專利名稱：一種微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，特別涉及一種微囊藻毒素-LR酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
水體富營養(yǎng)化致使藻類異常增殖并釋放微囊藻毒素(Microcystins，MCs)，其中微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR，MC-LR)是目前已知急性毒性最強、危害最大的一種淡水藍藻毒素。微囊藻毒素-LR是一組環(huán)狀七肽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式I所示 (式I)微囊藻毒素水華的頻繁暴發(fā)嚴重威脅著生態(tài)安全和人類的飲水安全，對水中微囊藻毒素及時準確的監(jiān)測非常重要。目前對水體中藻毒素檢測技術(shù)的研究開發(fā)非常活躍，主要有高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)以及蛋白磷酸酶抑制試驗(Protein Phosphatase Inhibition Assay，PPIA)等。
常規(guī)的理化檢測方法，特別是液相色譜和質(zhì)譜分析儀器體積龐大、價格昂貴、需要環(huán)境條件較高的室內(nèi)環(huán)境、而且還需要專門的技術(shù)人員操作、前處理復(fù)雜、檢測費用昂貴；并且由于微囊藻毒素異構(gòu)體眾多，且性質(zhì)近似，缺少相應(yīng)標準品，成為微囊藻毒素大規(guī)模篩查的限制條件。而磷酸酶抑制試驗和細胞試驗雖然都能很好地檢測出毒素，但是存在靈敏度不高或檢測過程繁瑣，樣品通量小等不足。免疫檢測是基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的分析方法，具有檢測特異性強、靈敏度高、分析通量大、檢測速度快、費用低廉等優(yōu)點，能適應(yīng)大規(guī)模樣品的快速篩查和預(yù)警監(jiān)測。研制微囊藻毒素的ELISA試劑盒，對于微囊藻毒素的大規(guī)模樣品的快速篩查和預(yù)警監(jiān)測具有非常重要的經(jīng)濟和社會意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
本發(fā)明所提供的微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括包被抗原、微囊藻毒素-LR多克隆抗體或單克隆抗體和酶標二抗；所述包被抗原為完全抗原A；所述完全抗原A按照如下方法制備在微囊藻毒素-LR的第七位氨基酸殘基N-甲基脫氫丙氨酸上引入一個氨基，得到經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR；再將該經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR與載體蛋白偶聯(lián)得到所述微囊藻毒素-LR與載體蛋白的偶聯(lián)物，即完全抗原A。
其中，所述載體蛋白可為任意一種常用的載體蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或卵清白蛋白(OVA)等大分子白蛋白，優(yōu)選為牛血清白蛋白；所述偶聯(lián)方法可采用常規(guī)的戊二醛法或N-琥珀酰亞胺法等。用于包被抗原的固相載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等，載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
所述微囊藻毒素-LR多克隆抗體或單克隆抗體是以完全抗原A為免疫原得到的抗體。
所述微囊藻毒素-LR單克隆抗體可按照下述方法制備用完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞株；培養(yǎng)所述陽性雜交瘤細胞株或?qū)⑺鲫栃噪s交瘤細胞株注入同系小鼠腹腔誘生腹水，得到微囊藻毒素-LR的單克隆抗體。
所述用于免疫的小鼠具體可為Balb/c小鼠；免疫方法為每只小鼠每次免疫所用的所述完全抗原劑A量為15-40μg，兩次免疫的間隔時間為20-40天；免疫方式為皮下多點注射；所小鼠骨髓瘤細胞具體可為小鼠骨髓瘤細胞SP2/0。
所述篩選陽性雜交瘤細胞株的方法具體可為先用包被抗原篩選1-2次，再用微囊藻毒素-LR單體篩選至少1次；所述包被抗原為將所述步驟1)中的經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR多肽與載體蛋白偶聯(lián)得到的完全抗原B；所述完全抗原B與所述完全抗原A中的載體蛋白不相同。
其中，所述完全抗原B中的載體蛋白具體可為任意一種不同于完全抗原A中的載體蛋白的常用載體蛋白。
本發(fā)明利用上述免疫方法和篩選方法，用合成的完全抗原免疫小鼠，得到了只針對完全抗原上小分子微囊藻毒素-LR的抗體。
所述陽性雜交瘤細胞株具體可為能分泌抗Microcystin-LR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10，其保藏號為CGMCC No.2101。
所述方法中還可包括純化所述單克隆抗體的步驟，將上述腹水或上層培養(yǎng)液分離純化后，即獲得抗微囊藻毒素的單克隆抗體。
為提高單克隆抗體的純度，可用免疫親和層析方法對其進行純化，尤以HiTraprProtein A FF 1mL免疫親和層析柱的純化效果好。
所述微囊藻毒素-LR的單克隆抗體，具體可由保藏號為CGMCC No.2101的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10產(chǎn)生。
能分泌抗Microcystin-LR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10，已于2007年06月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，保藏編號為CGMCC No.2101。
所述酶標二抗的標記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括微囊藻毒素-LR標準品溶液、顯色劑、終止液、洗滌液和底物溶液等酶聯(lián)免疫檢測用溶液。
本檢測試劑盒具體可包括微囊藻毒素-LR標準溶液試劑瓶；上述微囊藻毒素-LR多克隆抗體或單克隆抗體溶液試劑瓶；酶標二抗溶液試劑瓶；洗滌液試劑瓶；底物溶液試劑瓶；顯色劑溶液試劑瓶；終止液試劑瓶；可拆卸酶標板和試劑盒盒體。
試劑瓶和酶標板均安裝在試劑盒盒體內(nèi)。酶標板是包被了上述包被抗原的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，有24孔、或48孔、或96孔。
所用試劑的配制和酶標板的包被如下a)標準溶液的配制采用從Sigma或Alexis公司購買的微囊藻毒素-LR作為標準品，采用高純水分別配制成低濃度、中濃度、高濃度的微囊藻毒素標準溶液，分別灌裝入微囊藻毒素標準品試劑瓶中。其中，中濃度應(yīng)該接近標準曲線的半抑制濃度(IC50)、低濃度和高濃度應(yīng)分別接近試劑盒的最低和最高檢測濃度(檢測限)。
b)抗體溶液配制將上述微囊藻毒素-LR多克隆抗體或單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋成工作濃度，并加入0.5％-5％的牛血清白蛋白(BSA)和防腐劑，灌裝入試劑瓶中。
c)酶標二抗溶液配制辣根過氧化物酶-羊抗鼠(或兔)IgG原液，灌裝入試劑瓶中，使用時用洗滌液稀釋成工作濃度。
d)洗滌液配制配制含吐溫-20的PBS干粉，或配制n倍含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(n＝1-12)，灌裝入試劑瓶中。使用時，將該溶液用純水稀釋成含0.05％吐溫-20和8g/L氯化鈉的0.01mol/L pH＝7.5磷酸鹽緩沖液。
e)底物溶液配制使用0.1mol/L pH＝5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液，每1ml緩沖液中加入適量H2O2溶液，灌裝入試劑瓶中。
f)顯色劑溶液配制用0.1mol/L pH＝5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制四甲基聯(lián)苯胺溶液，灌裝入試劑瓶中。
g)終止液配制2mol/L H2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
h)酶標板的包被采用聚苯乙烯酶標板包被，包被抗原采用上述完全抗原A；封閉采用大分子蛋白或明膠，真空封裝。
本發(fā)明的微囊藻毒素-LR競爭ELISA試劑盒的使用方法是將標準溶液或樣品溶液與適當稀釋的抗微囊藻毒素抗體同時加入酶標板小孔中，同時設(shè)置空白和陰性對照孔，室溫或37℃溫育0.5-1h，倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)用洗滌液洗滌2-5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打；加入適當稀釋度的酶標抗抗體溶液于酶標板小孔中，室溫或37℃溫育0.5-1h，用洗滌液重復(fù)洗3-5次，吸干；加入底物溶液和顯色溶液到酶標板小孔中，室溫下反應(yīng)10-15min，顏色顯藍色，再加入終止液，立即變成黃色；用酶標儀在波長450m處測定吸光度A，以不加抗體的小孔作為空白調(diào)零。
測定系列微囊藻毒素-LR標準溶液孔的吸光度A，以各濃度的吸光度A為縱坐標，以對應(yīng)微囊藻毒素-LR濃度的log值為橫坐標，繪制半對數(shù)標準曲線圖。以待測樣品溶液的吸光度，在標準曲線上查出相應(yīng)的微囊藻毒素-LR濃度，再換算出樣品中微囊藻毒素-LR的含量。
本發(fā)明采用方陣試驗，確定最佳的包被抗原濃度(0.25μg/mL)和抗體工作濃度(0.3μg/mL)。
本發(fā)明的微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測原理是，使用時將標準品或樣品和抗體混合后加入酶標板中，標準品或樣品中的抗原和固相載體上的包被抗原一起競爭性地與溶液中的抗體結(jié)合，洗滌去除游離的抗原以及抗原抗體復(fù)合物，與固相載體上包被抗原結(jié)合的抗體再與酶標二抗結(jié)合，用酶底物進行測定，結(jié)合的酶標記物將無色的顯色劑轉(zhuǎn)化為有色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后用酶標儀測量吸光度，吸光度與樣品中的微囊藻毒素-LR濃度成反比。
本發(fā)明的微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具有靈敏度高、結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、快速、準確的特點。并適用于水中、動物源水產(chǎn)品(如魚類、蚌殼類等)及植物源水產(chǎn)品中微囊藻毒素-LR的定量檢測。例如實施例3中的微囊藻毒素-LR競爭ELISA檢測試劑盒，其檢測范圍在0.10μg/L-30.00μg/L之間，定量檢測區(qū)間在0.30μg/L-10.00μg/L之間。檢測時間小于3小時，可同時檢測上百個樣品。本發(fā)明的微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒平均回收率(100.3±5.9)％，批內(nèi)誤差小于15％，準確度和精密度符合要求，能進行環(huán)境樣品中微囊藻毒素-LR的大規(guī)?？焖俸Y查和預(yù)警監(jiān)測。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為實施例3的微囊藻毒素-LR競爭ELISA試劑盒標準曲線具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
骨髓瘤細胞SP2/0種子來源于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞中心。6周齡的Balb/c純系雌性小鼠購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。新生牛血清(PAA，Lot B00104-0786)，細胞融合用PEG 1500(Roche，11423800)，50×HAT儲液(Sigma，H0262，Lot 093K8931)，50×HT儲液(Sigma H0137，Lot 064K8927)，IMDM培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036)，氨芐青霉素鈉(Amresco 0339)，硫酸鏈霉素(Amresco 0382)，8-Azaguanine(Sigma A5284)，DMSO(Amresco 0231)，石蠟油，無水乙醚、異丙醇(北京化學(xué)試劑公司)。MC-LR(Alexis公司(Lausen，Switzerland)，產(chǎn)品編號ALX-350-012)。BSA(Sigma，A7638)。OVA(Sigma，A5378)。
實施例1、雜交瘤細胞株MC8C10 CGMCC No.2101的獲得及其產(chǎn)生的抗微囊藻毒素-LR的單克隆抗體MC8C10的鑒定一、雜交瘤細胞株MC8C10 CGMCC No.2101的獲得1、微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA的合成將微囊藻毒素-LR采用2-巰基乙胺進行化學(xué)修飾，在其第七位氨基酸(Mdha)上引入一個活性基團——氨基，再采用戊二醛法將修飾后的微囊藻毒素-LR與牛血清白蛋白偶聯(lián)，經(jīng)過濾層析后得到完全抗原，經(jīng)MALDI-TOF/MS確定完全抗原的偶聯(lián)比。具體方法如下
(1)對微囊藻毒素-LR進行氨基修飾①將2-巰基乙胺和MC-LR按照摩爾比3000∶1充分混和在堿性的碳酸鹽緩沖液中(pH＝8.0)；混合物充分搖勻，在50℃反應(yīng)1.5小時；②反應(yīng)完畢，降到室溫，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應(yīng)停止；③中間產(chǎn)物的純化采用固相萃取技術(shù)，得到經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR。材料為500mg 6mL C18BondElut cartridge(Varian，Walnut Creek，CA)，具體步驟如下活化用4mL甲醇活化，并用6mL高純水調(diào)整，分為2-3次使用；上樣將水樣以5-10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢后，用5％甲醇水溶液6mL淋洗以凈化樣品，分為3次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，以4mL甲醇(分為2次)將微囊藻毒素洗脫并收集。
(2)半抗原多肽與載體蛋白偶聯(lián)選擇牛血清白蛋白(BSA)作為載體蛋白，采用戊二醛法將步驟(1)獲得的經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR與載體蛋白進行偶聯(lián)，具體方法包括以下步驟(a)取10mg BSA(1.5×10-7摩爾)，完全溶解于5mL 0.01mol/L PBS(Na2HPO4·12H2O 2.96g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g加水至1000mL，pH7.2)中，再加入4mg步驟(1)獲得的經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR(4×10-6摩爾)，使其完全溶解；(b)緩慢加入5mL 0.2％的戊二醛溶液，與步驟(a)獲得的溶液混合，并在室溫下，攪拌反應(yīng)2小時；(c)加入0.2mL 1M甘氨酸，在室溫下攪拌1小時，以終止反應(yīng)；(d)將步驟(c)獲得的溶液用Sephadex G-25凝膠層析柱(Pharmacia)進行過濾層析，得到微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA。MALDI-TOF/MS檢測，結(jié)果表明該完全抗原的偶聯(lián)比為5.12，符合要求。將純化的完全抗原經(jīng)-40℃冷凍后，真空濃縮干燥，保存于-20℃冰箱中。
2、免疫動物選取6周齡的雌性Balb/c小鼠，采用低劑量長程免疫法進行免疫，方法為皮下多點注射，30μg MC-LR-BSA/只，共免疫4次，初次免疫加福氏完全佐劑(0.1mL/只)，后三次加強免疫加福氏不完全佐劑(0.1mL/只)，免疫間隔時間為30天。在第三次加強免疫后的第10天，對小鼠進行尾部靜脈取血，用間接ELISA法測定效價，其中，包被的MC-LR-BSA的濃度為5μg/mL。對抗血清效價達到1×105以上的小鼠，進行一次沖擊免疫，即每只小鼠采用10μl MC-LR-BSA+90μl生理鹽水進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行細胞融合。
3、細胞融合1)免疫脾細胞的制備將步驟2沖擊免疫三天后的BALB/c小鼠處死，無菌狀態(tài)下取出脾臟，去表面包膜及脂肪，剪碎，置于平皿中研磨，加GKN溶液(NaCl8g，KCl0.4g，Na2HPO4·2H2O1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000mL水中)制成單細胞懸液，用200目銅網(wǎng)過濾，去除大的細胞團塊后，離心，用GKN溶液洗滌并重懸脾細胞，計活細胞數(shù)，約為1×108個/mL。
2)SP2/0骨髓瘤細胞的處理取指數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細胞，離心，用GKN溶液洗一次并懸浮于其中，計活細胞數(shù)，為1×108個/mL。
3)免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合將步驟2)的SP2/0骨髓瘤細胞與步驟1)的免疫脾細胞融合，具體過程包括以下步驟1.聚乙二醇(PEG)的配制(50％PEG)PEG(MW1500，Roche，11423800)10.0g置于30mL容量小燒瓶中，高壓3.6×105Pa 15min，冷卻至50℃后加入完全培養(yǎng)基(IMDM培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036))10.0mL，混勻，分裝1.0mL/管，4℃保存。
2.取HAT培養(yǎng)液40mL(50×HAT儲液，Sigma，H0262，Lot 093K8931)，完全培養(yǎng)液(IMDM培養(yǎng)基)15mL和50％PEG分別放入37℃水浴箱中預(yù)熱，另將一只盛水的燒杯同時放入水浴箱中備用。
3.分別吸取含7.0×107個骨髓瘤細胞SP2/0和7.0×108個脾細胞的懸液加入50mL離心管中，充分混勻，并加IMDM培養(yǎng)基至40mL。
4.1200rpm離心8min，棄去上清液，用吸管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。輕輕彈擊離心管底，使兩種細胞充分混勻，直至成糊狀。
5.將離心管置于預(yù)溫的燒杯中，用1mL已用7.5％NaHCO3調(diào)整pH值至8.0(7.8-8.2均可)的PEG0.8mL，將吸管插入管底，繼而輕輕攪動沉淀，并緩緩滴加PEG，1min內(nèi)加完，再在水浴中靜置90s。
6.立即滴加37℃預(yù)溫的完全培養(yǎng)液(IMDM培養(yǎng)基)15mL，使PEG稀釋而失去作用。滴加的方法是在30s內(nèi)加1mL，次30s加3mL，接下來1min加完。注意，當PEG溶液加入后，即可見細胞凝集成小團塊狀，此時操作宜輕柔，以免干擾細胞融合過程。
7.補加完全培養(yǎng)液(IMDM培養(yǎng)基)至40mL，1000rpm離心10min，棄上清。
8.將細胞沉淀輕懸于預(yù)溫的HAT培養(yǎng)液40mL中，加到4塊已有飼養(yǎng)細胞層(小鼠腹腔巨噬細胞)的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。繼而將培養(yǎng)板移至37℃、5％CO2飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)。
4、融合細胞的篩選及克隆化培養(yǎng)約3天后，當雜交瘤細胞長滿孔底1/4-1/2時，培養(yǎng)基變黃，此時用常用的ELISA法檢測培養(yǎng)基上清液中的抗體，具體方法包括以下步驟1.吸取96孔板每孔的一半上清，采用ELISA法進行陽性雜交瘤細胞篩選(一篩)，具體方法為用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)稀釋包被抗原至2mg/L，加入到96孔酶聯(lián)板中進行包被，每孔100μl，4℃包被12-24小時，無需封閉；每孔加入各個克隆孔上清液100μL，37℃溫育1h，充分洗滌后加入100μL 1∶10000的酶標二抗(HRP-羊抗鼠IgG)，37℃溫育1h后，加入底物顯色，10min后終止，讀取A450nm，A450nm值為陰性對照2.1倍的為陽性雜交瘤細胞。對于一篩呈陽性的克隆株，進一步培養(yǎng)后，按照同樣方法進行第二次篩選。
其中，包被抗原為MC-LR-OVA，它按照下述方法制備取3mL OVA，加入0.3mg上述氨基修飾后的MC-LR，加入0.1mL 1.25％戊二醛充分混合，室溫反應(yīng)24h。
2.吸取檢測結(jié)果呈陽性的孔中的剩余上清，加入新鮮HT培養(yǎng)基(50×HT儲液(Sigma H0137，Lot 064K8927))做進一步培養(yǎng)；3.第二天用與步驟1相同的ELISA法復(fù)測第一次呈陽性的上清及吸取的剩余上清(二篩)；4.將2次ELISA檢測均為陽性的克隆細胞吸出，轉(zhuǎn)移至含BALB/c小鼠腹腔細胞的HT培養(yǎng)基制成的24孔(每孔0.9mL HT培養(yǎng)基)營養(yǎng)板的3-4個孔內(nèi)，進行再克隆。然后吸取上清，采用與步驟1相同的ELISA法對陽性克隆株進行再次確定(三篩)。
對于三篩后的陽性克隆株，采用MC-LR單體、BSA及OVA再進行一次篩選，包被濃度分別為5μg/mL，2μg/mL及2μg/mL，4℃包被過夜，其它條件同上。選取對OVA及BSA均為陰性、對MC-LR檢測結(jié)果為陽性的克隆株。結(jié)果得到4株陽性克隆株。將其中一株陽性克隆株，名稱為MC8C10，于2007年06月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，保藏編號為CGMCC No.2101。
二、單克隆抗體MC8C10的獲得及亞型鑒定1、獲取抗體腹水選取10周齡BALB/C小鼠，接種細胞前7-10天，預(yù)先腹腔注射液體石蠟0.5mL/只。用生理鹽水調(diào)整雜交瘤細胞株MC8C10 CGMCC No.2101濃度至2×106個/mL，腹腔接種雜交瘤細胞，接種細胞數(shù)為1×106個/只，7-10天后采集腹水。
2、腹水的純化采用HiTrap rProtein A FF 1mL免疫親和層析柱(Bio-Science AB，Sweden.LotNo.309591)來純化步驟1獲得的小鼠單克隆抗體腹水，得到MC8C10。該層析柱所含的1mL介質(zhì)最多能結(jié)合23mg由小鼠產(chǎn)生的IgG2b型單克隆抗體，并且對于IgG2b型抗體的結(jié)合能力是最高的，而對于小鼠產(chǎn)生的其它抗體亞類(如IgG1、IgG2a、IgG3等)的結(jié)合能力較弱。偶聯(lián)緩沖液為0.2mol/L、pH 7的磷酸鹽緩沖液(將NaH2PO4·2H2O1.216g，Na2HPO4·12H2O 4.369g溶解于100mL雙蒸水中)。洗脫緩沖液采用0.1M檸檬酸鈉溶液(pH3.5)。結(jié)果得到3mg固態(tài)的MC8C10。將純化的抗體分裝，-20C保存。
3、抗體亞型鑒定采用單克隆抗體亞型檢測試盒(ImmunoTypeTM Kit，Sigma)對步驟2獲得的抗體進行免疫球蛋白亞型的鑒定，具體方法為用PBS以1∶1000比例稀釋各類抗體(小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM)，然后用稀釋抗體包被96孔酶聯(lián)板(每孔0.1mL，每類抗體兩個孔)，37℃溫育1小時后，棄包被液，洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入步驟2純化的抗體，室溫溫育1小時后洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(購自邦定生物公司)，室溫溫育30分鐘后，洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過氧化物酶底物反應(yīng)液(1mg/mL TMB)，室溫10-15分鐘，出現(xiàn)褐色即為陽性結(jié)果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。結(jié)果表明雜交瘤細胞MC8C10分泌的抗體為IgG2b亞類。
這里配制緩沖液均使用雙蒸水，化學(xué)試劑純度為分析純或更高。最后配制的緩沖液采用0.45μm的濾器過濾。
實施例2、抗微囊藻毒素-LR的多克隆抗體的制備及其鑒定1、抗微囊藻毒素-LR的多克隆抗體的制備體重1.5-2kg臨床健康的雄性新西蘭大白兔，用實施例1制備的微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA按1.2mg免疫原/只的劑量，免疫途徑選用背部6點皮下注射。首次免疫采用弗氏完全佐劑，此后每間隔四周用含弗氏不完全佐劑的免疫原加強免疫，前后共四次，最后一次免疫后10天，宰殺、采血、分離血清后冷藏備用。
實施例3、微囊藻毒素-LR競爭ELISA試劑盒1、微囊藻毒素-LR競爭ELISA試劑盒的組成該試劑盒包括安裝在試劑盒盒體內(nèi)的下述試劑和酶標板a)抗微囊藻毒素-LR標準溶液的配制采用Alexis公司(Lausen，Switzerland)購買的MC-LR作為標準品(產(chǎn)品編號ALX-350-012)，采用高純水分別配制成MC-LR標準溶液，濃度分別為0.5μg/L、2μg/L和8μg/L，分別灌裝入MC-LR標準品試劑瓶中。
b)抗體溶液配制將實施例1的單克隆抗體MC8C10(1mg固體)用磷酸鹽緩沖液稀釋成工作濃度1∶6000，再加入1％(質(zhì)量百分含量)的牛血清白蛋白(BSA)和0.1％的硫柳汞(質(zhì)量百分含量)，灌裝入試劑瓶中。
c)酶標二抗溶液配制辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgG原液，灌裝入試劑瓶中，使用時用洗滌液按1∶10000配制成工作濃度。
d)洗滌液配制(10×PBST)含0.5％(體積百分含量)吐溫-20和80g/L氯化鈉的0.1mol/L pH＝7.5磷酸鹽緩沖液，灌裝入試劑瓶中。使用時，將該溶液用純水稀釋10倍再用。
e)底物溶液配制使用0.1mol/L pH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液，每1ml緩沖液中加入50μL 0.1％的H2O2溶液，灌裝入試劑瓶中。
f)顯色劑溶液配制用丙酮配制成10mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，用0.1mol/LpH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0.2mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，灌裝入試劑瓶中。
g)終止液配制2mol/L H2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
h)酶標板是包被了包被抗原的96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板。
酶標板的包被包被抗原采用實施例1的MC-LR-BSA，包被濃度0.25μg/mL，取120μL包被抗原加入反應(yīng)板孔中，4℃冰箱中過夜，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液1×PBST洗滌3-5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在已包被抗原的酶標板小孔中加入150μL 1％(質(zhì)量百分含量)的BSA封閉，37℃溫育1h，用洗滌液1×PBST洗滌3-5次，用吸水紙吸干，真空封裝。
2、MC-LR競爭ELISA試劑盒標準曲線的獲得及分析(1)微囊藻毒素競爭ELISA試劑盒標準曲線的獲得針對每一批試劑盒都必須測定其檢測微囊藻毒素的標準曲線，以確定和評價試劑盒的各項性能參數(shù)。
溶液的配制同實施例1，不同的是MC-LR標準溶液的濃度，在標準曲線中MC-LR標準溶液的濃度梯度如下(單位μg/L)1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0.219、0.0656、0.020、0.006、0。采用12組平行試驗(n＝12)。
將標準溶液與抗體溶液同時加入酶標板小孔中，同時設(shè)置空白孔(將添加的抗體換成高純水，其它一致)和陰性對照孔(標準溶液用高純水代替，即不含MC-LR，其它一致)，37℃溫育0.5h，倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)用洗滌液(10×PBST)洗滌2-5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打；加入酶標二抗溶液于酶標板小孔中，37℃溫育0.5h，用洗滌液重復(fù)洗3-5次，吸干；加入底物溶液和顯色溶液到酶標板小孔中，室溫下反應(yīng)10-15min，用酶標儀在波長450m處測定吸光度A，以不加抗體的小孔作為空白調(diào)零。以各濃度的吸光度A為縱坐標，以對應(yīng)MC-LR濃度的log10值為橫坐標，繪制半對數(shù)標準曲線圖。結(jié)果如圖1所示，表明標準曲線具有完整的反S形狀，并具有上平臺和下平臺，標準曲線的平行測定次數(shù)12次，誤差線為n＝12次平行實驗的標準偏差，實驗重復(fù)性良好，相對標準偏差(變異系數(shù))均在15％以內(nèi)，表明精密度良好。
對試劑盒半抑制濃度、檢測限、定量檢測區(qū)間等描述，基于對圖1的標準曲線進行模型擬合后進一步評價。采用4參數(shù)Logistic模型作為水環(huán)境樣品ELISA檢測試劑盒數(shù)據(jù)分析和評價的基礎(chǔ)，模型如下A=A2+A1-A21+(xx0)p]]>(4參數(shù)Logistic模型)其中x未標記抗原濃度(質(zhì)量濃度或物質(zhì)的量濃度)，自變量；
Ax對應(yīng)的吸光度(Absorbance)，因變量；A1上端漸近線(x＝0)，常數(shù)；A2下端漸近線(x→∞)，常數(shù)；p與曲線的斜率有關(guān)，常數(shù)；x0曲線的中點，或稱拐點，常數(shù)；對于圖1的標準曲線，0.453，A2為0.029，p為0.78，x0為1.8。
(3)半抑制濃度IC50是競爭ELISA一個很重要的評價指標。在競爭ELISA中，IC50≡x0。
(4)在競爭ELISA中，依據(jù)上述Logistic模型，定義結(jié)合率Y如下式。
Y=A-A2A1-A2×100%]]>(5)競爭ELISA標準曲線最低檢測限和最高檢測限的確定采用結(jié)合率法，即最低和最高檢測限分別為Y＝90％和Y＝10％時對應(yīng)的目標物質(zhì)(待測物)的濃度。
(6)競爭ELISA標準曲線的定量檢測區(qū)間的確定采用結(jié)合率法，定量檢測區(qū)間即Y＝80％-20％對應(yīng)的目標物質(zhì)(待測物)的濃度區(qū)間。
進一步對圖1中的標準曲線采用四參數(shù)的Logistic模型擬合，分析結(jié)果表明該間接競爭ELISA試劑盒半抑制濃度IC50＝1.8±0.1μg/L；該間接競爭ELISA試劑盒對MC-LR的最低檢測限為0.10μg/L；對MC-LR進行檢測的定量檢測區(qū)間為0.30μg/L-10.00μg/L。
3、采用本發(fā)明的試劑盒對某地幾處富營養(yǎng)化水體中的MC-LR進行檢測對富營養(yǎng)化水體中的MC-LR檢測方法同步驟2。
樣品1-6由于濁度較高，采用普通濾紙對水樣過濾后用本試劑盒進行測定，得到原水樣測定結(jié)果，每個樣品平行測定5次，計算變異系數(shù)，用變異系數(shù)確認本試劑盒的穩(wěn)定性；對水樣添加3μg/L MC-LR標準品后用本試劑盒進行測定，得到加標準品后測定結(jié)果，并測定回收率，用回收率確認本試劑盒的準確度。其中，回收率測定方法如下樣品添加濃度(最終濃度)用X表示，未添加標準品的樣品測定平均值為x1，添加了標準品的樣品測定平均值為x2，每個樣品平行測定3次，則回收率計算如下式。
結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明上述樣品檢測結(jié)果的變異系數(shù)都在15％以內(nèi)，精密度良好；檢測結(jié)果的回收率為(100.3±5.9)％，準確度良好。因此本發(fā)明的微囊藻毒素免疫檢測試劑盒可以滿足實際水樣檢測的需要。
表1、典型地表水體MC-LR的ELISA測定結(jié)果

。
權(quán)利要求
1.微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括包被抗原、微囊藻毒素-LR多克隆抗體或單克隆抗體以及酶標二抗；所述包被抗原為完全抗原A；所述完全抗原A按照如下方法制備在微囊藻毒素-LR的第七位氨基酸殘基N-甲基脫氫丙氨酸上引入一個氨基，得到經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR；再將該經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR與載體蛋白偶聯(lián)得到所述微囊藻毒素-LR與載體蛋白的偶聯(lián)物，即完全抗原A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述微囊藻毒素-LR多克隆抗體或單克隆抗體是以所述完全抗原A為免疫原得到的抗體；所述微囊藻毒素-LR單克隆抗體按照下述方法制備用所述完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞株；培養(yǎng)所述陽性雜交瘤細胞株或?qū)⑺鲫栃噪s交瘤細胞株注入同系小鼠腹腔誘生腹水，得到微囊藻毒素-LR的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白；所述偶聯(lián)方法為戊二醛法。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述用于免疫的小鼠為Balb/c小鼠；免疫方法為每只小鼠每次免疫所用的所述完全抗原劑A量為15-40μg，兩次免疫的間隔時間為20-40天；免疫方式為皮下多點注射；所述步驟2)中的小鼠骨髓瘤細胞為小鼠骨髓瘤細胞SP2/0。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述篩選陽性雜交瘤細胞株的方法為先用包被抗原篩選，再用微囊藻毒素-LR單體篩選至少1次；所述包被抗原為將所述步驟1)中的經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR多肽與載體蛋白偶聯(lián)得到的完全抗原B；所述完全抗原B與所述完全抗原A中的載體蛋白不相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述完全抗原B中的載體蛋白為卵清白蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述陽性雜交瘤細胞株為能分泌抗Microcystin-LR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10，其保藏號為CGMCCNo.2101。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述微囊藻毒素-LR單克隆抗體為由保藏號為CGMCC No.2101的能分泌抗Microcystin-LR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10產(chǎn)生的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一所述的試劑盒，其特征在于所述還包括微囊藻毒素-LR標準品溶液、顯色劑、終止液、洗滌液和底物溶液。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述的試劑盒在微囊藻毒素-LR檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。該微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括包被抗原、微囊藻毒素－LR多克隆抗體或單克隆抗體以及酶標二抗；所述包被抗原為完全抗原A；所述完全抗原A按照如下方法制備在微囊藻毒素－LR的第七位氨基酸殘基N－甲基脫氫丙氨酸上引入一個氨基，得到經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素－LR；再將該經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素－LR與載體蛋白偶聯(lián)得到所述微囊藻毒素－LR與載體蛋白的偶聯(lián)物，即完全抗原A。本發(fā)明的微囊藻毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測范圍在0.10μg/L－30.00μg/L之間，定量檢測區(qū)間在0.30μg/L－10.00μg/L之間，平均回收率(100.3±5.9)％，批內(nèi)誤差小于15％，準確度和精密度符合要求，能進行環(huán)境樣品中微囊藻毒素－LR的大規(guī)模快速篩查和預(yù)警監(jiān)測。
文檔編號C12N5/12GK101093225SQ20071011921
公開日2007年12月26日 申請日期2007年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月18日
發(fā)明者何苗, 盛建武, 施漢昌 申請人:清華大學(xué)