專利名稱：一種腈水合酶基因工程菌的構(gòu)建方法以及基因工程菌株和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種利用諾卡氏菌一大腸 桿菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建高效表達腈水合酶基因工程菌的方法以及所得到的基因工程 菌株和應用。
背景技術(shù)：
利用丙烯酰胺(Acrylamide，分子式為C3H5NO，結(jié)構(gòu)式為H2C=CHCONH2) 合成的各種類型的聚丙烯酰胺(PAM)在三次采油、水處理、造紙、采礦、冶金、 洗煤和制造高吸水性樹脂等工業(yè)生產(chǎn)中具有非常廣泛的應用。
丙烯酰胺的生產(chǎn)一般是以丙烯腈為原料，進行催化水合而成。丙烯酰胺的 生產(chǎn)經(jīng)歷了硫酸水合法、銅催化法、微生物法三個發(fā)展階段。由于微生物法具 有反應在常溫常壓下進行、能耗低、操作簡單、安全、丙烯腈轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物 濃度和純度高等優(yōu)點，與其他方法相比，微生物法具有明顯的優(yōu)勢。
在利用微生物法的最初階段，主要是篩選和馴化具有腈水合酶活性的菌株。 在微生物方面的主要進展有日本，山田秀明研究組在專利《生物學生產(chǎn)酰胺 的方法》(專利號ZL88106735))公開了一種野生玫瑰色紅球菌J-1 ，日本化 學工業(yè)株式會社在專利《利用微生物制備酰胺的方法》(專利號ZL86100062) 公開了一種紅球菌S-6、氧化節(jié)桿菌和黃色微桿菌，英國西巴特殊化學水處理 有限公司在專利《紫紅紅球菌菌株NCIMB41164及其生產(chǎn)腈水合酶的用途》(申 請?zhí)?00480035487.1)中公開了一種了紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突 變體，美國亞什蘭許可和知識產(chǎn)權(quán)有限公司在專利《腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅 球菌M33的培養(yǎng)方法》(申請?zhí)?00480043243.8)"中公開了一種紫紅紅球菌 M33，上海市農(nóng)藥所在專利《微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺》(申請?zhí)?3115536.7) 中公開了野生丙酸棒桿菌及其馴化菌株等不同的微生物進行丙烯酰胺的微生 物法生產(chǎn)。在生產(chǎn)方法方面，清華大學化工系公開了《一種應用膜技術(shù)的微生 物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丙烯酰胺的方法》(專利號ZL 03109806.1)，《提高腈水合酶產(chǎn)物 耐受性的定向培育法》(專利號ZL 03130658.6)和《葡萄糖一Cc^+耦合補加
發(fā)酵制備腈水合酶的工藝方法》(專利號ZL 03121944.6);河南焦作多生多化
工股份有限公司公開了《微生物凝聚法生產(chǎn)丙烯酰胺的方法》(申請?zhí)?br> 200410010364.4);德國施托克豪森公司公開了《用一種生物催化劑制備一種 丙烯酰胺水溶液的方法》(申請?zhí)?2808905.7);《傅里葉變換紅外在線測量 丙烯腈和丙烯酰胺》等等。在轉(zhuǎn)化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺的基因研究方面，日本 三菱化成株式會社對來自根瘤菌屬的腈水合酶基因和蛋白申請了專利《具有腈 水合酶活性的新型蛋白和編碼該蛋白的基因》(申請?zhí)?3106122.9);三井化 學株式會社對來自嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及編碼它的 基因申請了專利《參與活化腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因》(專利號 ZL99106291.4);《新型腈水合酶》(專利號02156180.X)，并研究了該基因在 重組大腸桿菌中的表達；德國底古薩股份公司申請了《紅球菌屬的腈水合酶》 (申請?zhí)?00580008206.8);日本三菱麗陽株式會社公開了《改良型腈水合 酶》(申請?zhí)?00580016665.0)，提供了對腈水合酶基因進行定點突變來提高 耐熱性的方法；清華大學從諾卡氏菌中克隆獲得了腈水合酶基因并申請了專利 《一種腈水合酶及其編碼基因與應用》(專利號ZL 200410042576.0)，進一 步對該基因在重組大腸桿菌中的突變和高表達進行了研究。
諾卡氏菌和紅球菌屬于革蘭氏陽性菌株，具有比較厚的細胞壁。同時，作 為腈代謝酶系的天然表達菌株，諾卡氏菌和紅球菌中還可能存在某些分子伴侶， 或良好的氧化還原環(huán)境，使得胞內(nèi)表達的腈水合酶與重組大腸桿菌相比，具有 更高的熱穩(wěn)定性和底物、產(chǎn)物耐受性。為此，采用諾卡氏菌和紅球菌宿主進行 腈水合酶基因的過表達在工業(yè)生產(chǎn)中具有更廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種高效表達腈水合酶的基因工程菌的構(gòu)建方法。 本發(fā)明目的之二是提供高效表達腈水合酶的基因工程菌株。 本發(fā)明目的之三是提供利用腈水合酶基因工程菌株生產(chǎn)丙烯酰胺的方法。 本發(fā)明一種高效表達腈水合酶基因工程菌的構(gòu)建方法，主要是利用諾卡氏 菌一大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pNV18和pNV19，既含有諾卡氏菌/紅球菌的復制起點 pAL5000，又含有大腸桿菌的復制起點，因此既可以在諾卡氏菌/紅球菌中表達， 又可以在大腸桿菌中表達的特點；可以方便地在重組大腸桿菌中實現(xiàn)對外源基 因的重組改造，然后轉(zhuǎn)移至重組諾卡氏菌/紅球菌中進行目標基因的表達。
本發(fā)明一種高效表達腈水合酶基因工程菌的構(gòu)建方法，按照如下步驟進行:
(1) 根據(jù)目的啟動子基因的DNA序列設(shè)計引物，以含有目的啟動子基因
的DNA為模板進行PCR方法擴增，得到啟動子基因； —
(2) 將啟動子基因與諾卡氏菌一大腸桿菌穿梭質(zhì)粒分別進行雙酶切，36 38"C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再用T4DNA連接酶在3 5'C進行連接 反應14 16h，得連接反應物；
(3) 將連接反應物轉(zhuǎn)化宿主菌E co//JM109感受態(tài)細胞，涂布LB平板(卡 那霉素抗性基因kan+)，挑選陽性克隆，并進行培養(yǎng)，然后提取小量質(zhì)粒進行 酶切驗證，可得帶有目的啟動子基因的諾卡氏菌一大腸桿菌穿梭質(zhì)粒；
(4) 根據(jù)腈水合酶基因序列設(shè)計上、下游引物，并以具有原始腈水合酶基 因的諾卡氏菌Mxw^'a YS-2002的總DNA為模板進行PCR擴增，得腈水合酶 的DNA序列；然后用和萬am/ZI進行雙酶切，再用T4連接酶將腈水合酶 DNA序列插入大腸桿菌質(zhì)粒pET28，獲得重組質(zhì)粒pET28-NHase;再用試劑盒 定點突變方法將J5青水合酶基因的a亞基起始密碼子g《突變?yōu)閃g，獲得突變腈 水合酶基因NHaseM;
(5) 以步驟(4)獲得的突變腈水合酶基因NHaseM的DNA序列為模板進 行PCR擴增，獲得突變腈水合酶基因NHaseM的DNA序列，然后用BamM和 ///m/III對突變腈水合酶基因NHaseM與諾卡氏菌一大腸桿菌穿梭質(zhì)粒進行雙酶 切，36 38"C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再用T4DNA連接酶在3 5t: 進行連接反應14-16 h，得連接反應物；
(6) 將步驟(5)連接反應物轉(zhuǎn)化宿主菌E co"JM109感受態(tài)細胞，然后 涂布在LB平板(Kan+)培養(yǎng)基上，挑選陽性克隆，并在LB培養(yǎng)基中37。C過 夜培養(yǎng)，然后提取小量質(zhì)粒進行酶切驗證，可得帶有目的啟動子基因及突變腈 水合酶基因NHaSeM的穿梭質(zhì)粒；
(7) 將步驟(6)所得穿梭質(zhì)粒以電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主細胞，即獲得具 有目的啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM的基因工程菌。
上述構(gòu)建方法步驟(1)中所述的目的啟動子基因為酰胺酶啟動子基因或大 腸桿菌tac啟動子基因。
上述構(gòu)建方法中所述的酰胺酶啟動子基因，其一35區(qū)和一IO區(qū)序列分別 為TTGTGG和TAACGT;它來自諾卡氏菌iVocaWfa YS-2002，用上游引物
CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT和下游引物CGGGATCCCTAGGAC TCCTTAGTGACT,以諾卡氏菌iVocara /a YS-2002的DNA為模板進行PCR擴 增可得酰胺酶啟動子基因。 '
上述構(gòu)建方法中所述的大腸桿菌tac啟動子基因，其一35區(qū)和一IO區(qū)序列 分別為TTGACA和TATAAT。大腸桿菌tac啟動子基因來自質(zhì)粒pMAL-p2x (美國NEB公司)，以上游引物CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT和下 游引物CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT為擴增引物，以質(zhì)粒pMAL-p2x 的DNA為模板進行PCR擴增可得大腸桿菌tac啟動子基因。
上述構(gòu)建方法步驟(2)中所述的諾卡氏菌一大腸桿菌穿梭質(zhì)粒為諾卡氏菌 一紅球菌穿梭質(zhì)粒pNV18或pNV19(pNV18: DDBJ數(shù)據(jù)庫，AB267085; pNV19: DDBJ數(shù)據(jù)庫，AB267086)及其衍生質(zhì)粒。
所述的衍生質(zhì)?？梢允莗NV18.1等。
上述構(gòu)建方法步驟〈2)中酶切產(chǎn)物的純化可以采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒 或其它分子克隆中常用的純化方法。
上述構(gòu)建方法步驟(4)中所述的腈水合酶基因是指來自于諾卡氏菌的原 始腈水合酶基因(Genbank: AY168347)或經(jīng)過突變、重排、缺失等方法獲得 的與來自諾卡氏菌的腈水合酶基因的DNA序列一致性大于等于70%、蛋白質(zhì) 序列一致性大于等于70%的同源基因。
上述構(gòu)建方法步驟(4 )中所述的試劑盒定點突變方法(ExSiteTMpCR-based site-directed mutagenesis kit, Stratagene, USA)見Yue SHI等(Enzyme and Microbial Technology, 2004， 35(6-7), 557-562);可將腈水合酶基因的a亞基起始 密碼子突變?yōu)?《，從而獲得突變腈水合酶基因NHaSeM。
上述構(gòu)建方法步驟(4)中所述的突變腈水合酶基是指a亞基起始密碼子 gfg突變?yōu)閃g的腈水合酶基因。
上述構(gòu)建方法步驟(3)中所述的目的啟動子基因的諾卡氏菌一大腸桿菌 穿梭質(zhì)粒為帶有酰胺酶啟動子基因或tac啟動子基因的pNV18質(zhì)粒及其衍生質(zhì) 粒。
上述構(gòu)建方法步驟(6 )中所述的穿梭質(zhì)粒為帶有酰胺酶啟動子基因或tac 啟動子基因及突變腈水合酶基因NHaseM的pNV18質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒。 上述構(gòu)建方法步驟(7)中所述的宿主為諾卡氏菌或紫紅紅球菌。
上述宿主所述的諾卡氏菌是諾卡氏菌Mx^^" YS-2002或其誘變株；其中 諾卡氏菌A^can/& YS-2002是發(fā)明人從來自勝利油田采集的菌株通過篩選得 至U; M caW/a YS-2002的誘變株可采用M c"n^ YS-2002在紫外燈下加入LiCl2 方法進行誘變獲得。
上述宿主所述的紫紅紅球菌是紫紅紅球菌i /20^ cocc^ r/w必c/ nmy ATCC 33278 (在美國菌種保藏中心保藏)或其馴化株或誘變株。
上述構(gòu)建方法步驟(7)中所述的獲得具有目的啟動子和突變腈水合酶基 因的基因工程菌可以是諾卡氏基因工程菌或紫紅紅球菌基因工程菌。
利用上述構(gòu)建方法所得的腈水合酶基因工程菌株，攜帶tac啟動子基因或酰 胺酶啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM。
上述腈水合酶基因工程菌株中所述的突變腈水合酶基因是指a亞基起始密 碼子突變?yōu)?《的腈水合酶基因。
上述腈水合酶基因工程菌株，攜帶tac啟動子基因和突變腈水合酶基因 NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株是諾卡氏菌TH-l， A^w^a，于2007年7月 12日保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物保藏中心，菌種保藏登記號 為CGMCC No. 2104，它帶有tac啟動子和突變腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株是紫紅紅球菌TH-2，兄A^foWraws，于2007 年7月12日保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物保藏中心，菌種保藏 登記號為CGMCC No. 2105，它帶有tac啟動子和突變腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株，攜帶酰胺酶啟動子基因和突變腈水合酶基因 NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株是諾卡氏菌M>Cm^WpNV-Pa-NHM，它帶有酰 胺酶啟動子和突變腈水合酶基因NHaSeM。
上述腈水合酶基因工程菌株是紫紅紅球菌Ao必c/zraw/pNV-Pa-NHM，它帶 有酰胺酶啟動子和突變腈水合酶基因NHaSeM。
利用上述腈水合酶基因工程菌生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，按照如下步驟進行
(1)將在4T:保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培養(yǎng)基中，在28 3(TC、 搖床轉(zhuǎn)速為150 250轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)32 56小時，得到活化的腈水合酶 基因工程菌的菌液；其中所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏l(xiāng) 5g/L，蛋白胨7 10 g/L， KH2P04 0.5 0.75 g/L， K2HP04 0.5 0.75g/L， MgS04'7H20 0.5 1.0 g/L, pH7.5，其余為水；'
(2) 按照0.5 1.0%的體積百分比將步驟(1)的腈水合酶基因工程菌液接 種到裝有培養(yǎng)基的種子罐中，在28 3(TC、搖床轉(zhuǎn)速為200 300轉(zhuǎn)/min的條 件下培養(yǎng)32 48小時，得腈水合酶基因工程菌的種子液；所述的培養(yǎng)基的組成 比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏l(xiāng) 5g/L，蛋白胨7 10g/L， KH2P04 0.5 0,75 g/L， K2HPO40.5 0.75g/L， MgS04.7H20 0.5 1.0 g/L，泡敵0.2 0.3 g/L， pH7.5，其余為水；
(3) 按照5.0 10.0%的體積百分比將步驟(2)所得種子液轉(zhuǎn)接種到裝有培 養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在28 30°C、 pH7.5 8.5條件下培養(yǎng)36 48小時，得發(fā)酵 液；所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 40g/L，酵母膏5.0 10.0g/L，尿素 7.5 10.0g/L， KH2P04 0.5 1.0 g/L， K2HPO40.5 1.0 g/L， MgS04.7H20 0.5 1.5 g/L，味精0.5 1.5 g/L, CoCl2 0.04 0.12 mM,丙烯酰胺2 6 mM，泡敵0.2 0.3g/L， pH7.5 8.5，其余為水；
(4).將發(fā)酵液稀釋為5 8g/L (干重)的菌液，然后用中空纖維微濾膜對 收獲的菌體進行微濾洗滌，清洗時采用正洗和反洗雙向反復操作直至洗滌液的 色度為5 20，蛋白質(zhì)濃度為3 10ppm;正洗壓力控制為0.06 0.1MPa，反洗 壓力控制為0.01 0.1MPa;再將菌液配成10 20g/L(干重)，體積分數(shù)5 8%， 打入水合反應釜，調(diào)節(jié)丙烯腈流量至0.5 1.0 mVh，然后向水合釜內(nèi)流加丙烯 腈，流加速度從高向低逐步調(diào)??；反應釜夾套通-5 -9'C冷凍鹽水或液氨，在 16 26°C， pH6.7 7.5條件下進行水合反應l 3小時；接著用循環(huán)泵將水合液 打入中空纖維超濾膜分離系統(tǒng)，用正洗和反洗方法反復操作濾去水合液中的細 胞雜質(zhì)和雜蛋白，直至水合液的色度為5 15，蛋白質(zhì)濃度為5 15ppm，得到 丙烯酰胺水合液。
上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法步驟(1)中所述的腈水合酶基因工程菌是指諾卡 氏菌M caWa/pNV-Pa-NHM、諾卡氏菌TH-1 、紫紅紅球菌/ . Aodoc/ira^/ pNV-Pa-NHM或紫紅紅球菌TH-2。
上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中所述的泡敵是聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚，可從 市場上購買。
上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中步驟(2)中當大量種子細胞形態(tài)為鏈球狀時，
結(jié)束種子培養(yǎng)，生物量約為3 6g/L。
上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中步驟(3)中至菌體形態(tài)為單個小球狀，生物量 ^8g/L，腈水合酶酶活^1850U/ml。 '
上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法步驟(4)中所述的腈水合酶基因工程菌細胞可以 重復使用3 8次。
上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中清洗時采用正洗和反洗雙向反復操作，是為了 防止堵塞。
上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法步驟(4)中當丙烯酰胺濃度達到25% 40% (W%V)，丙烯腈濃度小于O. 1% (W%V)，丙烯酸副產(chǎn)物s0.5y。 (W%V)時， 可停止水合反應。
本發(fā)明采用諾卡氏菌或紅球菌為宿主菌株，采用諾卡氏菌/紅球菌一大腸桿 菌穿梭質(zhì)粒高表達腈水合酶基因，通過穿梭質(zhì)粒上啟動子基因的篩選優(yōu)化及腈 水合酶基因的突變改造，提高重組菌株腈水合酶的活性、熱穩(wěn)定性和產(chǎn)物、底 物耐受性；采用基因重組諾卡氏菌或基因重組紅球菌游離細胞為催化劑，可實 現(xiàn)大宗化學品丙烯酰胺的微生物法生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果(1)本發(fā)明所得腈水合酶基因工程菌株腈水合 酶表達水平高；(2)本發(fā)明腈水合酶酶活水平高，熱穩(wěn)定性好，對丙烯腈和丙 烯酰胺耐受性好；(3)本發(fā)明方法生產(chǎn)的丙烯酰胺質(zhì)量高，適于工業(yè)化的生產(chǎn)。


圖l攜帶tac啟動子(Ptac)的腈水合酶表達穿梭質(zhì)粒pNV-PtaC-NHM的示意圖。
圖2攜帶酰胺酶啟動子(Pa)的腈水合酶表達穿梭質(zhì)粒pNV-Pa-NHM的示意圖。
具體實施例方式
實施例1
攜帶tac啟動子的穿梭質(zhì)粒pNV18-Ptac-NHM的構(gòu)建
以質(zhì)粒pMAL-p2x (美國NEB公司)為模板進行PCR擴增，上游引物為 CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT (下劃線部分為五coi I酶切位點)和下 游引物為CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT (下劃線部分為BamM酶切 位點)得到含有tac啟動子(一35區(qū)和一10區(qū)序列為TTGACA禾tlTATAAT)
的DNA序列；用￡coR I和B^n//1雙酶切tac啟動子基因和穿梭質(zhì)粒pNV18， 37"C反應過夜；將酶切產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，然后采用T4DNA連 接酶在《C進行連接反應14 h;將連接反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌JM109的感 受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，在LB培養(yǎng)基中37'C過夜培養(yǎng)后提取小量質(zhì)粒進行 酶切和電泳驗證，得到含有tac啟動子的穿梭質(zhì)粒；用BamM和///"dll雙酶切 所得的含有tac啟動子的穿梭質(zhì)粒，用T4DNA連接酶連接插入a亞基起始密碼 子突變?yōu)榈碾嫠厦富?突變方法見Yue SHI等，Enzyme and Microbial Technology，2004，35(6-7),557-562)，轉(zhuǎn)化￡. co/z'JM109的感受態(tài)細胞，挑選陽性 克隆，在LB培養(yǎng)基中37"C過夜培養(yǎng)后提取小量質(zhì)粒進行酶切和電泳驗證，驗 證正確的穿梭質(zhì)粒即為攜帶tac啟動子的突變腈水合酶基因表達穿梭質(zhì)粒 pNV-Ptac-NHM (見圖1)。 實施例2
攜帶酰胺酶啟動子(Pa)的穿梭質(zhì)粒pNV18-Pa-NHM的構(gòu)建 以發(fā)明人實驗室馴化篩選的諾卡氏菌YS-2002 (保存在清華大學 化工系生物化公所生物信息與生物催化工程實驗室)的總DNA為模板進行PCR 擴增，上游引物CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT (下劃線部分為五coi I 酶切位點)和下游引物CGGGATCCCTAGGACTCCTTAGTGACT (下劃線部分 為BamM酶切位點)，獲得酰胺酶啟動子基因Pa的DNA序列；用I和 雙酶切Pa和穿梭質(zhì)粒pNV18， 37'C反應過夜；將酶切產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物 回收試劑盒純化后，在fC采用T4 DNA連接酶進行連接反應14 h。將連接反 應物轉(zhuǎn)化宿主菌E co/ZJM109感受態(tài)細胞，涂布LB平板(Kan+)，挑選陽性克 隆，進行搖瓶培養(yǎng)12h。收獲細胞，提取小量質(zhì)粒進行酶切和電泳驗證，得含 有pa的質(zhì)粒；用B"mM和///mffll雙酶切含有pa的質(zhì)粒、用T4DNA連接酶連 接插入a亞基起始密碼子gtg突變?yōu)閍tg的腈水合酶基因(突變方法見Yue Sffl 等，Enzyme and Microbial Technology,2004,35(6-7),557-562)，轉(zhuǎn)化￡. co//JM109 的感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，搖瓶培養(yǎng)后提取小量質(zhì)粒再次進行酶切和電泳 驗證。驗證正確的穿梭質(zhì)粒即為攜帶Pa啟動子的突變腈水合酶基因表達穿梭質(zhì) 粒pNV-Pa-NHM (見圖2)。 實施例3
基因重組諾卡氏菌TH-1的構(gòu)建
將實施例l構(gòu)建的帶有tac啟動子和突變腈水合酶基因高表達穿梭質(zhì)粒 pNV-Ptac-NHM以電穿孔法轉(zhuǎn)化諾卡氏菌7Vo^r^ YS-2002的感受態(tài)細胞，可得 基因重組諾卡氏菌TH-1。其中，諾卡氏菌感受態(tài)細胞的制備采用《分子克隆指 南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉賽爾著)中革蘭氏陽性菌感受態(tài)細胞的制備方法。 取1^1純化后的質(zhì)粒于一個1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電轉(zhuǎn)杯一起置 于冰上預冷；將50pl制備好的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混 勻，冰上放置10min;打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)節(jié)電壓為1250V;將穿梭質(zhì)粒和感受態(tài) 細胞的混合物轉(zhuǎn)移至已預冷的電轉(zhuǎn)杯中，輕輕敲擊使得混合物均勻進入電轉(zhuǎn)杯 的底部，同時注意混合物中不能有氣泡。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)化儀，按下電擊鍵， 聽到蜂鳴聲后，向杯中迅速加入80(^1的SOC液體培養(yǎng)基(配方見《分子克隆 指南》)，重懸細胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。置于28。C， 220rpm搖床培養(yǎng) 2h;取200pl菌液涂布于含有20pg/ml卡那抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板，放入 28。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 72小時后出現(xiàn)重組諾卡氏菌的單菌落，得基因重組諾卡氏 菌Mxw^'fl/pNV-Ptac-NHM，菌株名為TH-1。
實施例4
基因重組紅球菌TH-2的構(gòu)建
將實施例1所得PNV-Ptac-NHM穿梭質(zhì)粒以電傳孔法轉(zhuǎn)化宿主細胞紅球菌 兄Ao^ cArawATCC 33278，其中電轉(zhuǎn)化方法同實施例3，獲得基因重組紅球菌 Ao^c/zraz^/pNV-Ptac-NHM，菌株名為TH國2。 實施例5:
諾卡氏菌TH-1腈水合酶的表達試驗
采用500ml帶擋板的三角搖瓶，裝培養(yǎng)基的量為10%，將實施例3所得諾 卡氏菌TH-1和諾卡氏菌7Vocw^aYS-2002 (簡稱"野生菌")在28。C搖床分批. 培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)92小時。所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖 20g/L，酵母膏5g/L,尿素7.5g/L， KH2P04 0.5g/L， K2HPO40.5g/L， MgS04'7H20 0.5g/L，泡敵0,2g/L， pH值為7.5， 二價鈷離子40ppm，其余為水；結(jié)果表明， 采用tac啟動子表達腈水合酶的重組諾卡氏菌的生長情況與原始菌株基本一致， 酶活表達情況則有所不同。在發(fā)酵培養(yǎng)48小時，重組菌的酶活達到2939U/ml， 而野生菌酶活為2711U/ml，重組菌酶活比野生菌提高了 8.4%;發(fā)酵培養(yǎng)72小 時，重組菌酶活(3331U/ml)比野生菌(2838U/ml)提高17.4%。繼續(xù)發(fā)酵培 養(yǎng)到92小時，重組菌酶活高達4015U/ml。其中，腈水合酶的酶活檢測采用標 準的氣相色譜內(nèi)標法，酶活的國際單位定義為每分鐘催化生成lmnol丙烯酰
胺所需的酶量；lMmol丙烯酰胺/ (mirrml菌液)=lU/ml。 實施例6
紫紅紅球菌TH-2腈水合酶基因的表達試驗
將實施例4所得基因重組紫紅紅球菌TH-2進行72h搖瓶培養(yǎng)，并以原始野 生菌株Z . ^zofifoc/zra船ATCC 33278為對照，在28。C、搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min條 件下培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨 7g/L， KH2P04 0.5 g/L， K2HPO40.5g/L， MgS04'7H20 0.5g/L， pH7.5，甲基丙烯 酰胺0.2g/L，其余為水。結(jié)果表明，野生紫紅紅球菌的腈水合酶活性很低，總 酶活僅為49U/ml，但重組紫紅紅球菌TH-2的總酶活提高到352U/ml，比野生 菌株提高了約7.2倍。
實施例7、
利用諾卡氏菌TH-1生產(chǎn)丙烯酰胺的試驗
挑取諾卡氏菌TH-1固體平板上光滑、濕潤的單菌落，接種在50ml種子培 養(yǎng)基中(500ml搖瓶)中，28'C培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min (所述培養(yǎng)基的 組成比例為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10 g/L，KH2P04 0.5 g/L，K2HP04 0.5g/L， MgSO4'7H2O0.5g/L，pH7.5，其余為水)，得活化的諾卡氏菌TH-1;然 后以體積比為0.5%的接種量接種到500L種子罐中，攪拌轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/min，28。C 培養(yǎng)40hr，種子細胞形態(tài)變?yōu)殒溓驙?，結(jié)束種子培養(yǎng)(培養(yǎng)基組成同前)，以體 積比為10%的接種量轉(zhuǎn)接裝液量為3噸的5mS發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成比例 為葡萄糖30g/L，酵母膏5.0g/L，尿素7.5g/L， KH2P04 0.75 g/L, K2HPO40.75 g/L， MgS04'7H20 1.0 g/L，味精0.75 g/L, CoCl2 0.06 mM,丙烯酰胺4 mM，泡 敵0.2g/L， pH7.5，其余為水)，28'C條件下培養(yǎng)至40h時，菌體形態(tài)為單個小 球狀，生物量為10g/L，腈水合酶酶活為2780U/ml。
停止培養(yǎng)，將3噸發(fā)酵液稀釋到4噸，采用微濾膜洗滌細胞，正洗壓力壓 力約0.08MPa、反洗壓力約0.09Mpa;按照5%的體積分數(shù)配制細胞懸浮液，重 懸液的酶活力約為2300U/ml。調(diào)節(jié)初始丙烯腈流量1.0m3/11，向水合釜內(nèi)流加 丙烯腈，流加速度從高向低逐步調(diào)?。环磻獖A套通-5'C冷凍鹽水，保證水合 溫度維持在20。C左右，pH7.5， 2小時后測定丙烯酰胺濃度達到30% (W%V)， 結(jié)束水合反應。釆用循環(huán)泵將丙烯酰胺水溶液打入中空纖維超濾膜分離系統(tǒng)進 行超濾分離，結(jié)果得到30%的丙烯酰胺水溶液，外觀清澈透明；經(jīng)檢測雜蛋白
含量為8ppm，色度為10，丙烯腈濃度0.01% (W%V)，丙烯酸副產(chǎn)物濃度O.l %，是高質(zhì)量的丙烯酰胺水劑產(chǎn)品。
基因工程菌游離細胞反復使用6次后，腈水合酶顯著失活，將細胞離心、 收集后進行廢棄處理。
實施例8
利用紫紅紅球菌TH-2生產(chǎn)丙烯酰胺的試驗
按照實施例7所描述的方法，挑取基因重組紫紅紅球菌TH-2的單菌落，進 行搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，得到12g/L的重組紅球菌，腈水合酶 酶活為690 U/ml。收獲重組紅球菌游離細胞，按照實施例7所描述的方法，微 濾洗滌后，催化水合丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺。按照10%的體積分數(shù)配制細胞懸浮 液，重懸液的酶活力約為1000U/ml。調(diào)節(jié)初始丙烯腈流量1.0mVh，向水合釜 內(nèi)流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步調(diào)小。反應釜夾套通-5°。冷凍鹽水，保 證水合溫度維持在2(TC左右，pH7.5， 2小時后測定丙烯酰胺濃度達到20% (W%V)，結(jié)束水合反應。采用循環(huán)泵將丙烯酰胺水溶液打入中空纖維超濾膜 分離系統(tǒng)進行超濾分離，結(jié)果得到20%的丙烯酰胺水溶液，外觀清澈透明，雜 蛋白含量為15ppm，色度為20，丙烯腈濃度0.08% (W%V)，丙烯酸副產(chǎn)物濃 度0.4%，是合格的丙烯酰胺水劑產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1、一種高效表達腈水合酶基因工程菌的構(gòu)建方法，按照如下步驟進行(1)根據(jù)目的啟動子基因的DNA序列設(shè)計引物，以含有目的啟動子基因的DNA為模板進行PCR方法擴增，得到啟動子基因； (2)將啟動子基因與諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒分別進行雙酶切，36～38℃反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再用T4 DNA連接酶在3～5℃進行連接反應14～16h，得連接反應物；(3)將連接反應物轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli JM109感受態(tài)細胞，涂布LB平板(kan+)，挑選陽性克隆，并進行培養(yǎng)，然后提取小量質(zhì)粒進行酶切驗證，可得帶有目的啟動子基因的諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒；(4)根據(jù)腈水合酶基因序列設(shè)計上、下游引物，并以具有原始腈水合酶基因的諾卡氏菌Nocardia YS-2002的總DNA為模板進行PCR擴增，得腈水合酶的DNA序列；然后用EcoRI和BamHI進行雙酶切，再用T4連接酶將腈水合酶DNA序列插入大腸桿菌質(zhì)粒pET28，獲得重組質(zhì)粒pET28-NHase；再用試劑盒定點突變方法將腈水合酶基因的α亞基起始密碼子gtg突變?yōu)閍tg，獲得突變腈水合酶基因NHaseM；(5)以步驟(4)獲得的突變腈水合酶基因NHaseM的DNA序列為模板進行PCR擴增，獲得突變腈水合酶基因NHaseM的DNA序列，然后用BamHI和HindIII對突變腈水合酶基因NHaseM與諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒進行雙酶切，36～38℃反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再用T4 DNA連接酶在3～5℃進行連接反應14-16h，得連接反應物；(6)將步驟(5)連接反應物轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli JM109感受態(tài)細胞，然后涂布在LB平板(Kan+)培養(yǎng)基上，挑選陽性克隆，并在LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，然后提取小量質(zhì)粒進行酶切驗證，可得帶有目的啟動子基因及突變腈水合酶基因NHaseM的穿梭質(zhì)粒；(7)將步驟(6)所得穿梭質(zhì)粒以電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主細胞，即獲得具有目的啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaseM的基因工程菌。
2、按照權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(1)中所述的目的 啟動子基因為酰胺酶啟動子基因或大腸桿菌tac啟動子基因。
3 、按照權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的大腸桿菌tac啟動 子基因，其一35區(qū)和一10區(qū)序列分別為TTGACA和TATAAT。
4、 按照權(quán)利要求l、 2或3所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(4)中 所述的腈水合酶基因為來自諾卡氏菌的腈水合酶基因或經(jīng)過突變、重排、缺失 等方法獲得的與來自諾卡氏菌的腈水合酶基因的DNA序列一致性大于等于70 %、蛋白質(zhì)序列一致性大于等于70%的同源基因。
5、 按照權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的突變腈水合酶基 因是a亞基起始密碼子gg突變?yōu)榈碾嫠厦富颉?br> 6、 按照權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中所述的穿 梭質(zhì)粒為帶有酰胺酶啟動子基因或tac啟動子基因的pNV18質(zhì)粒或pNV18衍 生質(zhì)粒。
7、 按照權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(6)中所述的穿 梭質(zhì)粒為帶有酰胺酶啟動子基因或tac啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM 的pNV18質(zhì)粒或pNV18衍生質(zhì)粒。
8、 按照權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(6)中所述的宿 主為諾卡氏菌或紫紅紅球菌。
9 、利用上述權(quán)利要求1 8任一所述的構(gòu)建方法所得的腈水合酶基因工 程菌株，其特征在于攜帶tac啟動子基因或酰胺酶啟動子基因和突變腈水合酶基 因NHaseM。
10、 按照權(quán)利要求9所述的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于所述的菌 株是諾卡氏菌TH-1，保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物保藏中心， 保藏登記號為CGMCC No. 2104。
11、 按照權(quán)利要求9所述的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于所述的菌 株是紫紅紅球菌TH-2，保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物保藏中 心，保藏登記號為CGMCC No. 2105。
12、 利用權(quán)利要求9、' 10或11所述的腈水合酶基因工程菌生產(chǎn)丙烯酰胺的 方法，按照如下步驟進行(1)將在4"C保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培養(yǎng)基中，在28 3(TC、 搖床轉(zhuǎn)速為150 250轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)32 56小時，得到活化的腈水合酶 基因工程菌的菌液；其中所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏 1 5g/L，蛋白胨7 10 g/L， KH2P04 0.5 0.75 g/L， K2HP04 0.5 0.75g/L，MgSO4'7H2O0.5 1.0g/L,pH7.5，其余為水；(2) 按照0.5 1.0%的體積百分比將步驟(1)的腈水合酶基因工程菌液接 種到裝有培養(yǎng)基的種子罐中，在28 3(TC、搖床轉(zhuǎn)速為200^300轉(zhuǎn)/min的條 件下培養(yǎng)32 48小時，得腈水合酶基因工程菌的種子液；所述的培養(yǎng)基的組成 比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏l(xiāng) 5g/L，蛋白胨7 10g/L， KH2P04 0.5 0.75 g/L， K2HPO40.5 0.75g/L， MgS04,7H20 0.5 1.0 g/L，泡敵0.2 0.3 g/L， pH7.5，其余為水；(3) 按照5.0 10.0%的體積百分比將步驟(2)所得種子液轉(zhuǎn)接種到裝有培 養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在28 30。C、 pH7.5 8.5條件下培養(yǎng)36 48小時，得發(fā)酵 液；所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 40g/L，酵母膏5.0 10.0g/L，尿素 7.5 10.0g/L， KH2P04 0.5 1.0 g/L, K2HPO40.5 1.0 g/L， MgS04.7H20 0.5 1.5 g/L，味精0.5 1.5 g/L, CoCl2 0.04 0.12 mM，丙烯酰胺2 6 mM，泡敵0.2 0.3g/L， pH7.5 8.5，其余為水；(4)將發(fā)酵液稀釋為5 8g/L (干重)的菌液，然后用中空纖維微濾膜對 收獲的菌體進行微濾洗滌，清洗時采用正洗和反洗雙向反復操作直至洗滌液的 色度為5 20，蛋白質(zhì)濃度為3 10ppm;正洗壓力控制為0.06 0.1MPa，反洗 壓力控制為0.01 0.1MPa;再將菌液配成10 20g/L(干重)，體積分數(shù)5 8%， 打入水合反應釜，調(diào)節(jié)丙烯腈流量至0.5 1.0 mVh，然后向水合釜內(nèi)流加丙烯 腈，流加速度從高向低逐步調(diào)??；反應釜夾套通-5 -9'C冷凍鹽水或液氨，在 16 26°C, pH6.7 7.5條件下進行水合反應l 3小時；接著用循環(huán)泵將水合液 打入中空纖維超濾膜分離系統(tǒng)，用正洗和反洗方法反復操作濾去水合液中的細 胞雜質(zhì)和雜蛋白，直至水合液的色度為5 15，蛋白質(zhì)濃度為5 15ppm，得到 丙烯酰胺水合液。
13、按照權(quán)利要求12所述的生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，其特征在于步驟(1) 中所述的腈水合酶基因工程菌是諾卡氏菌TH-1或紫紅紅球菌TH-2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腈水合酶基因工程菌的構(gòu)建方法，主要是利用諾卡氏菌/紅球菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒在諾卡氏菌/紅球菌和大腸桿菌中都能復制的特點構(gòu)建能高表達腈水合酶的重組穿梭質(zhì)粒，然后用電穿孔法轉(zhuǎn)化諾卡氏菌和紫紅紅球菌宿主獲得基因重組諾卡氏菌和基因重組紫紅紅球菌。應用該方法構(gòu)建了能高表達腈水合酶的諾卡氏菌TH-1和紫紅紅球菌TH-2，該菌株能高表達腈水合酶，并且酶活水平高，熱穩(wěn)定性好，對丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本發(fā)明還公開了利用基因工程菌株生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，用該方法生產(chǎn)的丙烯酰胺質(zhì)量高。
文檔編號C12N15/09GK101186911SQ20071012204
公開日2008年5月28日 申請日期2007年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日
發(fā)明者于慧敏, 劉昌春, 沈忠耀 申請人:清華大學