專利名稱：α-葡萄糖苷酶及其基因和制備方法以及載體和宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種a-葡萄糖苷酶及其編碼基因和制備方法，以及含有該 基因的重組載體和重組宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
a隱葡萄糖苷酶(a-glucosidase， EC 3.2丄20)是一種糖苷水解酶，水解01-1,4-葡萄糖苷鍵連接的非還原末端的末端葡萄糖單元，同時(shí)釋放D-葡萄糖，可以 用于將麥芽糖和麥芽糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖，還有一些a-葡萄糖苷酶也可以將蔗 糖水解為葡萄糖和果糖的混合物，因此a-葡萄糖苷酶在制糖工業(yè)具有重要應(yīng) 用價(jià)值，例如a-葡萄糖苷酶有助于淀粉的完全水解以獲得高產(chǎn)葡萄糖漿，也 可以用于水解普魯蘭酶產(chǎn)生的麥芽糖[Sun等，植物生理(Plant Physiol.) 94:320-327,1990;生物化學(xué)和生物物理進(jìn)展(Arch Biochem Biophys.) 284: 298-305， 1991]， 一些a-葡萄糖苷酶也能用于水解蔗糖產(chǎn)生果葡糖漿。另外, 為了適應(yīng)目前的工業(yè)生產(chǎn)工藝，所需的a-葡萄糖苷酶應(yīng)具有耐熱性和熱穩(wěn)定 性，最好具有60-7(TC或者更高的耐熱性。
a-葡萄糖苷酶己從不同來(lái)源的生物(包括動(dòng)物、植物和微生物)中分離， 如芽孢桿菌、梭孢菌、絲狀真菌、酵母、大麥等[Yamamoto等，碳水化合物 研究(Carbohydrate Research) 197: 227-235， 1990; Antranikian等，應(yīng)用環(huán)境 微生物(Appl Environm Microbiol) 53(7), 1987; Berthelot等，應(yīng)用環(huán)境微生物 (Appl Environm Microbiol) 2907-2911， 1999; O，Mahony等，生物技術(shù)通訊 (Biotechnology Letters) 9: 317-322, 1987]。其中多數(shù)a-葡萄糖苷酶不具有耐高 溫性和熱穩(wěn)定性，只有一些來(lái)自嗜熱菌的a-葡萄糖苷酶具有一定的耐高溫性
和熱穩(wěn)定性，如硫化葉菌^//0/0^>^0//^"士^的01-葡萄糖苷酶，能夠適
應(yīng)105'C的溫度環(huán)境，且在65-85t:下活性穩(wěn)定(美國(guó)專利US Patent 6506592)。然而，由于編碼該酶的基因啟動(dòng)子的密碼子偏好性不同于細(xì)菌， 而與真核生物相似，因而不能用T7強(qiáng)啟動(dòng)子在大腸桿菌五xo//中進(jìn)行高表 達(dá)，限制了該酶的表達(dá)量。另外，酶解蔗糖也是工業(yè)生產(chǎn)葡萄糖的一條途徑， 雖然上述硫化葉菌&//o/o6w so//aton'cm的a-葡萄糖苷酶也具有蔗糖水解功 能，但其酶活并不高，另外同樣由于其表達(dá)上的局限性限制了其在催化蔗糖 水解方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有的耐高溫a-葡萄糖苷酶難以高效表達(dá)的 缺點(diǎn)，并且克服現(xiàn)有a-葡萄糖苷酶的蔗糖水解功能較弱的缺點(diǎn)，提供一種耐 高溫并能利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)，且具有較強(qiáng)蔗糖水解功能的a-葡萄糖苷酶。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼該(x-葡萄糖苷酶的基因。 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有該基因的重組載體。 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供含有該重組載體的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述ot-葡萄糖苷酶的制備方法。 本發(fā)明提供了一種a-葡萄糖苷酶，該a-葡萄糖苷酶具有SEQID: NO. 2 所示的氨基酸序列，SEQID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 6所 示的氨基酸序列，SEQID: N0.8所示的氨基酸序列，SEQID: NO. IO所示 的氨基酸序列，或者對(duì)SEQID: NO. 2、 SEQID: NO. 4、 SEQID: NO. 6、 SEQ ID: NO. 8或SEQ ID: NO. 10所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸取代、缺失或添加而得到的a-葡萄糖苷酶活性不變的氨基酸序列。 本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明提供的a-葡萄糖苷酶的基因。 本發(fā)明提供了一種重組載體，該重組載體含有本發(fā)明提供的基因。
本發(fā)明提供了一種重組宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有本發(fā)明提供的重組載體。
本發(fā)明提供了一種(X-葡萄糖苷酶的制備方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明提 供的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明提供的a-葡萄糖苷酶能夠利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)，而且 具有耐高溫(最適溫度95'C)和熱穩(wěn)定性好(見(jiàn)圖2)的優(yōu)點(diǎn)，還具有較強(qiáng) 的蔗糖水解功能。
本發(fā)明涉及的重組宿主細(xì)胞為含有SEQID: NO.l的重組克隆載體轉(zhuǎn)化 菌株DH5a (pGEM-TGlu)，分類命名為大腸埃希氏菌，拉丁文學(xué)名為 Escherichia coli，于2007年5月17日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2052。


圖1:純化前和純化后的SEQ ID: NO. 2所示的a-葡萄糖苷酶的 SDS-PAGE電泳圖2 (a)和(b)分別為SEQID: NO. 2所示的oi-葡萄糖苷酶隨溫度和 pH變化的曲線圖，圖2 (c)表示熱穩(wěn)定性曲線圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的a-葡萄糖苷酶具有SEQID:NO. 2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 6所示的氨基酸序列，SEQID: N0.8所示的氨基酸序列，SEQID: NO. IO所示的氨基酸序列，或者對(duì)SEQ ID: NO. 2、 SEQID: NO. 4、 SEQID: NO. 6、 SEQID: NO. 8或SEQ ID:
NO. 10所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺失或添加而得到的 a-葡萄糖苷酶活性不變的氨基酸序列。 本發(fā)明提供的(x-葡萄糖苷酶的耐熱性高(60-97X:具有較高活性，最適 溫度95。C)，熱穩(wěn)定性好。通過(guò)對(duì)本發(fā)明涉及的ot-葡萄糖苷酶的氨基酸序列 比較分析，本發(fā)明涉及的a-葡萄糖苷酶屬于水解酶家族13中的一員。
組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸殘基，按照側(cè)鏈極性可以分成四類1、非極 性的氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、 甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro); 2、極 性不帶電荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱 氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr); 3、帶正 電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His); 4、帶負(fù)電 荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見(jiàn)"生物化學(xué)"(第二版) 上冊(cè)，沈同、王鏡巖，第82-83頁(yè)，高等教育出版社，19卯年12月)。蛋白 質(zhì)中如果發(fā)生同屬一個(gè)類別的氮基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由 Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中所起的作用(比如提供正電荷或形 成疏水囊袋結(jié)構(gòu)的作用)沒(méi)有改變，因此對(duì)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)并不會(huì)產(chǎn)生影 響，因此仍然可以實(shí)現(xiàn)蛋白的功能。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，Ala和Ser、 Val和Ile、 Asp和Glu、 Ser和Thr、 Ala和Gly、 Ala和Thr、 Ser和Asn、 Ala 禾口 Val、 Ser禾口 Gly、 Tyr禾口 Phe、 Ala禾口 pro、 Lys禾卩Arg、 Asp禾卩Asn、 Leu 和Ile、 Leu禾BVal、 Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會(huì)影 響蛋白的立體結(jié)構(gòu)和功能。所述同屬一個(gè)類別的氨基酸殘基取代可以發(fā)生在 上述a-葡萄糖苷酶的任意一個(gè)氨基酸殘基位置上。
本發(fā)明提供的oc-葡萄糖苷酶還可以進(jìn)行修飾或突變，得到衍生的蛋白 質(zhì)。本發(fā)明所述"衍生的蛋白質(zhì)"指與具有上述氨基酸序列的(x-葡萄糖苷酶有 氨基酸序列上的差異，或者有不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有 之。這些蛋白包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。所述誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種 技術(shù)得到，如輻射或誘變劑等產(chǎn)生的隨機(jī)突變，也可以通過(guò)如定點(diǎn)突變法或
其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)獲得。所述"衍生的蛋白質(zhì)"還包括具有天然L型 氨基酸的殘基的類似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的 氨基酸(如卩-氨基酸、Y-氨基酸等)的類似物。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白的化學(xué)衍生 形式，如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工 中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白。這種修飾可以通過(guò)將 蛋白暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。 修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸 蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解 性能的蛋白。
所述a-葡萄糖苷酶優(yōu)選具有SEQID: NO. 2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.6所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO. 8所示的氨基酸序列或SEQ ID: NO. 10所示的氨基酸序列。
所述a-葡萄糖苷酶更優(yōu)選具有SEQID: NO. 2所示的氨基酸序列。 本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明提供的a-葡萄糖苷酶的基因。 本領(lǐng)域公知，組成蛋白質(zhì)的20種不同的氨基酸中，除Met (ATG)或 Tip (TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個(gè)密碼 子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)，第 二版，1989，見(jiàn)950頁(yè)附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，決定一個(gè)氨 基酸的密碼子大多不止一個(gè)，三聯(lián)體密碼子中第三個(gè)核苷酸的置換，往往不 會(huì)改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本 領(lǐng)域人員根據(jù)公知的密碼子表，從本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，以及由所述氨 基酸序列得到的a-葡萄糖苷酶活性不變的氨基酸序列，完全可以推導(dǎo)出能夠 編碼它們的基因的核苷酸序列，通過(guò)生物學(xué)方法(如PCR方法、突變方法) 或化學(xué)合成方法得到所述核苷酸序列，因此該部分核苷酸序列都應(yīng)該包括在
本發(fā)明范圍內(nèi)。相反，利用本文公開(kāi)的DNA序列，也可以通過(guò)本領(lǐng)域公知 的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約， 美國(guó)，第二版，1989)進(jìn)行，通過(guò)修改本發(fā)明提供的核酸序列，得到與本發(fā) 明所述(x-葡萄糖苷酶活性一致的氨基酸序列。
優(yōu)選情況下，編碼本發(fā)明提供的a-葡萄糖苷酶的基因具有SEQID: NO. l所示的核苷酸序列，SEQID: NO. 3所示的核苷酸序列，SEQID: NO. 5 所示的核苷酸序列，SEQID: N0.7所示的核苷酸序列，SEQID: NO. 9所 示的核苷酸序列，或者對(duì)SEQID: NO. 1、 SEQID: NO. 3、 SEQ ID: NO. 5、 SEQID: NO. 7或SEQ ID: NO. 9所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸 取代、缺失或添加而得到的編碼活性不變的a-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。更 優(yōu)選的情況下，編碼本發(fā)明提供的a-葡萄糖苷酶的基因具有SEQID: NO. 1 所示的核苷酸序列，SEQID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQID: NO. 5所 示的核苷酸序列，SEQID: N0.7所示的核苷酸序列或SEQID: NO. 9所示 的核苷酸序列。最優(yōu)選的情況下，編碼本發(fā)明提供的a-葡萄糖苷酶的基因具 有SEQID: NO. 1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明提供的核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法、或人工合 成的方法獲得。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所提供的核苷酸序列和重 組工程菌，可以很容易獲得模板和引物，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增獲得有關(guān)序列。 序列較長(zhǎng)時(shí)，可以進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后將所得片段按正確次序 拼接。
一旦獲得了有關(guān)核苷酸序列，就可以用重組法大批量的獲得有關(guān)氨基酸 序列。通常將所得核苷酸序列克隆入載體，再轉(zhuǎn)入基因工程菌中，然后通過(guò) 常規(guī)的方法從增殖后的宿主細(xì)胞分離得到有關(guān)核苷酸序列。
此外，還可用公知的人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)核苷酸序列。
本發(fā)明提供的重組載體含有本發(fā)明提供的基因。
優(yōu)選所述重組載體為pGEM-TGlu或pETGlu (見(jiàn)實(shí)施實(shí)例2、 3)。 在本發(fā)明中，所述"載體"可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種 質(zhì)粒、粘粒、噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等，本發(fā)明優(yōu)選pGEM-T或pET28a質(zhì)粒。 重組載體構(gòu)建可采用載體本身多克隆位點(diǎn)的各種核酸內(nèi)切酶(如對(duì)于 pUC18，可用Sal I 、 BamH I 、 EcoR I等，對(duì)于pET28a，可用Nde I 、 Nhe I 、 EcoRl、 BamH、 HindIII等)進(jìn)行酶切獲得線性質(zhì)粒，與采用相同核酸內(nèi)切 酶切割的基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒。本發(fā)明優(yōu)先采用Nhe I和HindIII雙 酶切pET28a及與其連接的PCR產(chǎn)物片段，經(jīng)連接酶連接，構(gòu)建重組載體 pETGlu。
本發(fā)明提供的重組宿主細(xì)胞含有本發(fā)明提供的重組載體。 可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的方法將所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染到宿主 細(xì)胞中，如氯化鈣法化學(xué)轉(zhuǎn)化、高壓電擊轉(zhuǎn)化，優(yōu)選電擊轉(zhuǎn)化；所述宿主細(xì) 胞可以為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母或各種動(dòng) 植物細(xì)胞，更優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
本發(fā)明還提供了制備(x-葡萄糖苷酶的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明提供的重組 宿主細(xì)胞。所述培養(yǎng)條件可以為常規(guī)的培養(yǎng)條件，如LB培養(yǎng)基(酵母粉5 克/升，蛋白胨10克/升，NaC110克/升)、37°C。由于本發(fā)明提供的重組宿 主細(xì)胞中含有編碼oi-葡萄糖苷酶的基因，可以高效地表達(dá)a-葡萄糖苷酶。培 養(yǎng)完之后，經(jīng)過(guò)分離提純，即可得到高純度的ct-葡萄糖苷酶。
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1.含有SEQID: NO.l所示序列的重組克隆載體pGEM-TGlu質(zhì) 粒和轉(zhuǎn)化菌株DH5a (pGEM-TGlu)的構(gòu)建
從云南騰沖蛤蟆嘴熱泉(pH8，溫度78X:)采集水樣2L，經(jīng)0.22pm微孔
濾膜(Milipore公司)過(guò)濾收集水樣中的菌體，用STE緩沖液(O.lMNaCl;lO mM Tris-HCl pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0)洗下濾膜上的菌體，以4000 rpm 離心10分鐘，得菌體新鮮濕重約0.5g。菌體沉淀物用UltraClean Soil DNA Kit提取總DNA溶液(100pl， 0.4^g/Vl)，測(cè)定總DNA溶液的吸光度比值為 A260/A280= 1.947， A260/A230 = 2.15。取上述總DNA溶液0.2 pi為模板， 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中T7z^7ww AmwopMM HB27全基因組序列中a-糖苷酶上 下游序列信息，設(shè)計(jì)引物，正向引物為 5 ，-CCTAGCTAGCATGTGGTGGAAAGAG-3 ，, 反 向 引 物 為 5,-GCCCAAGCTTCTAGTCTAGCCGCAC -3，，用高保真DNA聚合酶pfu酶 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱PCR) [50lal體系，反應(yīng)條件為94'C4分鐘，1 個(gè)循環(huán)；94。C40秒/56"30秒/72。C2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72'C10分鐘，1個(gè)循 環(huán)]，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳凝膠回收后，經(jīng)過(guò)加polyA尾的步驟后(參
Promega公司)與pGEM-T Easy載體在4"C條件下過(guò)夜連接，并電擊(電壓 1.8KV，電容25pF，電擊時(shí)間3ms)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后，涂于含有50 微克/毫升Amp (單磷酸腺苷)、20微克/毫升IPTG (異丙基-p-D-硫代半乳 糖苷)和20微克/毫升X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)的LB平板(LB 培養(yǎng)基的基本成分為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 10克/升)。 此克隆子即為重組克隆載體轉(zhuǎn)化菌株DH5a (pGEM-TGlu)(此菌種已保存 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.2052，存活檢測(cè)日2007年5月17日)。挑取白斑菌落培養(yǎng)后進(jìn)行活性測(cè) 定，挑取有活性的克隆子，經(jīng)測(cè)序(北京諾賽基因組研究中心有限公司)驗(yàn) 證，轉(zhuǎn)化菌株DH5a (pGEM-TGlu)含有SEQ ID: NO.l所示的序列。轉(zhuǎn)化 菌株DH5a (pGEM-TGlu)中的pGEM-TGlu質(zhì)粒(含有SEQ ID: NO.l所 示的序列)可用于進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體。
實(shí)施例2. (X-葡萄糖苷酶表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化菌株的構(gòu)建
將pGEM-TGlu質(zhì)粒和質(zhì)粒pET28a都經(jīng)過(guò)Nhe I和HindlII雙酶切(50nl 酶切體系含質(zhì)粒20pg，兩種限制性內(nèi)切酶各20U， 37'C酶切4小時(shí))，經(jīng)瓊 脂糖電泳切膠回收目的插入片段和pET28a酶切片段后(分別回收于20|il去 離子水中)，取兩種酶切產(chǎn)物連接(5pl連接體系含lplpET28a酶切片段，3^1 目的插入片段，lplpromega公司的T4DNA連接酶，16。C連接過(guò)夜)，構(gòu)建 成pETGlu重組表達(dá)載體，取2pl連接產(chǎn)物電擊(電壓1.8KV，電容25pF， 電擊時(shí)間3ms)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)即得含有SEQID: NO.l的重組 表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株BL21 (DE3) (pETGlu)。
實(shí)施例3. a-葡萄糖苷酶基因突變體的制備及其轉(zhuǎn)化菌株的構(gòu)建 釆用Stratagene公司的定點(diǎn)突變?cè)噭┖?QuikChange site-directed mutagenesis kit)，以實(shí)施例2的表達(dá)載體pETGlu為模板，參照說(shuō)明書(shū)，通 過(guò)在引物中引入突變堿基并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)SEQID: NO.l分別進(jìn)行如下 4種定點(diǎn)突變(1) 211位A突變?yōu)镚; (2) 272位G突變?yōu)锳; (3) 1546 位的C突變成T，并且1571位的T突變成C; (4) 211位A突變?yōu)镚， 272 位G突變?yōu)锳， 1546位的C突變成T，并且1571位的T突變成C。將得到 的突變產(chǎn)物分別經(jīng)Dpn I酶切后(20inl體系含15pl PCR產(chǎn)物和5U Dpn I ， 37'C酶切2小時(shí))，各取2)il電轉(zhuǎn)化(條件同實(shí)施例2)大腸桿菌XL1-Blue感 受態(tài)細(xì)胞，獲得含有如SEQID: NO.l所示的a-葡萄糖苷酶基因的突變體的 載體 pETGlu-I71V 、 pETGlu醫(yī)R91K 、 pETGlu匿L516F/V524A 和 pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A，這些突變體的核苷酸序列經(jīng)北京諾賽基 因組研究中心有限公司測(cè)序，結(jié)果如SEQID: N0.3、 N0.5、 N0.7禾H NO.9 所示，實(shí)現(xiàn)了預(yù)設(shè)的點(diǎn)突變，艮卩，與SEQID: NO.l相比，這些核苷酸序列 分別依次在211位A突變?yōu)镚、 272位G突變?yōu)锳、 1546位的C和1571
位的T突變成T和C以及四個(gè)相應(yīng)位點(diǎn)的全部突變，導(dǎo)致三聯(lián)體密碼子分 別由ATC變?yōu)镚TC、 AGG變?yōu)锳AG、 CTC和GTG變?yōu)門(mén)TC和GCG、以 及四個(gè)三聯(lián)體密碼子同時(shí)的改變，相應(yīng)的氨基酸序列(如SEQID: N0.4、 N0.6、 NO.8和NO.10所示)71位氨基酸lie變?yōu)閂al、 91位Arg變?yōu)長(zhǎng)ys、 516位Leu和524位Val變?yōu)镻he和Ala、以及四個(gè)位點(diǎn)氨基酸的同時(shí)改變。
按照與實(shí)施例2相同的方法，將pETGlu-I71V、 pETGlu-R91K、 pETGlu-L516F/V524A和pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A分別轉(zhuǎn)入大腸桿 菌BL21(DE3)，含有這些重組質(zhì)粒的大腸桿菌分別稱為BL21 (DE3) (pETGlu-I71V)、 BL21 (DE3) (pETGlu畫(huà)R91K)、 BL21 (DE3) (pETGlu-L516F/V524A)禾卩BL21 (DE3) (pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A)。
實(shí)施例4.重組a-葡萄糖苷酶的表達(dá)和純化
將實(shí)施例2制備的含有重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株BL21 (DE3)(pETGlu) 按1體積％的接種量接于含有50微克/毫升卡那霉素的LB培養(yǎng)基(基本成 分為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaC110克/升)中，在搖床上以 220rpm的轉(zhuǎn)速，37。C培養(yǎng)2小時(shí)至OD6()()=0.6，加入IPTG至終濃度為lmM， 轉(zhuǎn)至30。C繼續(xù)培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速仍為220rpm)約4小時(shí)。6000rpm離心10分鐘 收集菌體，懸浮于溶液A (20mMTris-Cl， pH7.9， 0.5MNaCl， 10mM咪 唑)中，超聲(功率60瓦，超聲30分鐘)破碎，15000 rpm離心10分鐘除去 細(xì)胞碎片，上清過(guò)Ni-IDAHis'BindSuperflow純化柱，用5ml溶液A沖洗， 再用10ml溶液B (20mMTris-ClpH7.9， 0.5MNaCl， 60mM咪唑)漂洗， 最后用5ml溶液C (20 mM Tris-Cl， pH 7.9， 0.5MNaCl， 500 mM咪唑) 洗脫，收集洗脫液。然后將洗脫液用FPLC (快速蛋白液相層析)的脫鹽、 凝膠過(guò)濾和離子交換層析柱分別進(jìn)行純化。最后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳 (12%的分離膠，4%的堆積膠，120伏電壓電泳2小時(shí))得到純的重組蛋白產(chǎn)
物。如圖1所示，泳道1表示以空pET28a載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)做 對(duì)照，泳道2表示上His'Bind Superflow純化柱之前的細(xì)胞總的可溶蛋白， 泳道M表示低分子量蛋白Marker,泳道3表示純化后的重組甘露聚糖酶蛋 白。從泳道2和泳道1的對(duì)比可以看出，本發(fā)明的重組甘露聚糖酶蛋白得到 了高效表達(dá)；從泳道3和泳道2的對(duì)比可以看出，本發(fā)明的重組甘露聚糖酶 蛋白的純化比率相當(dāng)高。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)所述重組甘露聚糖酶分子量約 59kD左右，基本符合理論推斷的58kD。按照上述方法，分別利用實(shí)施例3 中構(gòu)建的BL21 (DE3) (pETGlu-I71V)、 BL21 (DE3) (pETGlu-R91K)、 BL21 ( DE3 ) ( pETGlu陽(yáng)L516F/V524A ) 禾B BL21 ( DE3 ) (pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A)表達(dá)a-葡萄糖苷酶的突變體并進(jìn)行純 化。
實(shí)施例5.重組a-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度、pH和熱穩(wěn)定性測(cè)定 將上述純化的重組酶(氨基酸序列如SEQ ID: N0.2所示)液稀釋至 lpg/ml進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定。最適反應(yīng)溫度測(cè)定分別往930|il的pH6.0磷 酸氫二鈉(0.2M)-檸檬酸(0.1M)緩沖液加入20ial5mMpNPG，在不同的 溫度下(50°C、 60°C、 70°C、 80°C、 90°C、 95。C和100。C)保溫5分鐘，然 后加入濃度為l嗎/ml的酶液50^d，反應(yīng)10分鐘，然后加入lml 1M的碳酸 鈉溶液中止反應(yīng)，在410nm測(cè)吸光值，確定各溫度條件下的相對(duì)活性(將最 高酶活表示為100X)。最適反應(yīng)pH測(cè)定分別往930plpH值分別為4、4.5、 5、 6、 7、 8的磷酸氫二鈉(0.2M)-擰檬酸(0.1M)緩沖液加入20|al 5mM pNPG， 在最適反應(yīng)溫度95'C保溫5分鐘，然后加入lpg/ml的酶液50pl，反應(yīng)10 分鐘，然后加入lmllM的碳酸鈉溶液中止反應(yīng)，在410nm測(cè)吸光值，以最 高處酶活為100%。測(cè)定結(jié)果如圖2(a)和(b)所示，最適反應(yīng)溫度為95'C，最 適pH5.0。熱穩(wěn)定性測(cè)定將酶液用pH6.0磷酸氫二鈉(0.2M)-檸檬酸(0.1M)
緩沖液稀釋后，在不同溫度下(70°C、 8(TC和90°C)分別保溫不同的時(shí)間(各 時(shí)點(diǎn)如圖2(c)所示)，然后取出后在95"C測(cè)定酶活(以pNPG為底物)，以不 加熱處理的酶液測(cè)定的酶活為對(duì)照(100%)。測(cè)定結(jié)果如圖2(c)，在7(TC很 穩(wěn)定，在80。C和9(TC的半衰期分別為230分鐘和130分鐘。用同樣的方法， 對(duì)所述四個(gè)突變體蛋白活性的測(cè)定顯示突變體酶的耐熱性與序列如SEQ ID: NO.2所示的a-葡萄糖苷酶十分接近，因此這些位點(diǎn)氨基酸的突變對(duì)酶 的熱穩(wěn)定性沒(méi)有影響。
實(shí)施例6.重組a-葡萄糖苷酶的底物特異性測(cè)定
在900pl的pH為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(磷酸氫二鈉0.2M, 檸檬酸0.1M)中分別加入50jill^的麥芽糖、麥芽三-七糖、蔗糖、海藻糖、 異麥芽糖、可溶性淀粉、糊精做為底物，在9(TC保溫5分鐘后加入5(^1酶 液反應(yīng)IO分鐘，然后用葡萄糖測(cè)定試劑盒(北京華宇億康生物工程技術(shù)有限 公司，貨號(hào)TYA-6001)測(cè)定所產(chǎn)生的葡萄糖含量。結(jié)果序列如SEQID: NO.2 所示的(x-葡萄糖苷酶對(duì)麥芽三-七糖、可溶性淀粉、糊精無(wú)作用，而對(duì)蔗糖、 海藻糖水解效率高，對(duì)麥芽糖的水解效率稍弱。其中對(duì)蔗糖和海藻糖的比活 力分別是7.94^imol/mirvmg和14.42|amol/min'mg，對(duì)蔗糖的酶活與已有專利 報(bào)道的a-葡萄糖苷酶(例如美國(guó)專利US 6506592公開(kāi)的硫化葉菌^//0/0Z w ^//aton'cw的a-葡萄糖苷酶對(duì)蔗糖的比活力為1.29土0.3pmol/mhvmg)相比 有顯著提高，且在65-85'C下活性穩(wěn)定，可以很好用于果葡糖漿的生產(chǎn)，對(duì) 麥芽糖的比活力是0.33,01/miivmg，雖然對(duì)麥芽糖的水解效率較弱，但是 本發(fā)明提供的基因能夠利用T7強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行高效表達(dá)(從圖1可以看出， 實(shí)施例4已經(jīng)進(jìn)行了論述)，再加上其具有優(yōu)良熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)，完全可以 彌補(bǔ)麥芽糖水解性能較弱的不足。
用同樣的方法，對(duì)所述四個(gè)突變體蛋白酶的酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示與 SEQ ID: NO.2所示的a-葡萄糖苷酶十分接近。
SEQUENCE LISTING
〈110〉中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
〈120〉 a -葡萄糖苷酶及其基因和制備方法以及載體和宿主細(xì)胞
〈130〉 I7946ZKW
〈160〉 10
〈170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 1587
〈212〉 DNA <213〉人工合成
〈400〉 1
3tgtggtgg33卿ggcggtcatctaccaggtttatccccggagcttccaggacacgaac60
gggg3Cgg3gtggggg織tcgsgggggtgcgc郷cggcttccctacctcaagtccttg120
ggggtggetcgccctctggctttcccccttctacaaaagcccttcggttac180
g3CgtggCtgact3ctgcg已cgtggacccc3tcttcggg3cccttcaggactttgaccgg240
ctcctagaggaggcccacgccctagggctt鄉(xiāng)gtcctcgtggacctggtgccgaaccac300
acctccagcgagcacccctggttcttggagtcccgcgcctcccgg已a(bǔ)tsgccccaagcgg360
gactggtacatctggaaagaccccgctccggacggcggcccccccaac33ctggc卿gc420
ttcttcggcggccccgcctggaccctggacgaggcgacgggccagtactacctccaccag480
ttcctccccgagcagcccgacctcaactggcga犯ccccg鄉(xiāng)tgCggg3ggccatttac540
g鄉(xiāng)tg6LtgCgcttctggctc鄉(xiāng)cgcggggtgg已cggcttccgggtggacgtcctctgg600
cttctcgccgaggacctcctctttcgggatgagcccggaaaccccgactggcgcccgggc660
stgtgggaccggggccgccacctccacatcttcaccgagg3cca^gccgg3gacctacgcc720
"Ucgtgcgggagatgcgccaggtcctggacgagttctccgsgcccgggcg卿gcgggtg780
atggtgggggagatctaccttccctacccccagctcgtgcgctactaccaggccgggtgc840
cacctgcccttcaacttccacctcatcttccgggggcttcccgactggaggcccgsg犯c900
ctggcccgcatcgtggaggagtscg卿gcctcctcacccgctgggactggcccasctgg960
gtcctcggca￡LCCaCg3CC3gccccgtctcgcctcccgcctgggggsggcccaggcccgg1020
gtcgcggccatgctccttttcaccttgaggggcacccccacctggtactacggggacgsg1080
3tcgggatga3g獄gggg3gatccccccgg卿aggtgcaagaccccgccgccctccgc1140
cag33ggaccgcctgggggagcacaacctgcccccgggccgggaccccgagcggaccccc1200
atgcagtgggacg3cacccccttcgcgggcttttccaccgtggaaccctggcttcccgtg1260
aaccccgactac^gacccggaacgtggccgccc鄉(xiāng)agcaagacccccgctccatgctc1320
cacctggtgcgccgcctcatcgccttgaggaaggsccccgacctcctctacggggcctac1380
cgcacctaccgggggtctacgcctacctccggggggsggggtggcttgtg1440
gccctgaaccgg卿3ggccctggagcttccgcgcggggg眺ggtggtc1500
ctctccacccacctggaccggg3gg,gggtggggg^aggcttctcttgcgcccggac1560
眺ggcgtggtggtgcggct3g已Ct已g1587
<210> 2
<211> 528
<212〉 PRT
〈213〉 重組表達(dá)
〈400〉 2
Met Trp Trp Lys Glu Ala Val lie Tyr Gin Val Tyr Pro
1 5 10
Gin Asp Thr Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu Glu Gly
20 25 Arg Leu Pro Tyr Leu Lys Ser Leu Gly Val Asp Ala Leu 35 40 45
Pro Phe Tyr Lys Ser Pro Met Lys Asp Phe Gly Tyr Asp
50 55 60
Tyr Cys Asp Val Asp Pro lie Phe Gly Thr Leu Gin Asp 65 70 75
Leu Leu Glu Glu Ala His Ala Leu Gly Leu Arg Val Leu
85 90 Val Pro Asn His Thr Ser Ser Glu His Pro Trp Phe Leu
100 105 Ala Ser Arg Asn Ser Pro Lys Arg Asp Trp Tyr lie Trp 115 120 125
Ala Pro Asp Gly Gly Pro Pro Asn Asn Trp Gin Ser Phe
130 135 140
Pro Ala Trp Thr Leu Asp Glu Ala Thr Gly Gin Tyr Tyr 145 150 155
Phe Leu Pro Glu Gin Pro Asp Leu Asn Trp Arg Asn Pro
165 170 Glu Ala lie Tyr Glu Val Met Arg Phe Trp Leu Arg Arg
180 185 Gly Phe Arg Val Asp Val Leu Trp Leu Leu Ala Glu Asp 195 200 205
Arg Asp Glu Pro Gly Asn Pro Asp Trp Arg Pro Gly Met
210 215 220
Gly Arg His Leu His lie Phe Thr Glu Asp Gin Pro Glu 225 230 235
Tyr Val Arg Glu Met Arg Gin Val Leu Asp Glu Phe Ser
245 250 Arg Glu Arg Val Met Val Gly Glu lie Tyr Leu Pro Tyr
260 265 Val Arg Tyr Tyr Gin Ala Gly Cys His Leu Pro Phe Asn 275 280 285
17
Arg Ser Phe 15
Val Arg Arg 30
Trp Leu Ser
Val Ala Asp
Phe Asp Arg 80
Val Asp Leu 95
Glu Ser Arg 110
Lys Asp Pro
Phe Gly Gly
Leu His Gin 160
Glu Val Arg
175 Gly Val Asp 190
Leu Leu Phe
Trp Asp Arg
Thr Tyr Ala 240
Glu Pro Gly
255 Pro Gin Leu 270
Phe His Leu
lie Phe Arg Gly Leu Pro Asp Trp Arg Pro Glu Asn Leu Ala Arg lie
290 295 300
Val Glu Glu Tyr Glu Ser Leu Leu Thr Arg Trp Asp Trp Pro Asn Trp 305 310 315 320
Val Leu Gly Asn His Asp Gin Pro Arg Leu Ala Ser Arg Leu Gly Glu
325 330 335
Ala Gin Ala Arg Val Ala Ala Met Leu Leu Phe Thr Leu Arg Gly Thr
340 345 350
Pro Thr Trp Tyr Tyr Gly Asp Glu lie Gly Met Lys Asn Gly Glu lie
355 360 365
Pro Pro Glu Lys Val Gin Asp Pro Ala Ala Leu Arg Gin Lys Asp Arg
370 375 380
Leu Gly Glu His Asn Leu Pro Pro Gly Arg Asp Pro Glu Arg Thr Pro 385 390 395 400
Met Gin Trp Asp Asp Thr Pro Phe Ala Gly Phe Ser Thr Val Glu Pro
405 410 415
Trp Leu Pro Val Asn Pro Asp Tyr Lys Thr Arg Asn Val Ala Ala Gin
420 425 430
Glu Gin Asp Pro Arg Ser Met Leu His Leu Val Arg Arg Leu lie Ala
435 440 445
Leu Arg Lys Asp Pro Asp Leu Leu Tyr Gly Ala Tyr Arg Thr Tyr Arg
450 455 460
Ala Arg Glu Gly Val Tyr Ala Tyr Leu Arg Gly Glu Gly Trp Leu Val 465 470 475 480
Ala Leu Asn Leu Thr Glu Lys Glu Lys Ala Leu Glu Leu Pro Arg Gly
485 490 495
Gly Arg Val Val Leu Ser Thr His Leu A印Arg Glu Glu Arg Val Gly
500 505 510
Glu Arg Leu Leu Leu Arg Pro Asp Glu Gly Val Val Val Arg Leu Asp 515 520 525
<210> 3 〈211〉 1587 <212> DNA 〈213〉人工合成
〈400〉 3
atgtggtggaa卿ggcggtcatctaccaggtttatccccggagcttccaggacacg3ac60
ggg印cggsgtgggggacctcgagggggtgcgcaggcggcttccctacctcaagtccttg120
ggggtggMgccctctggctttcccccttctsc犯aagcccttcggttac180
g已cgtggctgactactgcgacgtggaccccgtcttcgggacccttcaggactttgaccgg240
ctcctagaggaggcccacgccctagggctt鄉(xiāng)gtcctcgtggacctggtgccgaaccac300
acctccagcgagcacccctggttcttggagtcccgcgcctCCCgg犯t3gcccc犯gcgg360
g3Ctggt3C3tCtgg3犯g3ccccgctccggacggcggccCCCCC33C^ctggc卿gc420ttcttcggcg ttcctccccg gaggtgatgc cttctcgccg atgtgggacc tacgtgcggg atggtggggg cacctgccct ctggcccgca gtcctcggca gtcgcggcca atcgggatga cagaaggacc atgcagtggg aaccccgact cacctggtgc cgcacctacc gccctgaacc ctctccaccc
g3gggCgtgg
gccccgcctg agcagcccga gcttctggct aggacctcct ggggccgcca agatgcgcca agatctacct tcaacttcca tcgtggagga
3CC3Cg3CC3
tgctcctttt agaacgggga gcctggggga acgacacccc acaagacccg gccgcctcat gggcgaggga tcacgg3333 acctggaccg tggtgcggct
gaccctggac cctcaactgg c鄉(xiāng)cgcggg ctttcgggat cctccacatc ggtcctggac tccctacccc cctcatcttc gtacg柳gc gccccgtctc caccttgagg ga/tccccccg gcacaacctg cttcgcgggc g咖gtggcc cgccttgagg gggggtctac ggagaaggcc
gg3gg3犯gg 3g3Ct3g
gaggcgacgg cgaaaccccg gtggacggct gagcccggaa ttcaccgagg gagttctccg cagctcgtgc cgggggcttc ctcctcaccc gcctcccgcc ggcaccccca gag犯ggtgc cccccgggcc ttttccaccg gcccaggagc aaggaccccg gcctacctcc ctggagcttc gtgggggaaa
gccagtacta aggtgcggga tccgggtgga accccgactg accagccgga agcccgggcg gctactacca ccgactggag gctgggactg tggggg鄉(xiāng)c cctggtacta aagaccccgc gggaccccga tggaaccctg aagacccccg acctcctcta ggggggaggg cgcgcggggg ggcttctctt
cctccaccag ggccatttac cgtcctctgg gcgcccgggc gacctacgcc ggagcgggtg ggccgggtgc gcccgagBEic gcccaactgg ccaggcccgg cggggscgag cgccctccgc gcggaccccc gcttcccgtg ctccatgctc cggggcctac gtggcttgtg gagggtggtc gcgcccggac
480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 函 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1587
<210> 4
〈211〉 528
<212> PRT
<213〉 重組表達(dá)
〈400> 4 Met Trp Trp 1
Gin Asp
Arg Leu
Pro Phe 50 Tyr Cys 65
Leu Leu
Thr
Pro
35
Tyr
Asp
Glu
Lys
Asn
20
Tyr
Lys
Val
Glu
Val Pro Asn His 100
Ala Ser Arg Asn 115
Ala Pro Asp Gly
Glu 5
Gly
Leu
Ser
Asp
Ala
85
Thr
Ser
Gly
Ala
Asp
Lys
Pro
Pro
70
His
Ser
Pro
Pro
Val lie Tyr Gly Ser
Met
55
Val
Ala
Ser
Lys
Pro
Val Gly
25 Leu Gly 40
Lys Asp
Phe Gly
Leu Gly
Glu His 105 Arg Asp 120
Asn Asn
Gin Val Tyr Pro Arg Ser Phe 10 15 Asp Leu Glu Gly Val Arg Arg 30
Val Asp Ala Leu Trp Leu Ser 45
Phe Gly Tyr Asp Val Ala Asp 60
Thr Leu Gin Asp Phe Asp Arg
75 80 Leu Arg Val Leu Val Asp Leu 90 95 Pro Trp Phe Leu Glu Ser Arg 110
Trp Tyr lie Trp Lys Asp Pro 125
Trp Gin Ser Phe Phe Gly Gly Pro 145 Phe
Glu
Gly
Arg
Gly 225 Tyr
Arg
Val
lie
Val 305 Val
Ala
Pro
Pro
Leu 385 Met
Trp
Glu
Leu
Ala 465 Ala
130 Ala
Leu
Ala
Phe
Asp 210 Arg
Val
Glu
Arg
Phe 290 Glu
Leu
Gin
Thr
Pro 370 Gly
Gin
Leu
Gin
Arg 450 Arg
Leu
Trp
Pro
lie
Arg 195 Glu
His
Arg
Arg
Tyr 275
Arg
Glu
Gly
Ala
Trp 355 Glu
Glu
Trp
Pro
Asp 435 Lys
Glu
Asn
Thr
Glu
Tyr 180 Val
Pro
Leu
Glu
Val 260 Tyr
Gly
Tyr
Asn
Arg 340 Tyr
Lys
His
Asp
Val 420 Pro
Asp
Gly
Leu
Leu
Gin 165 Glu
Asp
Gly
His
Met 245 Met
Gin
Leu
Glu
His 325 Val
Tyr
Val
Asn
Asp 405 Asn
Arg
Pro
Val
Thr
Asp 150 Pro
Val
Val
Asn
lie 230 Arg
Val
Ala
Pro
Ser 310 Asp
Ala
Gly
Gin
Leu 390 Thr
Pro
Ser
Asp
Tyr 470 Glu
135 Glu
Asp
Met
Leu
Pro 215 Phe
Gin
Gly
Gly
Asp 295 Leu
Gin
Ala
Asp
Asp 375 Pro
Pro
Asp
Met
Leu 455 Ala
Lys
Ala
Leu
Arg
Trp 200 Asp
Thr
Val
Glu
Cys 280 Trp
Leu
Pro
Met
Glu 360 Pro
Pro
Phe
Tyr
Leu 440 Leu
Tyr
Glu
Thr
Asn
Phe 185 Leu
Trp
Glu
Leu
lie 265 His
Arg
Thr
Arg
Leu 345 lie
Ala
Gly
Ala
Lys 425 His
Tyr
Leu
Lys
Gly
Trp 170 Trp
Leu
Arg
Asp
Asp 250 Tyr
Leu
Pro
Arg
Leu 330 Leu
Gly
Ala
Arg
Gly 410 Thr
Leu
Gly
Arg
Ala
Gin 155 Arg
Leu
Ala
Pro
Gin 235 Glu
Leu
Pro
Glu
Trp 315 Ala
Phe
Met
Leu
Asp 395 Phe
Arg
Val
Ala
Gly 475 Leu
140 Tyr
Asn
Arg
Glu
Gly 220 Pro
Phe
Pro
Phe
Asn 300 Asp
Ser
Thr
Lys
Arg 380 Pro
Ser
Asn
Arg
Tyr 460 Glu
Glu
Tyr
Pro
Arg
Asp 205 Met
Glu
Ser
Tyr
Asn 285 Leu
Trp
Arg
Leu
Asn 365 Gin
Glu
Thr
Val
Arg 445 Arg
Gly
Leu
Leu
Glu
Gly 190 Leu
Trp
Thr
Glu
Pro 270 Phe
Ala
Pro
Leu
Arg 350 Gly
Lys
Arg
Val
Ala 430 Leu
Thr
Trp
Pro
His
Val 175 Val
Leu
Asp
Tyr
Pro 255 Gin
His
Arg
Asn
Gly 335 Gly
Glu
Asp
Thr
Glu 415 Ala
lie
Tyr
Leu
Arg
Gin 160 Arg
Asp
Phe
Arg
Ala 240 Gly
Leu
Leu
lie
Trp 320 Glu
Thr
lie
Arg
Pro 400 Pro
Gin
Ala
Arg
Val 480 Gly
485
Gly Arg Val Val Leu 500
Glu Arg Leu Leu Leu 515
〈210〉 5 〈211〉 1587 〈212〉 DNA 〈213>人工合成
〈400〉 5
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cgcacctaccgggcg鄉(xiāng)g已gggggtctacgcctacctccggggg眺gggtggcttgtg1440
gccctgaaccgg卿aggccctggagcttccgcgcggggggsgggtggtc1500
ctctccaccc已cctggaccggg鄉(xiāng)認(rèn)gggtggggg3aaggcttctcttgcgcccggac1560
g鄉(xiāng)gcgtggtggtgcggctagact3g1587
<210〉 6
<211〉 528
〈212> PRT
〈213〉 重組表達(dá)
490
Ser Thr His Leu Asp Arg 505
Arg Pro Asp Glu Gly Val 520
495
Glu Glu Arg Val Gly 510
Val Val Arg Leu Asp 525
21
〈400〉 6
Met Trp Trp Lys Glu Ala Val lie Tyr Gin Val Tyr
1 5 10
Gin Asp Thr Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu Glu
20 25 Arg Leu Pro Tyr Leu Lys Ser Leu Gly Val Asp Ala
35 40 Pro Phe Tyr Lys Ser Pro Met Lys Asp Phe Gly Tyr
50 55 60
Tyr Cys Asp Val Asp Pro lie Phe Gly Thr Leu Gin 65 70 75
Leu Leu Glu Glu Ala His Ala Leu Gly Leu Lys Val
85 90 Val Pro Asn His Thr Ser Ser Glu His Pro Trp Phe
100 105 Ala Ser Arg Asn Ser Pro Lys Arg Asp Trp Tyr lie
115 120 Ala Pro Asp Gly Gly Pro Pro Asn Asn Trp Gin Ser 130 135 140
Pro Ala Trp Thr Leu Asp Glu Ala Thr Gly Gin Tyr 145 150 155
Phe Leu Pro Glu Gin Pro Asp Leu Asn Trp Arg Asn
165 170 Glu Ala lie Tyr Glu Val Met Arg Phe Trp Leu Arg
180 185 Gly Phe Arg Val Asp Val Leu Trp Uu Leu Ala Glu
195 200 Arg Asp Glu Pro Gly Asn Pro Asp Trp Arg Pro Gly 210 215 220
Gly Arg His Leu His lie Phe Thr Glu Asp Gin Pro 225 230 235
Tyr Val Arg Glu Met Arg Gin Val Leu Asp Glu Phe
245 250 Arg Glu Arg Val Met Val Gly Glu lie Tyr Leu Pro
260 265 Val Arg Tyr Tyr Gin Ala Gly Cys His Leu Pro Phe
275 280 lie Phe Arg Gly Leu Pro Asp Trp Arg Pro Glu Asn 290 295 300
Val Glu Glu Tyr Glu Ser Leu Leu Thr Arg Trp Asp 305 310 315
Val Leu Gly Asn His Asp Gin Pro Arg Leu Ala Ser 325 330
Pro Arg Ser Phe 15
Gly Val Arg Arg 30
Leu Trp Leu Ser 45
Asp Val Ala Asp
Asp Phe Asp Arg 80
Leu Val Asp Leu 95
Leu Glu Ser Arg 110
Trp Lys Asp Pro 125
Phe Phe Gly Gly
Tyr Leu His Gin 160
Pro Glu Val Arg 175
Arg Gly Val Asp 190
Asp Leu Leu Phe 205
Met Trp Asp Arg
Glu Thr Tyr Ala 240
Ser Glu Pro Gly 255
Tyr Pro Gin Leu 270
Asn Phe His Leu 285
Leu Ala Arg lie
Trp Pro Asn Trp 320
Arg Leu Gly Glu 335
Ala Gin
Pro Thr
Pro Pro 370 Leu Gly 385
Met Gin
Trp Leu
Glu Gin
Leu Arg 450 Ala Arg 465
Ala Leu Gly Arg Glu Arg
Ala
Trp 355 Glu
Glu
Trp
Pro
Asp 435 Lys
Glu
Asn
Val
Leu 515
340 Tyr
Lys
His
Asp
Val 420 Pro
Asp
Gly
Leu
Val 500 Leu
Val
Tyr
Val
Asn
Asp 405 Asn
Arg
Pro
Val
Thr 485 Leu
Leu
Ala
Gly
Gin
Leu 390 Thr
Pro
Ser
Asp
Tyr 470 Glu
Ser
Arg
Ala
Asp
Asp 375 Pro
Pro
Asp
Met
Leu 455 Ala
Lys
Thr
Pro
Met
Glu 360 Pro
Pro
Phe
Tyr
Leu 440 Leu
Tyr
Glu
His
Asp 520
Leu 345 lie
Ala
Gly
Ala
Lys 425 His
Tyr
Leu
Lys
Leu 505 Glu
Leu
Gly
Ala
Arg
Gly 410 Thr
Leu
Gly
Arg
Ala 490 Asp
Gly
Phe
Met
Leu
Asp 395 Phe
Arg
Val
Ala
Gly 475 Leu
Arg
Val
Thr
Lys
Arg 380 Pro
Ser
Asn
Arg
Tyr 460 Glu
Glu
Glu
Val
Leu
Asn 365 Gin
Glu
Thr
Val
Arg 445 Arg
Gly
Leu
Glu
Val 525
Arg 350 Gly
Lys
Arg
Val
Ala 430 Leu
Thr
Trp
Pro
Arg 510 Arg
Gly
Glu
Asp
Thr
Glu 415 Ala
lie
Tyr
Leu
Arg 495 Val
Leu
Thr
lie
Arg
Pro 400 Pro
Gin
Ala
Arg
Val 480 Gly
Gly
Asp
〈210〉 7
<211〉 1587
〈212〉 腿 〈213〉人工合成
〈400〉 7
3tgtggtgg3犯gsggcggtcatctaccaggtttatccccggagcttccaggac￡icga3c60
gggg3Cgg3gtgggggacctcg鄉(xiāng)gggtgcgcaggcggcttccctacctcaagtccttg120
ggggtggacgccctctggctttcccccttcCC3tg犯gg3cttcggttac180
gacgtggctgactactgcgacgtggaccccatcttcgggacccttcaggeictttgaccgg240
ctcctagaggaggcccacgccctagggcttagggtcctcgtggacctggtgccgaaccac300
acctccagcgagcacccctggttcttggagtcccgcgcctcccggaatagcccc犯gcgg360
gactggtacatctggaaagaccccgctccggacggcggccccccc犯c^ctggc卿gc420
ttcttcggcggccccgcctggaccctggacg鄉(xiāng)cgscgggccagtactacctccaccag■
ttcctccccg3gC3gCCCg3cctcaactggcgaaaccccg鄉(xiāng)tgcgggaggccatttac540
gaggtg3tgcgcttctggctc鄉(xiāng)cgcggggtggacggcttccgggtggacgtcctctgg600
cttctcgccgaggacctcctctttcgggatg3gcccgga^accccgactggcgcccgggc660
3tgtggg獄ggggccgccacctccacatcttcaccgagg3CC3gCCgg3gacctacgcc720
tacgtgcgggagatgcgccaggtcctggacgagttctccgagcccgggcgg鵬cgggtg780
atggtgggggagatctaccttccctacccccagctcgtgcgctactaccei ggccgggtgc840
cacctgcccttcaacttccacctcatcttccgggggcttcccgactggaggcccgagaac900
ctggcccgcatcgtggaggagtacgagagcctcctcacccgctgggactg gcccaactgg960
gtcctcggcaaccacgaccagccccgtctcgcctcccgcctgggggaggcccaggcccgg1020
gtcgcggccatgctccttttcaccttgaggggcacccccacctggtactacggggacgag1080
atcgggatg3卿acggggagatccccccggag犯ggtgcaagaccccgccgccctccgc1140
cagaaggaccgcctgggggagcacaacctgcccccgggccgggaccccgagcggaccccc1200
atgcagtgggaCg3C3CCCCcttcgcgggcttttccaccgtggaaccctggcttcccgtg1260
aaccccgactacaagacccgg獄gtggccgcccaggagcaagacccccgctccatgctc1320
cacctggtgcgccgcctcatcgccttgagg33gg3CCCCgacctcctcta cggggcctac1380
cgcacctaccgggCg3ggg3gggggtctacgcctacctccggggggaggggtggcttgtg1440
gccctgaacctcacgga犯aggagaaggccctggagcttccgcgcgggggg鄉(xiāng)gtggtc1500
ctctccacccacctggaccgg眺g認(rèn)gggtgggggaetaggcttttcttgcgcccggeic1560
g3gggCgtggcggtgcggct3g3Ct3g1587
〈210〉 8
〈211〉 528
<212〉 PRT
<213> 重組表達(dá)
<400> 8
Met Trp Trp Lys Glu Ala Val lie Tyr Gin Val Tyr Pro Arg Ser Phe
15 10 15
Gin Asp Thr Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg Arg
20 25 30
Arg Leu Pro Tyr Leu Lys Ser Leu Gly Val Asp Ala Leu Trp Leu Ser
35 40 45
Pro Phe Tyr Lys Ser Pro Met Lys Asp Phe Gly Tyr Asp Val Ala Asp
50 55 60
Tyr Cys Asp Val Asp Pro lie Phe Gly Thr Leu Gin Asp Phe Asp Arg 65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Ala His Ala Leu Gly Leu Arg Val Leu Val Asp Leu
85 90 95
Val Pro Asn His Thr Ser Ser Glu His Pro Trp Phe Leu Glu Ser Arg
100 105 110
Ala Ser Arg Asn Ser Pro Lys Arg Asp Trp Tyr lie Trp Lys Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Asp Gly Gly Pro Pro Asn Asn Trp Gin Ser Phe Phe Gly Gly
130 135 140
Pro Ala Trp Thr Leu Asp Glu Ala Thr Gly Gin Tyr Tyr Leu His Gin 145 150 155 160
Phe Leu Pro Glu Gin Pro Asp Leu Asn Trp Arg Asn Pro Glu Val Arg
165 170 175
Gly Phe
Arg Asp 210 Gly Arg 225
Tyr Val
Arg Glu
Val Arg
lie Phe 290 Val Glu 305
Val Leu
Ala Gin
Pro Thr
Pro Pro 370 Leu Gly 385
Met Gin
Trp Leu
Glu Gin
Leu Arg 450 Ala Arg 465
Ala Leu Gly Arg Glu Arg
Arg 195 Glu
His
Arg
Arg
Tyr 275 Arg
Glu
Gly
Ala
Trp 355 Glu
Glu
Trp
Pro
Asp 435 Lys
Glu
Asn
Val
Leu 515
180
Val
Pro
Leu
Glu
Val 260 Tyr
Gly
Tyr
Asn
Arg 340 Tyr
Lys
His
Asp
Val 420 Pro
Asp
Gly
Leu
Val 500 Leu
Asp
Gly
His
Met 245 Met
Gin
Leu
Glu
His 325 Val
Tyr
Val
Asn
Asp 405 Asn
Arg
Pro
Val
Thr 485 Leu
Phe
Val
Asn
lie 230 Arg
Val
Ala
Pro
Ser 310 Asp
Ala
Gly
Gin
Leu 390 Thr
Pro
Ser
Asp
Tyr 470 Glu
Ser
Arg
Leu
Pro 215 Phe
Gin
Gly
Gly
Asp 295 Leu
Gin
Ala
Asp
Asp 375 Pro
Pro
Asp
Met
Leu 455 Ala
Lys
Thr
Pro
Trp 200 Asp
Thr
Val
Glu
Cys 280 Trp
Leu
Pro
Met
Glu 360 Pro
Pro
Phe
Tyr
Leu 440 Leu
Tyr
Glu
His
Asp 520
185 Leu
Trp
Glu
Leu
lie 265 His
Arg
Thr
Arg
Leu 345 lie
Ala
Gly
Ala
Lys 425 His
Tyr
Leu
Lys
Leu 505 Glu
Leu
Arg
Asp
Asp 250 Tyr
Leu
Pro
Arg
Leu 330 Leu
Gly
Ala
Arg
Gly 410 Thr
Leu
Gly
Arg
Ala 490 Asp
Gly
Ala
Pro
Gin 235 Glu
Leu
Pro
Glu
Trp 315 Ala
Phe
Met
Leu
Asp 395 Phe
Arg
Val
Ala
Gly 475 Leu
Arg
Val
Glu
Gly 220 Pro
Phe
Pro
Phe
Asn 300 Asp
Ser
Thr
Lys
Arg 380 Pro
Ser
Asn
Arg
Tyr 460 Glu
Glu
Glu
Ala
Asp 205 Met
Glu
Ser
Tyr
Asn 285 Leu
Trp
Arg
Leu
Asn 365 Gin
Glu
Thr
Val
Arg 445 Arg
Gly
Leu
Glu
Val 525
190
Leu
Trp
Thr
Glu
Pro 270 Phe
Ala
Pro
Leu
Arg 350 Gly
Lys
Arg
Val
Ala 430 Leu
Thr
Trp
Pro
Arg 510 Arg
Leu
Asp
Tyr
Pro 255 Gin
His
Arg
Asn
Gly 335 Gly
Glu
Asp
Thr
Glu 415 Ala
lie
Tyr
Leu
Arg 495 Val
Leu
Phe
Arg
Ala 240 Gly
Leu
Leu
lie
Trp 320 Glu
Thr
lie
Arg
Pro 400 Pro
Gin
Ala
Arg
Val 480 Gly
Gly
Asp
〈210> 9
〈211〉 1587
<212〉 腿 <213〉人工合成
〈400〉 9 atgtggtgga
gggg3Cgg3g
ggggtggacg gacgtggctg ctcctagagg acctccagcg gactggtaca ttcttcggcg ttcctccccg gaggtgatgc cttctcgccg atgtgggacc tacgtgcggg atggtggggg cacctgccct ctggcccgca gtcctcggca gtcgcggcca atcgggatga cagaaggacc atgcagtggg aaccccgact cacctggtgc cgcacctacc gccctgaacc ctctccaccc gagggcgtgg
aagaggcggt tgggggacct ccctctggct actactgcga aggcccacgc agcacccctg
tCtgg333g3
gccccgcctg agcagcccga gcttctggct aggacctcct ggggccgcca agatgcgcca agatctacct tcaacttcca tcgtggagga 3ccacgacca tgctcctttt agaacgggga gcctggggga acgscacccc acaagacccg gccgcctcat gggcgaggg3 tcacggaaaa acctggaccg cggtgcggct
catctaccag cgagggggtg ttcccccttc cgtggacccc cctagggctt gttcttggag ccccgctccg gaccctggac cctcaactgg caggcgcggg ctttcgggat cctccacatc ggtcctggac tccctacccc cctcatcttc gtacg卿gc gccccgtctc caccttgagg gatccccccg gcacaacctg cttcgcgggc g咖gtggcc cgccttgagg gggggtctac ggagaaggcc ggagg犯3gg
gtttatcccc cgcaggcggc
t3C3333gCC
gtcttcggga aaggtcctcg tcccgcgcct gacggcggcc gaggcgscgg cgaaaccccg gtggacggct gagcccggaa ttcaccgagg gagttctccg cagctcgtgc cgggggcttc ctcctcaccc gcctcccgcc ggcaccccca g卿3ggtgc cccccgggcc ttttccaccg gcccaggagc 33ggaccccg gcctacctcc ctggagcttc gtggggg腿
ggagcttcca ttccctacct ccatgaagga cccttcagga tggacctggt cccggaatag
CCCCC33Ca3
gccagtacta aggtgcggg3 tccgggtgga accccgactg accagccgga agcccgggcg gctactacca ccgactggag gctgggactg tgggggaggc cctggtacta aagaccccgc gggaccccga tggaaccctg aagacccccg acctcctcta ggggggsggg cgcgcggggg ggcttttctt
ggacacgaac caagtccttg cttcggttac ctttgaccgg gccgaaccac ccccaagcgg ctggcagagc cctccaccag ggccatttac cgtcctctgg gcgcccgggc gacctacgcc ggagcgggtg ggccgggtgc gcccgagaac gcccaactgg ccaggcccgg cggggacgag cgccctccgc gcggaccccc gcttcccgtg ctccatgctc cggggcctac gtggcttgtg gagggtggtc gcgcccggac
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1587
〈210〉 10
〈211〉 528
〈212〉 PRT
〈213〉 重組表達(dá)
〈400〉 10
Met Trp Trp Lys Glu Ala Val lie Tyr Gin Val 1 5 10
Gin Asp Thr Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu 20 25
Tyr Pro Arg Ser Phe 15
Glu Gly Val Arg Arg 30
Arg Leu
Pro Phe 50
Tyr Cys 65
Leu Leu
Val Pro
Ala Ser
Ala Pro 130 Pro Ala 145
Phe Leu
Glu Ala
Gly Phe
Arg Asp 210 Gly Arg 225
Tyr Val
Arg Glu
Val Arg
lie Phe 290 Val Glu 305
Val Leu
Ala Gin
Pro Thr
Pro Pro 370
Pro
35
Tyr
Asp
Glu
Asn
Arg 115 Asp
Trp
Pro
lie
Arg 195 Glu
His
Arg
Arg
Tyr 275 Arg
Glu
Gly
Tyr
Lys
Val
Glu
His 100 Asn
Gly
Thr
Glu
Tyr 180
Val
Pro
Leu
Glu
Val 260 Tyr
Gly
Tyr
Asn
Ala Arg
340 Trp Tyr 355
Glu Lys
Leu
Ser
Asp
Ala
85
Thr
Ser
Gly
Leu
Gin 165 Glu
Asp
Gly
His
Met 245 Met
Gin
Leu
Glu
His 325 Val
Tyr
Val
Lys
Pro
Pro
70
His
Ser
Pro
Pro
Asp 150 Pro
Val
Val
Asn
lie 230 Arg
Val
Ala
Pro
Ser 310 Asp
Ala
Gly
Gin
Ser
Met
55
Val
Ala
Ser
Lys
Pro 135 Glu
Asp
Met
Leu
Pro 215 Phe
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Gly
Gly
Asp 295 Leu
l>eu
40
Lys
Phe
Leu
Glu
Arg 120 Asn
Ala
Leu
Arg
Trp 200 Asp
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Val
Glu
Cys 280 Trp
Leu
Gly
Asp
Gly
Gly
His 105 Asp
Asn
Thr
Asn
Phe 185 Leu
Trp
Glu
Leu
lie 265 His
Arg
Thr
Gin Pro Arg Ala Asp
Asp 375
Met Leu
345 Glu lie 360
Pro Ala
Val
Phe
Thr
Leu
90
Pro
Trp
Trp
Gly
Trp 170 Trp
Leu
Arg
Asp
Asp 250 Tyr
Leu
Pro
Arg
Leu 330 Leu
Asp
Gly
Leu
75
Lys
Trp
Tyr
Gin
Gin 155 Arg
Leu
Ala
Pro
Gin 235 Glu
Leu
Pro
Glu
Trp 315 Ala
Ala
Tyr
60
Gin
Val
Phe
lie
Ser 140 Tyr
Asn
Arg
Glu
Gly 220 Pro
Phe
Pro
Phe
Asn 300 Asp
Ser
Leu
45
Asp
Asp
Leu
Leu
Trp 125 Phe
Tyr
Pro
Arg
Asp 205 Met
Glu
Ser
Tyr
Asn 285 Leu
Trp
Arg
Trp
Val
Phe
Val
Glu 110 Lys
Phe
Leu
Glu
Gly 190 Leu
Trp
Thr
Glu
Pro 270 Phe
Ala
Pro
Leu
Phe Thr
Gly Met Lys Ala
Leu
Arg 380
Leu Arg
350 Asn Gly 365
Gin Lys
Leu Ser
Ala Asp
Asp Arg
80 Asp Leu 95
Ser Arg
Asp Pro
Gly Gly
His Gin 160 Val Arg 175
Val Asp
Leu Phe
Asp Arg
Tyr Ala 240 Pro Gly 255
Gin Leu
His Leu
Arg lie
Asn Trp 320 Gly Glu 335
Gly Thr Glu lie Asp Arg
Leu Gly Glu His Asn Leu Pro Pro Gly Arg Asp Pro Glu Arg Thr Pro 385 390 395 400
Met Gin Trp Asp Asp Thr Pro Phe Ala Gly Phe Ser Thr Val Glu Pro
405 410 415
Trp Leu Pro Val Asn Pro Asp Tyr Lys Thr Arg Asn Val Ala Ala Gin
420 425 430
Glu Gin Asp Pro Arg Ser Met Leu His Leu Val Arg Arg Leu lie Ala
435 440 445
Leu Arg Lys Asp Pro Asp Leu Leu Tyr Gly Ala Tyr Arg Thr Tyr Arg
450 455 460
Ala Arg Glu Gly Val Tyr Ala Tyr Leu Arg Gly Glu Gly Trp Leu Val 465 470 475 480
Ala Leu Asn Leu Thr Glu Lys Glu Lys Ala Leu Glu Leu Pro Arg Gly
485 490 495
Gly Arg Val Val Leu Ser Thr His Leu Asp Arg Glu Glu Arg Val Gly
500 505 510
Glu Arg Leu Leu Phe Arg Pro Asp Glu Gly Val Ala Val Arg Leu Asp 515 520 52權(quán)利要求
1、一種α-葡萄糖苷酶，該α-葡萄糖苷酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列，或者對(duì)SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.6、SEQ IDNO.8或SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺失或添加而形成的α-葡萄糖苷酶活性不變的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的a-葡萄糖苷酶，其中，該a-葡萄糖苷酶具有 SEQ ID: N0.2所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO. 4所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO. 6所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO. 8所示的氨基酸序列，或者SEQ ID: NO. IO所示的氨基酸序列。
3、 編碼權(quán)利要求1所述的a-葡萄糖苷酶的基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，該基因具有SEQ ID: NO. 1所示核苷 酸序列，SEQ ID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 5所示的核苷酸 序列，SEQ ID: N0.7所示的核苷酸序列，SEQ ID: N0.9所示的核苷酸序 列，或者對(duì)SEQID: NO. 1、 SEQ ID: NO. 3、 SEQ ID: NO. 5、 SEQ ID:NO. 7或SEQ ID: N0.9所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代、缺 失或添加而得到的編碼活性不變的a-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，該基因具有SEQID: NO. 1所示的核 苷酸序列，SEQ ID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 5所示的核苷 酸序列，SEQ ID: N0.7所示的核苷酸序列或SEQID: NO. 9所示的核苷酸 序列。
6、 一種重組載體，該重組載體含有權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的基因。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中，該重組載體為重組質(zhì)粒。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其中，該重組載體為pGEM-TGlu 或pETGlu。
9、 一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的重組載體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
11、 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的重組宿主細(xì)胞，所述大腸桿菌為大腸桿菌 DH5a或大腸桿菌BL21 (DE3)。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞為保藏編 號(hào)為CGMCCNo. 2052的重組大腸桿菌DH5a (pGEM-TGlu)。
13、 一種a-葡萄糖苷酶的制備方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求9-12中 任意一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞。
全文摘要
α-葡萄糖苷酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列，或者對(duì)SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.6、SEQ IDNO.8或SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺失或添加而得到的α-葡萄糖苷酶活性不變的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼上述α-葡萄糖苷酶的基因、含有所述基因的重組載體和含有所述重組載體的宿主細(xì)胞，以及該α-葡萄糖苷酶的制備方法。本發(fā)明提供的α-葡萄糖苷酶能夠利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)，而且具有耐高溫(最適溫度95℃)和熱穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，還具有較強(qiáng)的蔗糖水解功能。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101392242SQ20071012192
公開(kāi)日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者成 周, 薛燕芬, 馬延和 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所