共科學(xué)的依據(jù)樹(shù)旨導(dǎo)作用。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設(shè)計(jì)一組可以識(shí)別耙DNA六個(gè)不同序歹啲兩個(gè)內(nèi)引 物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)弓胸)和兩個(gè)外引物(上游外引物和下游外弓胸)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義能(2)其中一個(gè)內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA 合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個(gè)外引物啟動(dòng)，釋放出單鏈DNA， 并作為由雜交到靶的另一端的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)外引物啟動(dòng)的DNA合成模板，產(chǎn)生一個(gè) 原始的莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟動(dòng)鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一 個(gè)原始的莖環(huán)DNA和—個(gè)新的由兩倍莖長(zhǎng)度的莖環(huán)DNA; (4)在等溫條件下，內(nèi)引物以 莖環(huán)DNA為模板, 通過(guò)鏈置換形成多個(gè)含有靶DNA反復(fù)充分序列的莖環(huán)DNA，在一小時(shí) 內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到109拷貝，可通過(guò)熒光染料來(lái)觀察擴(kuò)增結(jié)果。
本發(fā)明涉及的創(chuàng)傷弧菌快速檢測(cè)試劑盒，其中的試劑包括如下(1) - (4):
(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液A:
其中包括10XThermopol反應(yīng)緩沖液、300—500 μmol/L dNTP、 2—4μmol/L硫酸鎂, (MgS04)0.8—1.2μmol/L上游引內(nèi)物(FIP)、 0. 8—1. 2μmol/L下有內(nèi)引物(BIP)、 0. 2—0. 3μmol/L 上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3umol/L下游內(nèi)引物(B3)和1—1. 5mol/L甜菜堿;
其中所述的上游內(nèi)引物5- TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCT _ CTATACCTGACACAGGGGA - 3 下游內(nèi)引物5- CMGCTACATTCTATCTTGGAGAGG-ATTAGCAGGATGATATGGAGTA -3 上游外引物5- TTTCTCAAAGGATMTAGTTGGT-3 下游外引物5- ATGTCCTGCGCTATCMC-3
其中dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP二2:l:l:l。
其中所述的10XThermopol反應(yīng)緩沖液中含有200rnmo1 pH8. 8的三羥甲基氨基甲烷一鹽酸(Tris—HCl )、 100mmol/L氯化鉀(KC1 )、 100mmol/L硫酸銨((NHt)2S0.0、20mmol/L 硫酸鎂(MgSO1)和1%曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1U/μL；
(3) Bst DNA聚合酶B: 8U /μL;
(4) 顯色劑C:為10%的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
上面所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液A每管23μL的最佳組成為2.5μL 10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1.0μLL 10mmol/L dNTP (四種脫氧核糖核酸的混，)、1.0 μL 20μmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 l.OuL 20 u mol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.25uL 20 μmol/L上游外引物(F3)、0. 25 μL 20 u mol/L下游外引物(B3)、0. 5 u L 100mmol/L MgS04、 12.5uL 2M甜熟堿4uL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
使用上述試劑盒檢測(cè)產(chǎn)氣刻莫梭狀芽孢桿菌的方法，依次包括下列步驟(l)-(3):
(1) 樣品(待檢樣品或者培養(yǎng)菌液)DNA的提取
A. 取200 mg待檢樣品或者1.0-l. 5raL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，置于1. 5mL離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5—10min，棄上清液；
B. 加入1.0—1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺(tái)式離心機(jī)10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5 一10min，棄上清液；
C. 加入100—150 uL滅菌雙蒸水，混勻，l00℃沸水浴中加熱10—15min;
D. 用臺(tái)式離心機(jī)10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5—10min，取上清至一個(gè)新的1. 5mL離 心管中，即為待檢M^反DNA;
(2) 謝丁產(chǎn)氣翔莫梭狀芽孢桿菌的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有23 " L LAMP反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1 y L待檢t對(duì)反DNA，和0. 5 " L的 UNG酶，于恒^^屬浴上50。C放置3min，于瞎臉屬浴上95。C放置3—5min，立即置于 冰上l-3min;
B. 在反應(yīng)管中加入luL Bst DNA聚合酶B: C于恒溫金屬浴上60—65℃放置45—90min;
D.將金屬浴調(diào)到80—95℃中止反應(yīng)，3—5min后取出待檢；
(3) 顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1"L顯色劑C，直接用剛艮觀察顏色變化，如果顏色為 黃色，說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌不含或者不是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽 包桿菌，如果顏色變?yōu)榫G色， 則說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌含有或者為產(chǎn)氣刻莫梭狀芽孢桿菌。
本發(fā)明建立了產(chǎn)氣莢膜梭狀對(duì)包桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑M檢測(cè)方法，本 試劑盒根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的Plc基因的基本保守區(qū)的六個(gè)序列設(shè)計(jì)了兩特異性內(nèi)弓胸和兩個(gè)持異性外弓胸，該保守基因序列為產(chǎn)氣刻狀芽孢桿菌各不同血清 型和菌株型所共有、以保證從種的水平上檢測(cè)不同來(lái)源的產(chǎn)氣莢膜梭狀對(duì)包桿菌株的可 靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)^S擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)，與PCR檢測(cè)方法有 相同的高靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴鍋即可，且結(jié)果不 必用凝膠電泳方經(jīng)3^見(jiàn)察，使用熒光染料來(lái)觀察即可，簡(jiǎn)單而快速?？捎糜诋a(chǎn)氣^l嫌 狀芽孢桿菌的檢測(cè)，特別適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)以及養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。
下列實(shí)施例進(jìn)一歩說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
按下列己方制作產(chǎn)莢膜狀芽孢桿菌的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增試劑盒 (1) LAMP反應(yīng)液A:
含有2. 5 u L 10 X Thermopol反應(yīng)緩沖液、1. 0 u L 10,1/L dNTP、 1. 0 n L 20 n mol/L 上游內(nèi)引物(FIP)、1.0uL 20umol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 25"L 20ymol/L上游外 弓l物(F3)、0. 25 " 20 ti mol/L下游外弓l物(B3)、0. 5 u L 100-/L MgSO,、 12. 5 u L 2mol/L 甜菜堿5淑U4L ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內(nèi)引物5- TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCT - CTAT ACCTGACAC AGGGGA - 3 、 下游內(nèi)引物5- CAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGG-ATTAGCAGGATG ATATGGAGTA -3、 上游外引物5- TTTCTCMAGGATMTAGTTGGT _3、 下游外引物5- ATGTCCTGCGCTATCMC -3
其中dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。
(2) UNG酶lU/"L;
(3) Bst DNA聚合酶B: 8U , U
(4) 顯色劑C:為10X的熒光染料SYBR GREEN I。 按照以下禾，進(jìn)行檢測(cè)
(1) 細(xì)菌DNA的提取
A. 取200mg待檢樣品或者1.0—1.5mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用 臺(tái)式離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄上清液；
B. 加入1. 0—1. 5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺(tái)式離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分離心10min， 棄上清液；
C. 加入100uL滅菌雙蒸水，混勻，IO(TC沸水浴中加熱10min;
D. 用臺(tái)式離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分離心10min，取上清至一個(gè)新的1. 5mL離心管中，即 為待檢t對(duì)反DNA:
(2) 進(jìn)行產(chǎn)氣刻針刻犬芽孢桿菌的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增反應(yīng)
A.在裝有23 w L LAMP反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1 u L待檢模板DNA，和0. 5 y L的 UNG酶，下恒溫金屬浴上95℃放置3min，亍恒溫金屬浴上95。C放置5min，立即置于冰 上二 lmin;
B. 在反應(yīng)管中加入1μL Bst DNA聚合酶B;
C. 于恒溫金屬浴上65'C放置1小時(shí)；
D. 將金屬浴調(diào)到80℃中止反應(yīng)，3min后取出；
(3)顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1μL、顯色劑C，直接用肉鵬見(jiàn)察顏色變化，如果顏色為 黃色，說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌不含或者不是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，如果顏色變?yōu)榫G色， 則說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌含有或者為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌。
實(shí)施例2
按下列配方制作產(chǎn)氣刻釙刻犬芽孢桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒
(1) LAMP反應(yīng)液A:
含有2. 5 u L lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 0 u L 10mmol1/L dNTP、1. 0 u L 20 u mol/L 上游內(nèi)引物〔FIP)、 l.OμL 20μmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3 )、0. 25 u L 20 u mol/L下游外引物(B3 )、0. 5 μ L 100mmol/L MgSo4、 12. 5 μ L 2mol/L 甜菜堿和 4μL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外弓物同上。 上述dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP二2:1:1:1。
(2) UNG酶UJ/yL:
(3) Bst腿聚合酶B: 8U
(4) 顯色劑C:為10X的熒光染料或者DNAGrecn。
按照以下超芊進(jìn)行檢測(cè)
(1) 細(xì)齒，A的提取
A. 取200 mg待檢樣品或者1.0mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5raL離心管中，用臺(tái)式 離心機(jī)2000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清液；
B. 加入1. 5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺(tái)式離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清液；
C. 加入150uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴中加熱15min;
D. 用臺(tái)式離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心5min，取上清至一個(gè)新的1. 5mL離心管中，即 為待檢模板DNA;
(2) 進(jìn)行產(chǎn)氣刻莫梭狀芽孢桿菌的環(huán)介導(dǎo)樂(lè)顯擴(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有23 μL LAMP反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1 μL待檢豐對(duì)反DNA，和0. 5 μ L的 UNG酶，于恒溫金屬浴上50℃放置3min，于恒溫金屬浴上95℃放置5min，立即置于冰上lmin;
B. 在反應(yīng)管中加入lμL Bst DNA聚合酶B;
C. 于恒復(fù)金屬浴上65℃放置1小時(shí)；
D. 將金屬浴調(diào)到80℃中止反應(yīng)，3min后取出；
(3)顯色檢測(cè)
在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1μL顯色劑C，直接用剛,見(jiàn)察顏色變化，如果顏色為 黃色，說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌不含或者不是產(chǎn)氣莢膜梭狀荊包桿菌，如果顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌含有或者為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌快速檢測(cè)試劑盒，其特征是其中的試劑包括下列(1)-(4)(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、0.8-1.2μmol上游內(nèi)引物、0.8-1.2μmol/L下游內(nèi)引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；其中所述的上游內(nèi)引物5-TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCTCTATACCTGACACAGGGGA-3、下游內(nèi)引物5-CAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGATTAGCAGGATGATATGGAGTA-3、上游外引物5-TTTCTCAAAGGATAATAGTTGGT-3、下游外引物5-ATGTCCTGCGCTATCAAC-3(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶B8U/μL；(4)顯色劑C為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌快速檢測(cè)試劑盒，其特 征是上述的混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP:dATP:dGTP:dCTP:2:1:1:1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌快速檢測(cè)試劑盒，其特 征是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A每管23ti L的組成為2. 5" L lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、l.O"L lOmmol /L dNTP、 l.O"L 20"mol/L上游內(nèi)引物、 1.0uL20umol/L下游內(nèi)引物、0. 25 u L 20 " mol/L上游外引物、0. 25 u L 20" mol/L下游外引物、0. 5" L 100mmo1 ,/L MgS04、 12. 5 " L 2mol/L甜菜 堿和L ddH20。
4. 一種產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，依次包括下列 歩驟(1) - (3):(1)樣品(待檢樣品或者培養(yǎng)菌液)DNA的提取A. 取200 mg待檢樣品或者1.0—1.5mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，置于1. 5mL離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5—10min，棄上清液；B. 加入1. O—l. 5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺(tái)式離心機(jī)10000-12000 轉(zhuǎn)/分離心5 — 1 Om i n ，棄上清液；C. 加入100—150 uL滅菌雙蒸水，混勻，IO(TC沸水浴中加熱IO — 15min;D.用臺(tái)式離心機(jī)10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5 — 10min，取上清至一個(gè) 新的1. 5niL離心管中，即為待檢模板DNA;(2) 進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A. 在裝有23uL LAMP反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入lyL待檢模板DNA， 和O. 5uL的UNG酶，于恒溫金屬浴上50。C放置3min，于恒溫金屬浴上95 。C放置3 —5min，立即置于冰上l一3min;B. 在上述反應(yīng)管中加入lwL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒溫金屬浴上60 — 65。C放置45 — 90min;D. 將金屬浴調(diào)到80 — 95。C中止反應(yīng)，3 —5min后取出待檢；(3) 顯色檢測(cè)在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1 P L顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化， 如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌不含或者不是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢 桿菌，如果顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明待檢樣品或者細(xì)菌含有或者為產(chǎn)氣莢膜 梭狀芽孢桿菌
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌快速檢測(cè)試劑盒的制備和使用方法。其中試劑盒內(nèi)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A、BstDNA聚合酶B、顯色劑C；反應(yīng)液A含有反應(yīng)緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內(nèi)引物5-TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCTCTATACCTGACACAGGGGA-3、下游內(nèi)引物5-CAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGATTAGCAGGATGATATGGAGTA-3、上游外引物5-TTTCTCAAAGGATAATAGTTGGT-3、下游外引物5-ATGTCCTGCGCTATCAAC-3和甜菜堿；檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法包括待測(cè)樣品或者細(xì)菌DNA的提取、創(chuàng)傷弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和顯色檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且成本低。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101200761SQ20071011517
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日
發(fā)明者劉彩霞, 超 林, 穎 陳, 高宏偉 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院