專利名稱：：培育抗草甘膦植物的雙價表達載體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種培育抗草甘膦植物的雙價表達載體，特別是涉及含有和G2-aro4基因的雙價植物表達載體。
背景技術：
：草甘膦(Glyphosate)為內吸傳導型、廣譜滅生性除草劑，其作用機制是通過抑制植物體內EPSP合酶(全稱為5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)活性，干擾植物體內芳香族氨基酸的生物合成，導致植物死亡(S.R.Padgetteetal.，inHerbicide-Resiste加Cro戸JgWcwtora/,五"v/ra柳e她/,五comoto'c,Wegw/atofy,anarec/jw/ca"specte,S.O.Duke,Ed.(CRCPress,BocaRaton,FL，1996)，pp.53-84)。如果植物體內的EPSP合酶基因發(fā)生突變，產生出與草甘膦親和性較低的EPSP合酶，不能很好的甚至根本不能與草甘膦結合，則此植物就具有了抗草甘膦能力。此外，有人利用乙酰轉移酶使植物體內的草甘膦N-乙酰化。研究表明，乙?；部墒共莞熟⑹コ輨┗钚?Castleetal.,2004)。然而，上述兩種方式的抗草甘膦效果并不十分令人滿意，如草甘膦在植物體內尤其是分生組織積累(Gougler&Geiger,1981)，會影響植物生殖發(fā)育進而降低作物產量(Plineetal.,2002)。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是構建同時含有抗草甘膦的EPSPS基因(G2-wa4)和N-乙酰轉移酶gW基因的雙價植物表達載體，培育具有更優(yōu)抗草甘膦能力的轉基因植物。本發(fā)明利用抗草甘膦的基因(G2-wa4)和iV-乙酰轉移酶g^基因，將草甘膦主動抗性途徑與被動抗性途徑相結合，構建了同時含有這兩個基因的植物表達載體。本發(fā)明提供的含有G2-wo4基因和gW基因的重組植物表達載體，能在植物中表達降解草甘膦的EPSPS合酶和使草甘膦N-乙?；腘-乙酰轉移酶。該重組雙價表達載體是指在編碼G2-wo4基因和g加基因的5'端可操作地連接有一個或多個酶切位點、一個或多個不同來源的啟動子序列、一個或多個不同來源的增強子序列、Q序列、Kozak序列和分泌信號序列、編碼G2-wo4基因和gW基因的DNA序列、以及3'端帶有多酶切位點及一個或多個不同來源的終止序列。為了使外源基因在植物細胞中在轉錄和翻譯水平上獲得高效表達，在外源基因側翼必須連接有適當的表達調控元件。本發(fā)明中設計了為在受體植物中高效表達G2一wo4基因和g^基因所需的啟動子、增強子、終止子、多聚腺苷酸序列、以及便于在適當的培養(yǎng)基中篩選被轉化細胞的選擇標記基因等。適于與本發(fā)明雙價載體中的G2—woA基因和gW基因連接，并在植物細胞中啟動該編碼DNA序列轉錄開始的包括組成型、誘導型、組織或器官特異性或發(fā)育階段特異性的啟動子。包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S或19S啟動子，甘露堿合成酶(MAS)啟動子，胭脂堿合成酶和章魚堿合成酶啟動子，玉米乙醇脫氫酶啟動子，二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基啟動子、由甘露堿合成酶基因的啟動子與花椰菜花葉病毒的35S啟動子相融合而成的啟動子、帶有兩個增強序列的花椰菜花葉病毒的35S啟動子、以及適于在單子葉植物中表達的Ubi、Emu、Actinl啟動子等。本發(fā)明優(yōu)選花椰菜花葉病毒的35S啟動子。所述終止子是指任何能終止結構基因在植物中表達的終止子，如包括質粒pTiA6的T-DNA7'5'雙向終止子、章魚堿合成酶基因終止子、花椰菜花葉病毒35SRNA終止子或胭脂堿合酶(Nos)基因或其他基因的終止子等等。本發(fā)明優(yōu)選Mw基因的終止子?？墒褂帽绢I域中已知的方法，將本發(fā)明提供的適于在植物細胞中表達的雙價基因構建體，連接到任何一種可在細菌細胞或植物細胞中自我復制的載體上。這樣的載體例如包括衍生于大腸桿菌的質粒載體pUC18、pUC19(Yanisch-perronetal.，Gene33:103-119，1985)，尤其是植物表達載體pBI101,pBI121，pBI131系統(Jefferson,etal"EMBOJ.16:3901，1987)及pCamBia系統(Hajdukiewiczetal.，PlantMolBiol25:989-994,1994;Hieietal.，ThePlantJ6:271-282，1994)等等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，攜帶G2—"raA基因和g加基因構建體的載體是pBlueScriptSK、pUC18、pUC19、pCamBia2301等，后者特別適于作為制備植物雙價表達載體的工具質粒載體。當然，如前所述，為了正確地選擇和鑒定被轉化的植物細胞，本發(fā)明的上述重組表達載體還應含有可選擇標記基因。所使用的選擇標記基因的兩側可帶有各自的調節(jié)序列，以促使它們在植物中的表達。適用的選擇標記是本領域內已知的。編碼選擇標記的外源基因及其他基因可以包含于同一個表達載體中，或者包含于轉化時同時應用的不同的載體中。本發(fā)明優(yōu)選的選擇標記基因是^/^//基因，并一同包含于同一個重組表達載體內，從而保證了對被轉化細胞或植株選擇的可靠性。歸納起來，本發(fā)明提供的適于在植物細胞中表達的G2—wo^基因和g"堪因植物雙價表達載體包含1)G2—araA基因表達盒；a)CaMV35S啟動子；b)編碼G2—woA基因的核苷酸序列；c)Nos終止子。2)g"/基因表達盒a)CaMV35S啟動子；b)編碼g加基因的核苷酸序列；c)Nos終止子。3)來源于pCamBia2301的載體部分a)NPTII表達盒；b)起始復制子及與植物轉化相關的T-DNA左右邊界序列等功能結構。為了在植物細胞中，特別是整株植物中表達外源基因，必須使用適當的方法將攜帶G2—araA基因和g加基因的重組雙價表達載體轉化或轉導到適當的宿主細胞或植物體內。將攜帶外源基因的重組載體導入宿主植物或其細胞內的許多方法都是本領域技術人員熟知的。這些方法包括但并不僅限于1)農桿菌介導的轉化法(_4gro6ac/e〃'ww-mediatedtransformation);2)物理法，如基因槍法(Particlebombardment或Particlegun或Genegun)、電擊法(Electroporation)、顯微注射法(Microinjection)、超聲波法(Ultrasonic)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纖維介導法(Siliconcarbidefiber)、電泳法(Electrophoretictransfection)等；3)化學法，如PEG介導的轉化法、脂質體介導轉化法等；4)種質系統轉化法，如花粉介導法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導的轉化法等等。本發(fā)明所述的植物既包括完整植株，也包括植物種子、植物體的器官、組織和細胞，還包括雙價轉基因植物的后代，以及由被轉化的細胞或愈傷組織再生的植物。在本發(fā)明給出的一個實例，所述植物是煙草。通過農桿菌介導法轉入煙草，得到了草甘膦抗性更強更穩(wěn)定的雙價轉基因煙草。本發(fā)明的優(yōu)點和效果通過將G2—wo4和ga堪因同時轉入植物，不但避免了草甘膦在植物體內積累所產生的負面影響，同時還提高了轉基因植物抵抗草甘膦的能力，在抗草甘膦植物基因工程中具有重要的應用前景。圖1是p2301G2-gat酶切分析。圖中，M:入DNAH/EMarker;1:￡coRI;2:^boRI+歷.77dlII;3:歷'/7dni+J^OTl;4:^boRI+J^M;5:5aT7HI+尸Stl;6:AcoRI+J6al。圖2是轉基因煙草的PCR檢測。圖中，A:轉g^基因M:Molecularmarker;CK+:p2301GAT質粒DNA為模板;l-ll:轉基因植株，CK-:受體NC89基因組DNA為模板；B:轉G2-ara^基因M:Molecularmarker;CK+:p2301G2質粒DNA為模板;l-6:轉基因植株，CK-:受體NC89基因組DNA為模板；C:轉gat和G2-aro^4基因M:Molecularmarker;CK+:p2301G2-gat質粒DNA為模板;l-ll:轉基因植株，CK-:受體NC89基因組DNA為模板。圖3是轉基因煙草的Southern雜交檢測。圖中，A:轉g^基因煙草的Southern檢領"M:MolecularMarker;CK+:p2301GAT質粒DNA;1~6:轉基因煙草2#，5#，9#，6#，10#，31#;CK-:NC89B:雙價轉基因煙草的Southern檢測，M:MolecularMarker;CK+:p2301G2-gat質粒DNA;1~6:轉基因煙草2#，3#，5#，11#，17#，21#;CK-:NC89，其中2.6kb片段為包含完整G2-oTO^基因的雜交條帶，而0.8kb與0.9kb雜交條帶中分別包含gat基因的320bp與121bp大小的片段。圖4是轉基因煙草的RT-PCR檢測。圖中，A:轉g加基因煙草的RT-PCR檢測，M:Molecularmarker;CK+-p2301GAT質粒DNA為模板；2-6:轉基因植株2#，5#，9#，6#，10#，31#;7:Non-RT;CK-:Non-transgene植株；B:轉G2-ar"基因煙草的RT-PCR檢測，M:Molecularmarker;CK+:p2301G2質粒DNA為模板；2-6:轉基因植株2、5#，9*，6#，10#，31*;7:Non-RT;CK-:Non-transgene植株；C:雙價轉基因煙草gW和G2-ara^基因RT-PCR檢測，M:Molecularmarker;CK+:p2301G2-gat質粒DNA為模板；2-6:轉基因植株2#，5#，9#，6、10#，31#;7:Non-RT;CK-:Non-transgene植株。圖5是轉煙草的westernblot檢測。其中，A:轉gat基因煙草的westernblot檢測，CK+:EGAT表達產物CK-:Non-transgene植株；1-5:轉基因植株2弁，5#，9#，6#，10#;B:雙價轉基因煙草的westernblot檢測，CK+:EGAT與MEPS表達產物CK-:Non-transgene植株;1-5:轉基因植株2#，3#，5#，11#，17#。圖6是噴施草甘膦劑(l升/公頃劑量的Roundup除草劑)后，4種不同的煙草(包括轉基因和非轉基因)的生長情況，作為對草甘膦抗性分析，4種煙草分別是(a)GAT和EPSPS雙價轉基因，(b)GAT單價轉基因，(c)EPSPS單價轉基因，(d)非轉基因受體NC89煙草。具體實施例方式以下實施例中所舉的質粒、菌株、植物等只是用于對本發(fā)明的方法作進一步舉例說明，并不對本發(fā)明的實質內容加以限制。實施例中使用的質粒、菌株來源如下植物表達載體pBI121為Clontech公司市售產品；植物表達載體pCamBia2301、質粒pGAT、質粒pG2和質粒p4A:來源于中國農業(yè)科學院生物技術所林敏實驗室構建保存；克隆載體pBluescriptII(SK)(-):為Stratagene公司市售產品克隆載體T-載體和受體菌E.coliDH5a為TaKaRa公司市售產品；受體菌LBA4404:為Gibco公司市售產品。實施例l雙價植物表達載體的構建1)以pGAT質粒為模板，以5'GCTCGAGATGATTGACGTGAACCCAAT3'與5，GGTTAACTTATGCGATCCTCTTGTACA3'為引物(加A^oI和/pfll位點)利用PCR擴增得到兩端分別帶有^oI和/z;^I限制性位點的基因片段，與T-載體連接；2)1)中的連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為pGAT-T;3)p4A和pSK質粒經與歷miIII消化后分別回收1.4kb和2.7kb的DNA條帶，連接后轉化大腸桿菌DH5ct，挑選陽性克隆，命名為pSK4A;4)pSK4A和pGAT-T質粒經力ol與消化后分別回收4.1kb和435bp的DNA條帶，連接后轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為pS4AGAT;5)pS4AGAT和pCAMBIA2301質粒經K戸I與戶M消化后分別回收1.8kb禾Q11.6kb的DNA條帶，連接后轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為p2301GAT;6)以pG2質粒為模板，以5，GCTCGAGATGGCGTGTTTGCCTGATGA3，與5，GGTTAACTCAGTCGTTTAGGTGAACGCC3'為引物(加入力al和feci位點)利用PCR擴增得到兩端分別帶有力fll和Sad限制性位點的基因片段，與T-載體連接轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為pG2-T;7)pSK和pBI121質粒經五coRI和///"dill雙切，分別回收2.7kb和2.9kb的DNA條帶，連接后轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為pSK121;8)pSK121和pG2-T質粒經Wfll和Sacl雙切，分別回收3.7kb和1.35kb的DNA條帶，連接后轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為pSKG2;9)pSKG2和pCAMBIA2301質粒經K/wI和五coRI雙酶切，分別回收11.6kb和2.5kb的DNA條帶，連接后轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為p2301G2;10)p2301G2首先用^wnHI酶切，回收大片段后用T4DNA聚合酶(Takara公司)進行粘性末端的補平，然后經《;wl酶切消化后回收大的DNA條帶；pS4AGAT經與雙切后回收1.8kb的DNA條帶，與前面片段連接后轉化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，命名為pG2-GAT;11)pG2-GAT經多種酶切鑒定，證明構建的載體是正確的。酶切鑒定見圖l。實施例2農桿菌介導法獲得雙價轉基因煙草本實施例利用農桿菌介導法，成功的獲得了具有G2—37"oA基因和gat基因的轉基因煙草。采用的煙草受體材料為NC89，農桿菌為LBA4404，具體操作步驟如下1)根癌農桿菌LBA4404感受態(tài)的制備(1)從平板上挑取單菌落，接種到5mlYEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素Strep125mg/L)，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜(2)取2ml菌液，加入50mlYEB液體培養(yǎng)基(含Strep125mg/L)中，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)至0D6(X)約0.6左右(3)將菌液轉至50ml無菌離心管中，冰浴30min。5000rpm離心5min(4)棄上清，沉淀用2ml20mMCaCl2重懸，每份100pi分裝到1.5ml離心管中，液氮中保存?zhèn)溆谩?)重組質粒DNA轉入農桿菌HlLBA4404感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴5min(2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉至37°C水浴中溫浴5min(3)加入lmlYEB液體培養(yǎng)基，在28°C搖床上250rpm復蘇4-5h(4)取適量菌液涂布到含Strep250-300mg/L、Rif(利福平)250-300mg/L和Kan(卡那霉素)100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上，置28°C培養(yǎng)24-48h。3)葉盤法轉化煙草品種NC89(1)農桿菌的活化從平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5mlYEB液體培養(yǎng)基中(Kan100mg/L,Strep100mg/L，Rif300mg/L),振蕩培養(yǎng)過夜；取1ml菌液接種到50mlYEB液體培養(yǎng)基(Kan100mg/L,Strep100mg/L，Rif300mg/L)中，劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.5(約3-4h);5,000rpm離心5min，菌體用MSo培養(yǎng)基(不含激素)重懸，使0D6(K)為0.1-0.2(2)煙草的遺傳轉化a)共培養(yǎng)將侵染過的葉塊擺放在鋪有2層濾紙的煙草芽分化培養(yǎng)基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L)上，25°C暗培養(yǎng)4天b)抗性芽的篩選將經過共培養(yǎng)的煙草外植體轉移到抗性芽篩選培養(yǎng)基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L+Kan100mg/L+Cef(噻孢霉素)500mg/L)上，23周后即可生芽生根待抗性芽長到1cm左右時，將其轉移到生根培養(yǎng)基(MS+Kan100mg/L+Cef500mg/L)上，1~2周后即有不定根形成。實驗例l轉基因煙草的分子檢測1.1煙草DNA的提取I)25-50mg新鮮煙草葉片于1.5mlEppendorf管內研磨2)加入700pi65°C預熱的DNA提取緩沖液(2%(W/V)CTAB,1.42MNaCl,20mMEDTA，100mMTris-HCl，2%巰基乙醇，pH8.0)3)加入7piRAase(20mg/ml),65°C水浴1h4)常溫離心10min5)取上清，加等體積氯仿-異戊醇抽提6)常溫離心10min7)取上清，加2倍體積無水乙醇和1/10體積的3MNaAc(pH5.2)，-20。C沉淀30min8)12000rpm、4'C離心10min9)沉淀用70%乙醇漂洗一次，離心，晾干10)加適量TE溶解II)測定DNA的濃度，取少量樣品電泳，Agarose膠的濃度為1%12)樣品在4'C保存?zhèn)溆谩?.2轉基因煙草的PCR檢測1)gfl遂因PCR以Fl(5'ATGATTGACGTGAACCCAAT3，)與Rl(5，TTATGCGATCCTCTTGTACA3')為引物，基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增條件94'C預變性5min，94°C30sec，60°C30sec,72°C30sec,25個循環(huán)，72。C延伸5min。2)G2-ara^基因PCR以F2(5'ATGGCGTGTTTGCCTGATGA3，)與R2(5'TCAGTCGTTTAGGTGAACGCC3')為引物，基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增條件94'C預變性5min，94°C30see,58°C30sec,72°C90sec，25個循環(huán)，72。C延伸5min。結果見圖2。1.3轉基因煙草的Southernblot檢測分別取三類轉基因煙草PCR陽性植株基因組DNA10pg經適當限制性酶切消化，毛細管法轉移到HybondTM-N+膜上，以ga/基因與G2-araJ基因DNA片段為模板制備探針，利用DIG-HighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII(購自BoehringerMannheimBiochemicals)進行Southernblot檢測。其中基因單價轉基因煙草DNA采用賴'wdlII與&oRI雙切，雙價轉基因煙草采用五coRI與AT;wI雙切。具體操作如下1)轉膜(1)DNA電泳后，將凝膠轉移到一玻璃烤盤中。用刀片修去凝膠邊緣無用的部分，包括加樣孔上方的凝膠。在凝膠上保留足夠的加樣孔以使DNA轉移結束后將加樣孔的位置標記于膜上，在凝膠左下角切去一小三角形(加樣孔一端為下)，作為凝膠方位的標記(2)將凝膠浸入200ml變性液中，室溫下放置45min，并輕輕振蕩；用去離子水短暫浸泡凝膠，然后將凝膠浸于200ml(或IO倍于凝膠體積)中和緩沖液中，室溫放置30min，并輕輕振蕩。換一次中和緩沖液繼續(xù)浸泡凝膠15min(3)當對凝膠進行浸泡處理時，準備雜交膜。戴干凈手套，剪下一塊膜，膜的大小，應該比凝膠長lcm寬lcm。將膜漂浮于盛有去離子水的皿中直到膜從下往上完全浸濕，然后將膜浸入轉移緩沖液中至少5min。用干凈的刀片切下膜的一角，與凝膠切下的一角相一致。剪出6片與膜面積相等的濾紙，將其中的2片濾紙用轉移緩沖液浸泡(4)DNA進行變性的過程中，將一張厚的吸水紙放在一片樹脂玻璃板或玻璃皿上形成比凝膠長且寬的支持物，吸水紙的兩端浸入轉移液中，皿中放入適當的轉移緩沖液直到液面幾乎與支持物表面平齊，當支持物上的吸水紙完全濕潤后，用一只玻璃棒趕走氣泡(5)取出凝膠并倒轉使原來的底面向上，把倒轉的凝膠小心地滑到支持物上并位于濾紙中央，確保濾紙和凝膠之間無任何氣泡(6)用Saran包裝膜或Parafilm膜圍繞凝膠四周，但不要覆蓋凝膠(7)用適當的轉移緩沖液將凝膠濕潤。將濕潤的膜置于凝膠上并使兩者切角相重疊。為避免產生氣泡，應當先使膜的一角與凝膠接觸再緩慢的將膜放到凝膠上。膜的一條邊緣應恰好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣(8)將轉移緩沖液浸濕的兩張濾紙置于濕潤的膜上，用吸管趕走滯留的氣泡，繼而在上面鋪4張干的濾紙(9)剪切一個5-8cm高的面巾紙塔，其大小和濾紙基本相同或略小，將紙塔放在濾紙上面，在紙巾頂部放一塊玻璃板然后用400g重物壓實(10)DNA轉移需進行8-24h，當紙巾濕潤后更換新的紙巾，盡量避免整疊紙巾都被緩沖液浸濕。除去凝膠上的紙巾以及吸水濾紙。翻轉凝膠以及與之接觸的膜，凝膠向上。(11)平放于干燥的吸水紙上，用一支極軟鉛筆或圓珠筆標記加樣孔的位置；將凝膠從膜上剝離，棄去凝膠；將膜浸于6xSSC中，5min(12)真空烘烤固定DNA:將膜從6xSSC中取出并使多余的液體流凈。將膜放在紙巾上室溫下晾干30min，然后將膜夾在兩張干燥的吸水紙中間，在真空爐中80°C烘烤30-120min。2)標記探針(1)向500pl離心管中加入l嗎的模板DNA，加超純水至16^(2)沸水中加熱10min后，迅速用冰/鹽浴冷卻使DNA變性(3)加4piDIG-HIGHPrimer，混勻，瞬時離心(4)37。C過夜(5)加入2pl0.2mol/1EDTA(pH8.0)或65。C加熱10分鐘終止反應。3)雜交(1)力卩200nlNBT/BCIP濃縮液到10mlDetectionbuffer(0.1MTris-HCl，0.1MNaCl,50mMMgCl2，pH9.5)中(2)預熱適當體積的DIGEasyHyb液(37-42°C)(10ml/100cm2膜)(3)在雜交管中預雜交膜30分鐘(4)煮沸DIG-labeledDNAprobe(約25ng/mlDIGEasyHyb)5分鐘變性后迅速置于冰上冷卻(5)加入變性的DIG-labeledDNAprobe于預熱的DIGEasyHyb液中G.5ml/100cm2膜)混勻(注意不要產生氣泡)，雜交4小時或過夜。4)洗膜(1)用2xSSC,O.P/。SDS在15-25。C洗滌，2次5分鐘。(2)用0.5xSSC，0.1%SDS(提前預熱)在65-68t)洗滌，2次15分鐘。5)檢測(所有孵育均在25-5(TC下進行)(1)洗完膜后，用Washingbuffer(Maleicacidbuffer(0.1mol/lmaleicacid，0.15mol/lNaCl,用NaOH調至pH7.5)加0.3%的Tween20(v/v))輕輕洗膜一次(1-5分鐘)(2)在100mllxBlockingsolution(用Maleicacidbuffer稀釋lOxblockingsolution(試劑盒所帶)1:10)中孵育30分鐘(3)在20mlAntibodysolution(Anit-Digoxigenin-AP1:10000inBlockingsolution)再孵育30分鐘(4)用100mlWashingbuffer洗滌2次15分鐘(5)用20mlDetectionbuffer平衡2-5分鐘(6)將膜面朝上放入雜交袋中，立即加入lmlCSPDready-to-use(bottle5)，15-25'C孵育5分鐘(7)趕出氣泡和多余液體，封上雜交袋(8)37。C孵育10分鐘(9)X-ray片曝光15-25分鐘(15-25。C)。6)硝酸纖維素膜上洗去探針(1)準備數百毫升洗脫液0.05xSSC，0.01MEDTA(pH8.0)煮沸(2)將洗脫液從加熱器上移下，加入SDS至終濃度0.P/。(w/v)(3)將膜浸入上述熱洗脫液15分鐘，期間輕輕搖動(4)新配制洗脫液重復步驟2-3(注意所有過程不能使膜干燥)(5)用0.01xSSC于室溫下短暫漂洗濾膜，在濾紙上控去大部分液體(6)X-ray檢測探針是否去除干凈(7)晾干濾膜，鋁箔包好，室溫、真空下保存。結果見圖3。1.4轉基因煙草的RT-PCR檢測煙草葉片總RNA的提取(RNA提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司W6771)1)煙草葉片的裂解液氮冷凍條件下將組織搗碎成粉末。待液氮自然揮發(fā)后，加入500plTCP液，用移液器抽打5次以懸浮樣品。移入1.5ml離心管，立即用帶針頭的一次性5ml注射器抽打裂解物10次。12，000rpm離心3min，將上清移入另外一個離心管中2)加入250nl75。/。乙醇。徹底混勻后，全部移入吸附柱中。離心30sec。倒掉收集管中的液體。將吸附柱移入同一個收集管中3)加入500plRP液，離心30sec。棄收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中14)加入500液，靜置lmin后，離心15sec5)將吸附柱移入一個干凈的收集管中，加入500plW3液，離心15sec6)倒掉收集管中的液體，再將吸附柱移入同一個收集管中，離心lmin7)將吸附柱移入另一個干凈的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入50pl純水，室溫靜置1min后，離心1min。將1.5ml離心管(RNA)置于-70。C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛outhernblot陽性植株總RNA，總RNA經DNAaseI作用去除DNA的污染。反轉錄按試劑盒說明進行操作(ProtoScript第一鏈cDNA合成試劑盒，NEB)。其中基因，G2-ara^基因反轉錄引物分別為Rl(5'TTATGCGATCCTCTTGTACA3，)，R2(5，TCAGTCGTTTAGGTGAACGCC3');雙價轉基因煙草反轉錄引物分別為Rl與R2。RT-PCR反應條件為g加基因94。C預變性5min，94°C30sec,64°C30sec，72°C30sec，30個循環(huán)，72。C延伸5min;G2-aro^基因94。C預變性5min，94°C30sec，62°C30sec，72°C90sec，25個循環(huán)，72。C延伸5min。結果見圖4。1.5轉基因煙草的Westernblot檢測提取RT-PCR陽性植株葉片蛋白取lOOmg新鮮煙草葉片，加入液氮和石英砂，充分研磨；將粉末轉入1.5ml離心管，待液氮完全揮發(fā)后，加入800u1蛋白提取buffer(200mMTris-HCl(pH8.0)，lOOmMNaCl，400mM庶糖，14mMP—巰基乙醇，1mMPMSF，0.05%Tween20)，振蕩5min;12500rpm，4'C離心20min，取上清即為葉片粗蛋白，進行Westernblot檢測。Westernblot分析溶液配制a)Transferbuffer:1L25mMTris192mMGlycinePH8.3稱取3.03gTris,14.4gGlycin定容至1Lb)10xAP顯色Buffer:50ml1MTris-HCLPH9.51MNaCl50mMMgCl26.057gTris加濃鹽酸300^左右調pH至9.52.922gNaCl4MMgCL21.25ml定容至50ml用時稀釋10倍c)10xTBS:畫mMTris-HCLpH8.01.5MNaCld)TBST:lxTBS+0.05%Tween20e)封閉液:TBST+5%脫脂奶粉(或3%BSA)實驗步驟1)PVDF膜剪成與膠等大，甲醇浸泡30sec，放入轉移Buffer(25mMTris，192mMGlycinepH8.3)中平衡，海綿片，濾紙片，電泳膠及PVDF膜放在轉移Buffer中平衡20min2)三明治方法海綿，濾紙，膜，膠，濾紙，海綿，黑色夾板依次排好，確保膠與膜之間沒有氣泡，夾緊裝置，黑色板與黑色電極相對，放入轉移槽中，冷卻槽在冰箱內凍成冰，放入轉移槽里,加入Buffer3)插好電極，正，負/紅，黑相對，負—正轉移4)穩(wěn)流350Ma電壓約80-130V之間。隨時間推移，電壓會下降。若轉膜裝置發(fā)熱，將其置于裝滿冰的盒中冷卻。轉膜ih5)卸下裝置，PVDF膜用轉移Buffer漂洗一下，室溫封閉2h(封閉液:3。/。BSA35ml)6)將膠放入染色液中染色，無任何蛋白條帶則轉膜完全7)封閉液10ml+10nl抗血清(1:1000)室溫結合l-2h8)用TBST(lxTBS(10xTBS100mMTris-HCLpH8.0，1.5MNaCl)+0.05%Tween209)洗膜3次，每次50ml，每次10-30min，搖動10)加入TBST20ml加入0.7pl二抗(1:30000)室溫輕輕搖動1h11)用TBST洗膜3次，每次50ml，15min12)取5mlAPBuffer(1MTris國HCLpH9.51MNaCl，50mMMgCl2)加入33piNBT貯存液，混勻后立即加入16.5^BCIP混勻，將膜放入輕柔晃動，暗處顯色10min。待顯色到所需強度后，倒出顯色液，加入ddH20終止反應。結果見圖5。實驗例2To代轉基因植株采用葉面噴施草甘膦法抗性分析1、0.8升/公頃劑量的Roundup除草劑噴施處理方法選取長勢良好、均一的轉ga/、G2-flroJ以及g""G2-m^4雙價基因的煙草各30株，當植株長至6-8葉期時以0.8升/公頃劑量的Roundup除草劑噴施處理，以10株受體煙草(NC89)為對照，觀察其受害狀況。結果對照植株噴施后l-3天，全部對照植株表現出受害癥狀，部分葉片及莖尖開始稍有萎蔫，5天后全部嚴重萎蔫并有失綠發(fā)生，一周后全部死亡。轉g^基因煙草處理兩周后有煙草24株存活，沒有明顯的受害癥狀，其余6株處理5天后開始萎蔫，兩周后逐漸死亡；轉ar^基因煙草處理兩周后只有4株存活且有3株表現受害癥狀，部分葉片失綠；雙價轉基因煙草26株生長正常，具有草甘膦耐受能力，沒有明顯的受害癥狀，僅4株處理5天后開始萎蔫逐漸失綠死亡。2、1升/公頃劑量的Roundup除草劑噴施處理方法同上。但以1升/公頃劑量的Roundup除草劑噴施處理。結果兩周后，所有單價轉基因煙草均不能存活，而雙價轉基因煙草仍有兩株存活，且表現輕微受害癥狀(圖6)。表明雙價轉基因煙草較單價轉基因煙草具有更高的草甘膦耐受能力。實驗例3子一代轉基因煙草種子發(fā)芽實驗草甘膦抗性分析方法未經轉化的受體煙草種子經表面滅菌后，接種于含不同濃度草甘膦(0，30，50，80，100，150，200pM)MSo培養(yǎng)基上，在25。C、1200Lx暗光照下萌發(fā)。4周后觀察幼苗生長狀況，確定使煙草完全白化的最低草甘膦濃度。轉基因煙草種子經同樣處理，接種于含(高于使受體煙草完全白化的最低濃度草甘膦)不同濃度草甘膦U00nM，200pM，lmM，5mM，10mM)MSo培養(yǎng)基上相同條件萌發(fā)，4周后觀察幼苗生長狀況。以幼葉完全綠，或大部分綠只有一些白化部位為草甘膦抗性苗;白化死亡為非抗性苗。結果三種類型轉基因煙草子一代種子在含有不同濃度草甘膦的MSO培養(yǎng)基上存活率比較結果見表l。當草甘膦濃度為100pM時，轉卵t、G2-arW基因單價與卵t+G2-ara/J基因雙價煙草子均具有耐受能力，種子萌發(fā)后的存活率間無明顯差異，分別為74%，74%和77%;當草甘膦濃度達到lraM時含有G2-a^^基因的單價轉基因煙草，巳經無抗性植株存活，卵t卓份與卵t+G2-s/^l基因雙價轉基因煙草的存活率無明顯差異，分別為73%和74%;當草甘膦濃度達到lOmM時，含有《st基因的單價轉基因煙草全部植株白化死亡，而含有gat+G2-ard基因的雙價轉基因煙草仍有14%的植株存活，差異達極顯著水平。表l轉基因煙草在不同草甘膦濃度培養(yǎng)基上的存活率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注1、表中的百分數表示存活百分率；2、多重比較采用LSD法，不同大寫字母表示差異達到O.Ol的顯著水平。結論以上結果表明，雙價轉基因煙草L代種子草甘膦抗性好于gat和G2-arM單價轉基因煙草Tt代種子。權利要求1.一種重組雙價表達載體，其特征是含有G2-aroA基因和gat基因。2.根據權利要求1所述的重組雙價表達載體，適于與所述載體中的G2—srM基因和卵t基因連接，并在植物細胞中啟動該編碼DNA序列轉錄開始的啟動子是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。3.根據權利要求1所述的重組雙價表達載體，終止結構基因在植物中表達的終止子是/Vos基因的終止子。4.根據權利要求1、2、3中任一權利要求所述的重組雙價表達載體，攜帶G2—arW基因和卵t基因構建體的載體選自pBlueScriptSK、pUC18、pUC19或pCamBia2301之一。5.根據權利要求1所述的重組雙價表達載體的用途，是在植物中表達可降解草甘膦的EPSPS合酶和使草甘膦N-乙?；腘-乙酰轉移酶。6.根據權利要求5所述的重組雙價表達載體的用途，是培育耐受草甘膦的轉基因植物。7.—種耐受草甘膦轉基因植物的培育方法，是利用權利要求1所述的重組雙價表達載體，將G2-arW基因和卵t基因轉化至受體植物。8.根據權利要求7所述的耐受草甘膦轉基因植物的培育方法，所述受體植物既包括完整植株，也包括植物種子、植物體的器官、組織和細胞，還包括雙價轉基因植物的后代，以及由被轉化的細胞或愈傷組織再生的植物。9.根據權利要求7或8所述的耐受草甘膦轉基因植物的培育方法，所述受體植物為煙草。全文摘要本發(fā)明涉及一種培育高抗草甘膦轉基因植物的雙價植物表達載體。本發(fā)明構建了同時含有抗草甘膦的EPSPS基因(G2-aroA)和N-乙酰轉移酶基因(gat)的雙價植物表達載體，用該載體轉化的植物比含單個基因的轉基因植物具有更優(yōu)的抗草甘膦能力。用本發(fā)明的方法可培育多種高抗草甘膦的轉基因植物。文檔編號C12N15/54GK101100676SQ200710118968公開日2008年1月9日申請日期2007年6月15日優(yōu)先權日2007年6月15日發(fā)明者敏林,王旭靜,頓寶慶申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所