專利名稱：：一種檢測牛cvm攜帶者的特異性擴增引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種檢測牛CVM攜帶者的特異性擴增引物。
背景技術(shù)：
：荷斯坦奶牛育種過程中，通過人工授精技術(shù)，優(yōu)秀種公牛的精液被廣泛應用。這種育種方式大大提高了我國荷斯坦奶牛的數(shù)量和牛奶總產(chǎn)量，但同時也存在很大的風險，一旦種公牛攜帶致死性隱性遺傳病致病基因，它的后代中就會有廣泛的攜帶者，將對奶業(yè)的健康發(fā)展造成很大的負面影響。脊柱畸形綜合征(complexvertebralmalformation,CVM),是荷斯坦奶牛的一種常染色體致死性隱性遺傳病，只有純合子個體才表現(xiàn)病征，而雜合子(攜帶者)表現(xiàn)正常。依據(jù)孟德爾理論，致病基因攜帶者的后代有二分之一是攜帶者，而兩個攜帶者的后代有四分之一的可能性是致病基因純合子。荷斯坦種公牛中一旦存在脊柱畸形綜合征攜帶者，經(jīng)過對其精液若干年高強度的使用之后，牛群中攜帶者的比率就會達到一個很高的程度，將對奶業(yè)生產(chǎn)造成非常巨大的損失。脊柱畸形綜合征主要造成患病胎兒的早期流產(chǎn)和死胎等，只有極少數(shù)個體出生時還能夠存活(存活的個體出生后很快就會死亡)。Thomsen等研究發(fā)現(xiàn)牛第四號染色體上的"C5A3基因是CVM致病基因，并證明S丄C35A基因cDNA序列第559位上的核苷酸突變(G—T)是致病性突變。S丄C35A3基因編碼的蛋白能夠?qū)-乙酰葡糖胺從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到高爾基體內(nèi)，該突變導致對應蛋白180位的氨基酸由纈氨酸—苯丙氨酸，從而減少了進入高爾基體的N-乙酰葡糖胺，影響了高爾基體內(nèi)蛋白的糖基化過程。所以針對CVM致病突變進行檢測就能對該疾病進行診斷分析。目前針對脊柱畸形綜合征，國外已建立了3種檢測方法微衛(wèi)星標記法該方法通過檢測與S丄C5A3連鎖緊密的微衛(wèi)星標記(/MMOO，5MS279(9，/1^Sr幼29)，來鑒定目標個體是否攜帶致病基因。由于不同微衛(wèi)星擴增引物的退火溫度不同，需要進行兩次PCR反應才能完成對以上三對引物的擴增。同時由于該方法不是對突變位點的直接檢測，一旦染色體的致病區(qū)段發(fā)生重組，檢測結(jié)果就會出現(xiàn)假陽性。例如但在丹麥公布的這些患病犢牛的系譜資料中(包括33頭牛)，有一頭攜帶者和一頭患病犢牛在以上三個微衛(wèi)星標記處是完全相同的，這就很難通過該種方法準確的判定被檢測個體的基因型。等位基因特異性PCR法等位基因特異性PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)檢測法該方法直接對突變位點(兄C5A3基因的cDNA序列第559位上的核苷酸突變G—T)進行檢測。由于CVM致病基因和正常基因在突變?yōu)辄c堿基不同，分別以T和G作為上游引物的3'末端設(shè)計了T-spedficprimer和G-specificprimer,為了避免結(jié)果出現(xiàn)假陽性，釆用了BIOLASEDiamondDNAPolymerase。該方法是最直接的檢測方法，但BIOLASEDiamondDNAPolymerase的價格很昂貴，即使釆用國內(nèi)生產(chǎn)的高保真Taq酶作為替代酶，其價格也通常是普通Taq酶的二至三倍。同時T-specific的上游引物長達76個堿基，對應的下游引物23個堿基，退火溫度相差很大，因此只有在嚴格的反應條件下才能得到可靠的結(jié)果。丹麥學者對以上兩種方法申請了專利，專利保護的費用很昂貴，美國荷斯坦協(xié)會公布的測定費用是45美元(約355人民幣)，加拿大荷斯坦協(xié)會的費用為85加元(約588元人民幣)，不適合在我國進行大規(guī)模的檢測。聚合酶鏈式反應-引物誘導限制性分析法日本學者Kanae等發(fā)明了聚合酶鏈式反應-引物誘導限制性分析法(polymerasechainreaction-primerintroducedrestrictionanalysis,PCR-PIRA):將CVM突變位點的前一位堿基作為上游引物的3'末端,針對突變位點(G/T)調(diào)整引物堿基(從3'端向5'端的第4和第5個堿基)，通過錯配的方式在PCR產(chǎn)物中引入特異性的酶切位點將P對I的酶切位點引入到正常基因的產(chǎn)物中，將五coT221的酶切位點引入到CVM基因型中；對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，通過酶切結(jié)果將CVM攜帶者、患者以及基因型正常的個體區(qū)分開來。該方法不因酶及PCR儀的變化而受影響(PCR-PIRA法采用的DNA聚合酶必須能夠在引物與模板存在錯配的情況下發(fā)揮作用)，但PCR反應不能直接判定被測個體的基因型，需要通過酶切反應才能區(qū)分致病基因和正常基因，延長了操作的時間并提高了檢測成本；另外CVM攜帶者的PCR產(chǎn)物酶切后同時存在233bp(不能被酶切的片段)和212bp(酶切后的片段)兩個片段，這兩個片段的大小相差很小，同時國內(nèi)能買到的NEB公司生產(chǎn)的￡coT22I的同功酶iVW/的最高效率僅有50%,酶切后的片斷(212bp片段)的電泳條帶很淡，電泳差異結(jié)果不容易區(qū)分。因此，建立一種準確、快速、經(jīng)濟的檢測CVM有害基因的分子方法是非常必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測牛脊柱畸形綜合征(CVM)攜帶者的特異擴增引物。本發(fā)明針對荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征致病基因設(shè)計特異引物T(T-special),其序列如SEQIDNo.l&2所示。CVM突變位點T被設(shè)置為上游引物的3，末端，同時調(diào)整了3'端至5'端第5和第6兩個堿基，這兩個堿基的錯配增加了對CVM致病基因的特異擴增效果，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本發(fā)明的檢測體系中還含有內(nèi)標引物BS(bovinespecialprimer)，其序列如SEQIDNo.3&4所示。本發(fā)明采用雙引物PCR技術(shù)結(jié)合PCR錯配技術(shù)建立了檢測荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征的分子生物學方法，為評價荷斯坦種公牛的遺傳背景提供了有效的技術(shù)手段。釆用BS和T通過雙引物PCR技術(shù)對12頭可疑攜帶者進行檢測。針對4頭被鑒定為CVM攜帶者的個體和2頭檢測正常個體，通過測序引物ES(其序列如序列表5&6所示)進行擴增，擴增產(chǎn)物用于測序。測序結(jié)果與NCBI已公布的牛仏C35A第四外顯子的序列進行比對發(fā)現(xiàn)，2頭檢測正常個體的外顯子擴增序列與已公布的序列完全匹配；4頭檢測攜帶者的測序圖譜顯示，致病突變位點都是G和T的雜合峰，其它位點與公布序列完全匹配。測序結(jié)果證明本發(fā)明對CVM致病基因的檢測準確性是可以信賴的。進一步可以將本發(fā)明的引物制備成檢測試劑盒，其可以包括上述特異性擴增引物、內(nèi)標引物等。應用本發(fā)明引物建立的荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征攜帶者的檢測方法，包括樣品采集、基因組DNA制備、PCR擴增和凝膠電泳四個環(huán)節(jié)。針對樣品釆集，既可以釆集精液，又可以釆集血液和耳組織等組織樣，而且僅需微量組織樣便可以獲得適合PCR擴增的DNA。在基因組DNA制備這個環(huán)節(jié)，本發(fā)明采用了DTT裂解法，該環(huán)節(jié)僅需要一個小時，與傳統(tǒng)的酚仿抽提法相比，該方法操作簡單、成本低廉、所需時間短。PCR擴增是本發(fā)明的核心環(huán)節(jié)，本發(fā)明結(jié)合了雙引物PCR技術(shù)和錯配PCR技術(shù)，僅需要一次PCR反應就能判定被檢測個體是否攜帶致病基因。T引物擴增產(chǎn)物的大小為105bp，BS引物擴增產(chǎn)物大小為216bp，在檢測時具有擴增產(chǎn)物長度為105bp的牛DNA樣品所對應的牛為牛脊柱畸形綜合癥的攜帶者。由于BS和T的特異性擴增片斷都小于300bp，本發(fā)明同時參考了兩溫度梯度PCR技術(shù)，通過改變傳統(tǒng)PCR的技術(shù)參數(shù)，而實現(xiàn)50分鐘左右完成PCR擴增。此外，本發(fā)明所用的試劑都是國產(chǎn)試劑，檢測所需儀器也都為常規(guī)儀器。需要說明的是，本發(fā)明不是一種疾病的檢測方法。對于牛脊推畸形綜合征，也即是兄C3^43基因第四外顯子第73位上的堿基為T的純合時，會造成妊娠早期流產(chǎn)、死胎或犢牛出生后很快死亡，患畜最顯著的特征為脊推彎曲畸形、腿部對稱性的彎曲、體重較正常犢牛輕約20%、頸短等綜合癥狀，這些是顯著癥狀，不需要特別的檢測。而本發(fā)明的對象是表征正常的牛，通過檢測牛CVM有害基因，從而排除CVM的攜帶者，排除牛育種中的隱患。本發(fā)明提供了一種成本低廉、操作簡單、快速、準確并適合推廣的針對荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征攜帶者的檢測方法，對健全奶牛育種體系，剔出隱性缺陷基因，保持奶業(yè)的健康快速發(fā)展，有著重要意義。圖1為實施例1中的四個個體檢測結(jié)果，1、2、3、4為四個個體，每個個體做一個重復；CK為陰性對照；M為Marker由廣州東盛生物科技有限公司提供，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp;1、2、3、4的電泳條帶由下至上分別為引物二聚體、T特異性條帶(105bp沐BS的特異性條帶(216bp);圖2是實施例2擴增產(chǎn)物的檢測結(jié)果，1、2、3、4(同圖一中的1、2、3、4)為四個個體，每個個體做一個重復；CK為陰性對照；M為Marker由廣州東盛生物科技有限公司提供，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp;外顯子特異性條帶大小為192bp;圖3是實施例圖2的擴增產(chǎn)物對應的測序結(jié)果，1、2、3、4(同圖一、二中的1、2、3、4)為四個個體；測序圖中第四個峰為CVM致病突變位點，1、2和4在該位點為G和T的雙峰，3則僅有G的峰。具體實施方式下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。實施例l牛CVM攜帶者的檢測材料與方法1、樣品釆集筆者收集了733頭中國現(xiàn)役和退役荷斯坦種公牛的系譜資料，通過與國外已公布的CVM攜帶者種公牛的資料進行比對，查找到69頭可疑攜帶者，隨機釆集其中12頭種公牛的精液(3支/每頭)，液氮保存。2、基因組DNA的制備DTT裂解法制備DNA需要裂解液和中和液兩個部分，裂解液的成分包括KOH200mmol/L,DTT50mmol/L;中和液的成分包括Tris.HCl900mmol/L,PH=8.3，EDTAlmmol/L?；蚪MDNA的制備過程如下2.1取5^1精液/100pl抗凝血/少量剪碎的耳組織，置于1.5^1滅菌離心管中；2.2向上述離心管中加入1000plddH20,充分混勻，1，2000rpm離心2min,棄去上清；2.3向上述離心管中加入500^1裂解液，充分混勾，65°C10min;2.4向上述離心管中加入500^1中和液，充分混勻，1,2000rpm離心5min，取上清與另一離心管中，可用于PCR擴增或-20。C保存；3、PCR3.1引物序列的設(shè)計表一列出了本發(fā)明所涉及的引物，以及引物的序列、長度、退火溫度以及特異性擴增產(chǎn)物的長度。Tprimers為荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征(CVM)的特異性擴增引物；BSprimers為牛特異性內(nèi)標引物；ESprimers為測序引物。這些引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。表l本發(fā)明涉及的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根據(jù)GenBank上牛S丄C35A3基因序列(Bosms;AY160683)設(shè)計檢測CVM的特異引物，經(jīng)過篩選和優(yōu)化，最終確定如表l所示的T引物。本例中檢測時釆用雙引物發(fā)進行擴增，即釆用T為特異擴增引物，釆用BS為內(nèi)標引物進行擴增。3.2PCR反應體系本發(fā)明釆用20pl反應體系，由以下幾個部分組成ddH206.3^1dNTP(lmmol/L)3^110xPCRbuffer1，BS(2拜ol/L)1.4jilT(2拜ol/L)l牟Mg2+(20mmol/L)1.2|ilTaq(2.5U&L)O単DNA模版4^1本發(fā)明所用的dNTP、Taq酶和10xPCRbuffer都由廣州東盛生物科技有限公司提供。10xPCRbuffer的成分如下500mmol/LKC1,lOOmmol/LTris.Cl,15mmol/LMgCl2，0.1%白明膠；Taq酶存儲緩沖液的成分如下20mmol/LTris.Cl，lmmol/LDTT,0.1mmol/LEDTA，100mmol/LKCl，50%glycerol，0.5%NP40。采用DTT裂解法制備的DNA中各離子濃度如下lOOmmol/LKCl,450mmol/LTris.HCl，DTT25mol/L,0.5mol/LEDTA。最終PCR反應體系中各離子濃度為61.5mmol/LKCl,98mmol/LTris.HCl，2.3mmol/LMgCl2,5mmol/LDTT,0.1mmol/LEDTA。3.3PCR反應程序94°C4min;94°C2s，51。C2s，72。C2s,30個循環(huán)；72。C4min，降溫至4。C。4、結(jié)果與分析釆用2%瓊脂糖電泳，IIOV，15min，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析。結(jié)果表明，在12頭可疑攜帶者中發(fā)現(xiàn)4頭攜帶CVM致病基因的種公牛。圖1顯示的是三頭CVM致病基因攜帶者(1、2、4)和一頭基因型正常個體(3)的PCR產(chǎn)物電泳圖。實施例2檢測方法準確性的驗證本發(fā)明設(shè)計了針對脊柱畸形綜合征致病突變所在的外顯子擴增引物ES,通過測序來驗證本檢測方法的準確性。引物合成和測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。測序部分的PCR反應體系如下釆用20^1反應體系，由以下幾個部分組成:ddH207fxldNTP(lmmol/L)3^110xPCRbuffer1.5|ilES(2jxmol/L)2.5^1Mg2+(20mmol/L)1.2jilTaq(2.5，)0単DNA模版4^1PCR反應程序94。C4min;94°C2s，51。C2s，72。C2s，30個循環(huán)；72。C4min，降溫至4。C。2%瓊脂糖電泳，IIOV，15min，凝膠成像系統(tǒng)照相，擴增產(chǎn)物測序分析。對4頭被鑒定為CVM攜帶者的個體和2頭檢測正常個體，通過測序引物ES進行擴增，擴增產(chǎn)物用于測序并測序，結(jié)果與實施例l全部相一致。圖2所示為其中4頭種公牛(與圖一中4頭種公牛一致)S丄C35A3基因第四外顯子PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。圖3所示為其中三頭CVM致病基因攜帶者和一頭基因型正常個體的PCR產(chǎn)物的測序圖(與圖二和圖三中的4頭種公牛一致)。序歹U表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所<120>種檢測牛CVM攜帶者的特異性擴增引物<130〉<160>6<170〉Patentlnversion3.3<210><211><212><213><400>124醒人工序列1cacaatttgtaggtctcaatgcat24<210>2〈211〉24<212>DNA<213>人工序列<400>2tccacactgatggtttggtttctt24<210>3<211>20<212>DNA<213〉人工序列<400>3tgg33gc肌agaaccccgct20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>權(quán)利要求1、一種檢測牛脊柱畸形綜合癥的特異性擴增引物，其核苷酸序列為T-F5’-CACAATTTGTAGGTCTCAATGCAT-3’T-R5’-TCCACACTGATGGTTTGGTTTCTT-3’。2、如權(quán)利要求l所述的引物，其特征在于，以牛脊柱畸形綜合癥攜帶者的基因組DNA為模板擴增時，其擴增產(chǎn)物大小為105bp。3、含有權(quán)利要求1或2所述引物的檢測試劑盒。4、如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其還含有內(nèi)標引物。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的內(nèi)標引物的核苷酸序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6、如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于以牛基因組DNA為模板擴增時所述的內(nèi)標引物的擴增產(chǎn)物大小為216bp。7、一種檢測牛脊柱畸形綜合癥的攜帶者的方法，其釆用權(quán)利要求1所述的引物對牛DNA樣品進行PCR擴增，并檢測擴增產(chǎn)物。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于PCR擴增體系中還包括內(nèi)標引物，其核苷酸序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>9、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，具有擴增產(chǎn)物長度為105bp的牛DNA樣品所對應的牛為牛脊柱畸形綜合癥的攜帶者。10、如權(quán)利要求79任一項所述的方法，其特征在于，PCR反應程序為94。C4min;94°C2s，51°C2s,72°C2s，30個循環(huán);72°C4min,降溫至4。C。全文摘要本發(fā)明提供了一種荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征(CVM)攜帶者的檢測引物，該引物針對荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征致病基因，通過PCR錯配技術(shù)設(shè)計而成，其具有SEQIDNo.1&2所示核苷酸序列，通過該引物可以擴增出105bp的片段。本發(fā)明還設(shè)計了一對內(nèi)標引物，其具有SEQIDNo.3&4所示的核苷酸序列。通過上述引物對?；蚪M進行特異擴增，可以檢測荷斯坦奶牛CVM攜帶者。本發(fā)明提供了一種成本低廉、操作簡單、快速、準確并適合于推廣應用的針對荷斯坦奶牛脊柱畸形綜合征攜帶者的檢測方法，對健全奶牛育種體系，剔除隱性缺陷基因，保持奶業(yè)的健康快速發(fā)展，有著重要意義。文檔編號C12Q1/68GK101130822SQ200710121859公開日2008年2月27日申請日期2007年9月17日優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日發(fā)明者朱化彬,杜衛(wèi)華,帥王,棟王,王宗禮,程金華,郝海生申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所