專利名稱：從哺乳動物凝固血中提取基因組dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物基因組DNA的提取方法，特別是涉及一種從哺乳動物凝固血中提 取基因組DNA的方法。
技術背景基因組咖A的提取是哺乳功能基因組學研究中困擾人們的一個難題。 一般而言， DNA可以從各種樣品材料中獲得，包括抗凝血，凝固血，裂解血，軟層細胞，毛囊， 奶，精液等，如考慮下游試驗，抗凝血是獲得高質量DNA的最好材料，也是提取DNA最 易處理的材料。而且考慮到動物福利和收集大量樣本的原因，凝固血是最容易獲得的 材料。拿奶牛為例，每年所有的奶牛個體都要采取非抗凝血以獲得血清進行例行的血 清學和病毒檢驗檢疫，在取得了血清后凝固的血塊通常被丟棄。當需要檢測大樣本時， 比如QTLs定位和關聯(lián)分析，傳統(tǒng)的蛋白酶K消化和酚/仿抽提法步驟繁瑣且消耗時間 長。目前，從哺乳動物凝固血中提取DNA的幾種簡單方法已有報道(SalazarL.A.,Hirata M. H., Cavalli S. A., et al. Optimized Procedure for DNA Isolation from Fresh and Cryopreserved Clotted Human Blood Usefol in Clinical Molecular Testing. Clinical Chemistry, 1998， 44:1748-1750. Kanai N, Fujii T， Saito K， Yokoyama T. Rapid and Simple Method For Preparation of Genomic DNA from Easily Obtainable Clotted Blood. J Clinical Pathology, 1994， 47:1043-1044. Garg U.C.， Hanson N.Q., Tsai M.Y， et al. Simple and Rapid Method for Extraction of DNA from Fresh and Cryopreserved Clotted Human Blood. Clinical Chemistry 1996, 42:647-648. Siafakas N., Burnett L., Bennetts B. and Proos A.Clinical Chemistry, 1995,41:1045-1046)，但是這些方法需要用到對人體有害的有機溶劑，如酚和氯仿。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種快速，經濟和安全的從哺乳動物凝固血中提取基因組 DNA的方法。本發(fā)明提供的一種從哺乳動物凝固血中提取基因組DNA的方法，包括以下步驟-1)將剪碎的哺乳動物凝固血用雙蒸水清洗去除血紅素，再將其與裂解液按體積 比為3—5: 5混合，向混合液中加入蛋白酶K至終濃度為360-400mg/mL混合液，然后
將混合液在55-65'C下水浴3-6小時至溶液中不再有粘稠的團塊；所述裂解液由NaCl、 Na2-EDTA和SDS組成，它們的濃度依次為140-160mM、 40-60mM和l-2克/100毫升裂解液；2) 將步驟l)獲得的混合液與5.5 —6.5 M NaCl溶液和氯仿按體積比為l: 0. 5 — 0.9: 1.5 — 1.9混合后，振蕩，再離心，留上清；3) 將上清液與體積/體積百分濃度為90-100%的冰乙醇按體積比1: 0.8 — 1.2 混勻，得到的白色沉淀為基因組DNA。在上述從凝固血中提取基因組DNA的方法中，血凝塊的大小會影響消化的效率， 凝塊越小越能縮短消化的時間，因此，步驟l)中最好將血凝塊剪碎成比較小的微粒； 此外，在剪切不同個體的凝血樣本時，應將剪刀先后用濃度為70% (V/V)的乙醇和 濃度為0.9% (W/V)的NaCl溶液洗滌至少3次，以避免交叉污染。所述剪碎的凝固血 與裂解液的體積比優(yōu)選為4: 5;加入蛋白酶K的終濃度為380 mg/mL混合液。步驟l)中裂解液的配方優(yōu)選為150mMNaCl， 50mM Na2-EDTA和2X SDS;蛋白酶 K的終濃度優(yōu)選為380mg/mL;水浴溫度優(yōu)選為55t:，此外，水浴期間(特別是前半個 小時)還需振蕩，以避免血凝塊在離心管底部沉積。步驟2)中所述NaCl溶液的濃度優(yōu)選為6M，混合液、NaCl溶液和氯仿的體積比優(yōu) 選為l: 0.7: 1.7;振蕩時間可為10-30s;離心條件可為在10000-14000rpm下離心 5-15min (優(yōu)選為12000rpm離心10min)。步驟3)中冰乙醇的體積/體積百分濃度優(yōu)選為90%;上清液與冰乙醇的體積比優(yōu) 選為l: 1。此外，為獲得純度更高的基因組DNA，步驟4)中可將得到的基因組DNA用體積/體 積百分濃度為70%的乙醇進行洗滌。上述從凝固血中提取基因組DNA的方法對牛、豬和羊等任一哺乳動物均適用。 本發(fā)明所提供的從哺乳動物凝固血中提取基因組DNA的方法簡便(簡化了脫蛋白 的過程)、快速、成本低，而且避免了使用酚這種強有毒有機試劑，獲得的基因組DNA 質量和濃度可靠，用其提取哺乳動物凝固血中的基因組DNA，不需要特殊的儀器，適 合常規(guī)實驗室的需要。特別是應用本發(fā)明的方法可以快速提取荷斯坦奶牛的基因組 DNA，可為進行奶牛功能基因組研究、產奶性狀基因定位和分子標記輔助選擇等研究 提供材料，也為促進我國種牛遺傳評定、優(yōu)良種畜遺傳物質推廣等技術構成的中國荷 斯坦奶牛良種繁育體系的發(fā)展提供了一個方便可行的技術手段，從而加快奶牛群體的 遺傳進展。本發(fā)明將在哺乳動物基因組DNA的提取及奶?；蚱渌蠓N的功能基因組研究中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為從荷斯坦奶牛凝固血中提取的基因組D醫(yī)的0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖2為以本發(fā)明方法提取的基因組DNA為模板PCR擴增的牛SPP1基因(外顯子)的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，圖3為以本發(fā)明方法提取的基因組DNA為模板PCR擴增的IBSP基因(外顯子)的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。 實施例1、從荷斯坦奶牛凝固血中提取基因組DNA及其純度檢測 裂解液的配方為150mM NaCl， 50mM Na廠EDTA和2. 0% (g/100mL裂解液)SDS。 用本發(fā)明的方法從荷斯坦奶牛的凝固血中提取基因組DNA，具體包括以下步驟-1) 取400^1荷斯坦奶牛凍融血樣置于Eppendorf離心管中，然后用眼科手術剪 將哺乳動物的血凝塊剪碎至細小微粒；在剪切不同個體的凝血樣本時，將剪刀先后用 體積/體積百分濃度為70%的乙醇和質量/體積百分濃度為0. 9%的NaCl溶液洗滌4次。2) 裂解細胞將破碎的凝固血先用雙蒸水清洗除去血紅素，再將破碎的凝固血 與400u l裂解液混合，向混合液中加入lOy l蛋白酶K至終濃度為360mg/mL混合液， 然后將混合液在55'C (55-65。C均可)下水浴3小時(3-16小時均可)至溶液中不再有 粘稠的團塊，水浴期間要劇烈振蕩以避免血凝塊在管底沉集，特別是前半個小時。3) 抽提將步驟2)獲得的混合液與250iU飽和NaCl溶液和900ul氯仿混合， 劇烈振蕩15秒，12，000rpm離心10min，留上清；4) 沉淀DNA:將上清液轉移至新的2raL離心管中，與等體積的90% (V/V)冰乙 醇混勻，反復顛倒離心管數次至DNA聚集成團，白色沉淀即為基因組DNA。小心倒去 廢液，將DNA用預冷的70X (V/V)乙醇進行清洗，然后用新的塑料吸液管將DNA挑 出來，置于新的1.5mL離心管中，為確保無乙醇遺留，在室溫下放置IO分種(晾干)， 最后用200u 1 TE(pH 8. 0、 10mM Tris-Cl， lmM EDTA)(雙蒸水也可)溶解，4。C保存 待用。DNA濃度用分光光度計測260nm時的光密度吸收值；DNA純度用OD"OD，的比值度 量；將DNA進行添加有EB的瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下檢測DNA的完整性。用分光光 度計測260nm和280nm時的光密度吸收值，計算OD卿/OD，比值，并經O. 7%瓊脂糖凝膠 電泳檢測DNA的完整性。結果DNA濃度為41. 5Pg/mL， 0026。/0028。比值為1. 58， 0. 7%瓊脂
糖凝膠電泳檢測結果如圖l所示(泳道1-9為提取的基因組DNA，泳道M為DNAMarker)， 表明用上述方法從凝固血中提取到了純度較高且完整的基因組DNA。為檢測上述從凝固血中提取的DNA是否能夠用于PCR反應，以上述方法提取的基因 組DNA為模板，在引物P1 (上游引物)5， -tattgtctcccaccctgctt-3，和P2 (下游 引物):5， -cacagaggaggacttcaca-3，的引導下PCR擴增牛SPP1基因(外顯子)，并在 引物P3 (上游引物):5， -gagattacacctggaactgga-3，禾口P4 (下游引物):5， -actggtggctgtagtaatcttg-3，的引導下PCR擴增IBSP基因(內含子)，PCR反應體系為 10xbuffer 1. 5W， dNTPs(濃度為10mM) 1.2|4，上下游引物(濃度為10pM)各O. 15W， DNA 聚合酶0.2W，用雙蒸水補至15W， PCR反應條件為:94°C 5分鐘，(94。C 30秒，56/58 °C 30秒，72°C 30秒)30個循環(huán)，72°C 5分種。PCR擴增的牛SPP1基因的2X瓊脂糖凝 膠電泳檢測結果如圖2所示(泳道1-3為PC財廣增的牛SPP1基因，泳道CK為陰性對照， 泳道M為DNA Marker)，經擴增獲得了1200bp的DNA片段，與預期結果一致。PCR擴增 的IBSP基因的2X瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3所示(泳道1-5為PC財廣增的IBSP基 因，泳道M為DNA Marker)，經擴增獲得了382bp的DNA片段，與預期結果一致。上述 檢測結果表明用本發(fā)明方法從凝固血中提取的基因組DNA的質量可靠，完全可用于PCR 反應。
權利要求
1、一種從哺乳動物凝固血中提取基因組DNA的方法，包括以下步驟1)將剪碎的哺乳動物凝固血用雙蒸水清洗去除血紅素，再將其與裂解液按體積比為3-5∶5混合，向混合液中加入蛋白酶K至終濃度為360-400mg/mL混合液，然后將混合液在55-65℃下水浴3-6小時至溶液中不再有粘稠的團塊；所述裂解液由NaCl、Na2-EDTA和SDS組成，它們的濃度依次為140-160mM、40-60mM和1-2克/100毫升裂解液；2)將步驟1)獲得的混合液與5.5-6.5M NaCl溶液和氯仿按體積比為1∶0.5-0.9∶1.5-1.9混合后，振蕩，再離心，留上清；3)將上清液與體積/體積百分濃度為90-100％的冰乙醇按體積比1∶0.8-1.2混勻，得到的白色沉淀為基因組DNA。
2、 根據權利要求l所述的方法，其特征在于所述剪碎的凝固血與裂解液的體積 比為4: 5;加入蛋白酶K的終濃度為380 mg/mL混合液。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟l)中所述裂解液中NaCl、 Na廠EDTA和SDS的濃度依次為150mM、 50raM和2克/100毫升裂解液。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟l)中所述的水浴溫度為55 °C，水浴時間為3小時；水浴期間要進行振蕩。
5、 根據權利要求l所述的方法，其特征在于步驟2)中所述NaCl溶液的濃度為 6M，混合液、NaCl溶液和氯仿的體積比為l: 0.7: 1.7;振蕩時間為10-30s;離心條 件為在10000-14000rpm下離心5-15min。
6、 根據權利要求l所述的方法，其特征在于步驟3)中所述冰乙醇的體積/體積百分濃度為90%;上清液與冰乙醇的體積比為l: 1。
7、 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于步驟3)中所述得到的基 因組DNA還要用體積/體積百分濃度為70X的冷乙醇進行洗滌。
8、 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于所述凝固血來源于牛、豬或羊。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從哺乳動物凝固血中提取基因組DNA的方法，該方法包括以下步驟1)將剪碎的哺乳動物凝固血用雙蒸水清洗去除血紅素，再將其與裂解液按體積比為3-5∶5混合，向混合液中加入蛋白酶K至終濃度為360-400mg/mL混合液，然后將混合液在55-65℃下水浴3-6小時至溶液中不再有粘稠的團塊；2)將步驟1)獲得的混合液與5.5-6.5M NaCl溶液和氯仿按體積比為1∶0.5-0.9∶1.5-1.9混合后，振蕩，再離心，留上清；3)將上清液與體積/體積百分濃度為90-100％的冰乙醇按體積比1∶0.8-1.2混勻，得到的白色沉淀為基因組DNA。本發(fā)明將在哺乳動物基因組DNA的提取及奶?；蚱渌蠓N的功能基因組研究中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12P19/00GK101153309SQ20071012167
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月12日 優(yōu)先權日2007年9月12日
發(fā)明者銳 劉, 孫東曉, 劍 張, 毅 張, 沅 張 申請人:中國農業(yè)大學