專利名稱：米根霉無載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物與細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是利用米根霉細(xì)胞在攪拌培養(yǎng)體 系中具有聚集、凝絮形成菌絲球的傾向，不借助細(xì)胞固定化介質(zhì)而實施米根霉無載體固 定化細(xì)胞培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
作為重要的有機(jī)酸之一，乳酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、化工等領(lǐng)域。L-乳 酸在食品工業(yè)中的使用是絕對安全的，因此世界衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)使用L-乳酸取代目前廣泛使用的DL-乳酸。L-乳酸的聚合物——聚L-乳酸(PLA)是無毒高分子 化合物，具有生物相容性，聚L-乳酸是良好的綠色材料，對消除"白色污染"具有極其 重要的意義。因此近年來L-乳酸的生物轉(zhuǎn)化逐漸受到人們的重視。在眾多的產(chǎn)乳酸微生 物中，米根霉(W力&o;^s 由于具有營養(yǎng)消耗簡單、產(chǎn)物易于分離等特點而成
為生產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的理想菌株，但是由于細(xì)胞培養(yǎng)控制方面技術(shù)不成熟，工業(yè)生 產(chǎn)受阻。
固定化細(xì)胞培養(yǎng)(cell immobilization culture)是20世紀(jì)50年代興起的一種新 型生物技術(shù)，是指利用物理或化學(xué)手段將游離的細(xì)胞或酶與固態(tài)的不溶性載體相結(jié)合， 使其保持活性并可反復(fù)使用的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)分批游離發(fā)酵相比，利用固定化微生物 技術(shù)具有細(xì)胞負(fù)荷高、生物催化高效、細(xì)胞可反復(fù)使用等優(yōu)點，并可得到高的目標(biāo)產(chǎn)量 和原料轉(zhuǎn)化率，易于實現(xiàn)細(xì)胞與產(chǎn)物分離，有利于實現(xiàn)工藝過程的自動化、連續(xù)化，降 低生產(chǎn)成本，具體表現(xiàn)在(l)生物反應(yīng)器中可以獲得極高的菌體濃度，因而發(fā)酵速率 可以大大提高，反應(yīng)器設(shè)備的生產(chǎn)強度得以強化；(2)產(chǎn)物分離純化過程中菌體從發(fā)酵 液中的分離十分容易；(3)固定化細(xì)胞可以重復(fù)或長期使用，這樣既能夠簡化游離細(xì)胞 過程需要不斷培養(yǎng)菌體的操作，又減少了營養(yǎng)物質(zhì)的浪費，提高了生產(chǎn)率。在各種固定化技術(shù)中，天然高分子和合成高分子材料的吸附和包埋是研究最為活躍 的微生物細(xì)胞固定化方法，米根霉的固定化發(fā)酵方面也是如此。米根霉的固定化方法主 要有聚氨酯泡沫吸附法和海藻酸鈣微膠囊法等。
固定化細(xì)胞技術(shù)與游離細(xì)胞過程相比具有多方面的突出優(yōu)點。然而，傳統(tǒng)的固定化 細(xì)胞技術(shù)均通過使用各種載體材料，以包埋、吸附、交聯(lián)等方式實現(xiàn)細(xì)胞固定化。載體 材料的使用隨之帶來了許多細(xì)胞生理、生態(tài)、工藝、工程和經(jīng)濟(jì)方面的問題，主要體現(xiàn) 在(l)在生理方面，載體材料有時會對細(xì)胞產(chǎn)生比較大的生理毒性，影響目標(biāo)代謝產(chǎn) 物的生物合成；(2)在生態(tài)方面，載體材料使細(xì)胞或小細(xì)胞群體相互分隔，容易形成不 利于細(xì)胞之間彼此協(xié)調(diào)的環(huán)境，影響代謝產(chǎn)物的生物合成；(3)在工藝方面，載體固定 化細(xì)胞的大規(guī)模制備過程復(fù)雜，容易引起雜菌污染；(4)在工程方面， 一方面載體固定 化細(xì)胞的傳質(zhì)性能較差，外部營養(yǎng)基質(zhì)和內(nèi)部代謝產(chǎn)物濃度梯度較大，致使其整體活性 較低，另一方面生物反應(yīng)器中流體流動的沖刷和代謝過程內(nèi)部產(chǎn)生氣體的脹裂還會造成 載體固定化細(xì)胞的破裂，影響其連續(xù)使用的壽命；(5)在經(jīng)濟(jì)方面，載體材料的使用和 不斷消耗帶來了附加成本，使固定化細(xì)胞技術(shù)難以在傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)中推廣應(yīng)用。因此， 載體固定化細(xì)胞技術(shù)雖然已有近四十年的研究歷史，真正實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化成功應(yīng)用的 實例卻不多?；谝陨蠁栴}，人們提出了無載體固定化細(xì)胞技術(shù)(cell self-immobilized culture)。無載體固定化即利用細(xì)胞自絮凝形成的顆粒作為一種固定化細(xì)胞的方法，是 固定化細(xì)胞技術(shù)中全新的概念。與各種載體固定化細(xì)胞技術(shù)相比，這種無載體固定化細(xì) 胞技術(shù)具有非常突出的優(yōu)點，主要體現(xiàn)在(l)細(xì)胞的固定化方法非常簡單，可以在生 物反應(yīng)器中逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，不產(chǎn)生細(xì)胞固定化過程的附加成本；(2)不使用細(xì)胞生長和 代謝產(chǎn)物生物合成所需營養(yǎng)物質(zhì)以外的其它任何化學(xué)物質(zhì)，細(xì)胞的生理和生態(tài)環(huán)境不受 外來物質(zhì)的干擾和影響，有利于目標(biāo)代謝產(chǎn)物的順利合成；(3)自絮凝細(xì)胞顆粒內(nèi)部結(jié) 構(gòu)呈松散型，傳質(zhì)阻力很小，而且其顆粒內(nèi)部表面不斷自我更新，顆粒整體活性非常好； (4)在生物反應(yīng)器中一定的生理、生態(tài)、物理、化學(xué)和流體力學(xué)條件下，小顆粒的絮凝 和大顆粒的解離可以呈動態(tài)平衡，不存在載體固定化細(xì)胞的強度問題。綜上所述，無載 體固定化技術(shù)具有操作簡便、不消耗輔助材料、無附加成本、反應(yīng)器中菌體濃度高、發(fā) 酵強度大、連續(xù)使用壽命長等優(yōu)點，展示了良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。巴斯德(Louis Pasteur)最先在酵母培養(yǎng)中觀察到了凝絮作用，其現(xiàn)象是懸浮于液 體中的單細(xì)胞集成絮凝物或絲狀物，然后出現(xiàn)沉淀或漂浮。20世紀(jì)80年代初，K.Esser 等人率先提出利用某些具有強自身絮凝能力的菌株形成顆粒，以此作為一種固定化細(xì)胞
的方法，即利用細(xì)胞自絮凝形成的顆粒作為一種固定化細(xì)胞的無載體固定化細(xì)胞。近年 來，微生物絮凝的研究日益受到重視，這主要是由于在液體深層發(fā)酵后期，菌種良好的 絮凝性不僅可使發(fā)酵液澄清速度加快，提高細(xì)胞分離的性能，而且還可防止細(xì)胞自溶， 因此細(xì)胞絮凝性是評價菌種優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。米根霉深層發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，菌體形態(tài)復(fù)雜，多以絲狀、片狀、球體、團(tuán)狀、 絮狀、結(jié)塊等形態(tài)生長。米根霉菌體形態(tài)強烈的影響著發(fā)酵過程中傳質(zhì)、溶氧等性能， 對其有效的控制是發(fā)酵成功的關(guān)鍵因素之一。因此對米根霉細(xì)胞進(jìn)行無載體固定化細(xì)胞 培養(yǎng)具有重要理論和現(xiàn)實意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用霉菌細(xì)胞在攪拌培養(yǎng)體系中具有聚集、凝絮形成菌 絲球的傾向，通過控制菌絲球的形成及其粒徑分布，起到類似于載體固定化培養(yǎng)的目的， 米根霉無載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)方法。實現(xiàn)上述目的具體的發(fā)明方法如下所用菌種為適合產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的米根霉真菌(朋&op"s o玎幼e/AS 3. 819)， 米根霉(/ 力i加p"s ozy幼e/AS 3.819)由于具有產(chǎn)物光學(xué)純度高、營養(yǎng)消耗簡單、產(chǎn)物 易于分離等特點而成為生產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的理想菌株。所有原始孢子均為該菌株培 養(yǎng)成熟所得。所有發(fā)酵培養(yǎng)體系均采用機(jī)械攪拌罐，且選用直板攪拌槳，生物反應(yīng)器內(nèi)置旋轉(zhuǎn)濾器。取250 mL三角瓶內(nèi)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基斜面上生長2天的濃密黑色孢子， 采用無菌水制備孢子懸液，無菌接種于5L機(jī)械攪拌罐中，溫度為32'C,罐內(nèi)培養(yǎng)基采 用:葡萄糖120 g/L，硫酸銨((NH4)2S04) 4 g/L，磷酸二氫鉀(KH2P04) 0.3 g/L,磷酸 二氫鈉(NaH2P04) 0. 3 g/L ，硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 44 g/L，硫酸鎂(MgS04 7H20) 0.25 g/L，硫酸亞鐵(FeS04) 0.01 g/L，裝液系數(shù)為0. 75，發(fā)酵液總體積為3. 75L。確定孢子濃度超過106個/niL;控制2.0 L/ (L，min)通氣流量，促進(jìn)生成一定數(shù) 量的菌球體；控制攪拌轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/min，通過鈉與鉀離子比例為1: 1，有利于維持細(xì) 胞穩(wěn)態(tài)，并控制約105個孢子形成一個菌球體；待菌球體密度接近104個/L時，調(diào)控轉(zhuǎn) 速為800轉(zhuǎn)/min,并無菌添加1 g/L的甲基硅油材料，促使形成菌球體的形狀規(guī)則、大
小較均一，菌球體的平均粒徑控制在0.5畫至3.0ram的范圍內(nèi)，且呈正態(tài)分布。將形狀規(guī)則、粒徑均一，平均粒徑在0.5國至3.0mm范圍內(nèi)的菌球體從5L罐中無 菌轉(zhuǎn)接入50L罐內(nèi)，50L罐的培養(yǎng)基與5L罐的培養(yǎng)基成分相同，且裝液系數(shù)均為0. 75， 迅速增加轉(zhuǎn)速至1200轉(zhuǎn)/min，增加通氣流量至3. 0 L/ (L min)，培養(yǎng)基與5L罐一致， 在第12小時實現(xiàn)菌球體的更細(xì)與10倍的擴(kuò)培，菌球體粒徑均勻，呈正態(tài)分布，且密度 約范圍內(nèi)，球體密度約104個/L。制得50L適于規(guī)?；磸?fù)發(fā)酵的米根霉無載體固定化 細(xì)胞。本發(fā)明的米根霉無載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)方法與常規(guī)米根霉培養(yǎng)方法相比，有益技術(shù) 效果體現(xiàn)在五個方面(1) 米根霉無載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)可以在生物反應(yīng)器中逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，不產(chǎn)生細(xì) 胞固定化過程的附加成本。(2) 不使用細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物生物合成所需營養(yǎng)物質(zhì)以外的其它任何化學(xué)物質(zhì)， 細(xì)胞的生理和生態(tài)環(huán)境不受外來物質(zhì)的干擾和影響，有利于目標(biāo)代謝產(chǎn)物的順利合成。(3) 本方法中懸浮培養(yǎng)體系所形成菌球體的形狀規(guī)則、大小較均一，菌球體的平 均粒徑控制在0.5mm至3.0mm的范圍內(nèi)；細(xì)胞集聚成菌球體的條件溫和、可控。(4) 菌球體細(xì)胞密度大于104個/L，細(xì)胞活力大于95%，發(fā)酵強度大，易于反復(fù)使 用，適于工業(yè)生產(chǎn)。(5) 發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸光學(xué)純度均在99.5%以上，滿足食品醫(yī)藥要求，完全適于制 備高質(zhì)量聚L-乳酸。


圖1為米根霉無載體固定化細(xì)胞，通過圖中可以看出菌球體呈現(xiàn)形狀規(guī)則、大小均 一的特征。圖2為不同平均直徑的菌球體顆粒正態(tài)分布圖，平均直徑以0. 4mm為間隔取近似值， 其中菌球體直徑在X土0.2mm范圍內(nèi)的默認(rèn)其直徑值為X，誤差項為人工計算百分比誤 差，通過圖中可以看出菌球體顆粒呈現(xiàn)正態(tài)分布。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。實施例
米根霉無載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)步驟如下(1) 米根霉孢子的準(zhǔn)備將米根霉菌株米根霉真菌(y 力i'zop^ o/yzae /AS 3.819)劃線接種于馬鈴薯葡萄 糖(PDA)平板，第一天設(shè)置培養(yǎng)溫度為32°C，相對培養(yǎng)濕度70%,利于菌絲生長，第 二天設(shè)置培養(yǎng)溫度為34'C，相對培養(yǎng)濕度為30%，利于孢子生成，待黑色濃密孢子完全 覆蓋白色菌絲后即可準(zhǔn)備收集，制得成熟米根霉孢子。(2) 米根霉孢子乳懸液的制備將250 mL三角瓶內(nèi)的所有米根霉孢子全部刮洗至無菌水中，之后接種于帶有直板 式攪拌槳的5 L發(fā)酵罐中，罐內(nèi)培養(yǎng)基采用葡萄糖120 g/L，硫酸銨((NH4)2S04) 4 g/L， 磷酸二氫鉀(K跳)0.3g/L，磷酸二氫鈉(NaH2P04) 0. 3 g/L ，硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 44 g/L，硫酸鎂(MgS04*7H20 ) 0. 25 g/L，硫酸亞鐵(FeSO》0.01 g/L，裝液系數(shù) 為0.75，發(fā)酵液總體積為3. 75L。利用血球計數(shù)板計數(shù)確保接種后的發(fā)酵罐中的孢子乳 懸液濃度超過106個/mL。其中鈉與鉀離子比例為l: l有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。制得米根 霉孢子乳懸液。(3) 米根霉無載體固定化細(xì)胞的培養(yǎng)調(diào)控溫度為32'C，剛開始米根霉孢子乳懸液中菌球體數(shù)目幾乎為零，孢子濃度約106個 /mL，此時控制2.0 L/ (L.min)通氣流量，控制攪拌轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/min，且培養(yǎng)基中 的鈉與鉀離子比例為l: 1，有利于菌球體數(shù)量的擴(kuò)增。在培養(yǎng)至12小時的時候，菌絲 球濃度約為103個/L，此時若不增加轉(zhuǎn)速，則菌球體直徑會急劇上升，且數(shù)目不增，因 此調(diào)控轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/min，控制約105個孢子形成一個菌球體，菌球體密度接近104個/1。 在第20小時至第24小時的培養(yǎng)過程中，無菌添加約4. Og的甲基硅油材料，使其濃度 約1.0g/L，促使形成菌球體的形狀規(guī)則、大小較均一，菌球體的平均粒徑控制在0. 5mm 至3.0mm的范圍內(nèi)，球體密度約104個/1，且顆粒直徑呈正態(tài)分布。制得較適于反復(fù)發(fā) 酵的米根霉無載體固定化細(xì)胞。(4) 米根霉無載體固定化細(xì)胞的擴(kuò)培采用無菌接種管，將形狀規(guī)則、粒徑均一，平均粒徑在0.5mm至3.0mm范圍內(nèi)的菌 球體從5L罐中無菌轉(zhuǎn)接入50L罐內(nèi)，溫度為32'C， 50L罐的培養(yǎng)基與5L罐的培養(yǎng)基成 分相同，且裝液系數(shù)均為0.75，迅速增加轉(zhuǎn)速至1200轉(zhuǎn)/min，增加通氣流量至3. 0 L/(L min)，培養(yǎng)基與5L罐一致，在第12小時實現(xiàn)菌球體的更細(xì)與10倍的擴(kuò)培，菌球 體粒徑均勻，呈正態(tài)分布，且密度約范圍內(nèi)，球體密度約104個幾。制得50L適于規(guī)模 化反復(fù)發(fā)酵的米根霉無載體固定化細(xì)胞，見圖1和圖2。
權(quán)利要求
1、米根霉無載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)米根霉孢子的準(zhǔn)備將米根霉菌株(Rhizopus oryzae/AS 3.819)劃線接種于馬鈴薯葡萄糖PDA平板，第一天設(shè)置培養(yǎng)溫度為32℃，相對培養(yǎng)濕度70％；第二天設(shè)置培養(yǎng)溫度為34℃，相對培養(yǎng)濕度為30％，待黑色濃密孢子完全覆蓋白色菌絲后即可準(zhǔn)備收集，制得成熟米根霉孢子；(2)米根霉孢子乳懸液的制備將250mL三角瓶斜面上的所有米根霉孢子刮下接種于帶有直板式攪拌槳的5L發(fā)酵罐中，利用血球計數(shù)板計數(shù)確保接種后的發(fā)酵罐中的孢子乳懸液濃度超過106個/mL，其中鈉與鉀離子比例為1∶1，制得米根霉孢子乳懸液；罐內(nèi)培養(yǎng)基包括下列重量配比的原料葡萄糖120g/L，硫酸銨4g/L，磷酸二氫鉀0.3g/L，磷酸二氫鈉0.3g/L，硫酸鋅0.44g/L，硫酸鎂0.25g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，罐內(nèi)裝液體總體積為3.75L，裝液系數(shù)為0.75；(3)米根霉無載體固定化細(xì)胞的培養(yǎng)調(diào)控上述米根霉孢子乳懸液，在溫度為32℃、通氣流量2.0L/(L·min)、攪拌轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/min、且培養(yǎng)基中的鈉與鉀離子比例為1∶1條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至12小時的時候，菌絲球濃度約為103個/L；此時增加轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/min，控制約105個孢子形成一個菌球體，菌球體密度接近104個/L；在第20小時至第24小時的培養(yǎng)過程中，無菌添加4.0g的甲基硅油材料，使其濃度為1.0g/L，促使形成菌球體的形狀規(guī)則、大小較均一，菌球體的平均粒徑控制在0.5mm至3.0mm的范圍內(nèi)，球體密度104個/L，且顆粒直徑呈正態(tài)分布，制得適于反復(fù)發(fā)酵的米根霉無載體固定化細(xì)胞；(4)米根霉無載體固定化細(xì)胞的擴(kuò)培將形狀規(guī)則、粒徑均一，平均粒徑在0.5mm至3.0mm范圍內(nèi)的米根霉無載體固定化細(xì)胞從5L罐中無菌轉(zhuǎn)接入50L罐內(nèi)，裝液系數(shù)均為0.75，50L罐的培養(yǎng)基與5L罐的培養(yǎng)基成分相同，在溫度為32℃、轉(zhuǎn)速至1200轉(zhuǎn)/min、通氣流量為3.0L/(L·min)條件下培養(yǎng)，在第12小時實現(xiàn)菌球體的更細(xì)與10倍的擴(kuò)培，菌球體粒徑均勻，呈正態(tài)分布，且密度約范圍內(nèi)，球體密度104個/L，制得50L適于規(guī)?；磸?fù)發(fā)酵的米根霉無載體固定化細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了米根霉無載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)方法，步驟如下(1)進(jìn)行高濃度孢子接種，形成濃的孢子懸乳液；(2)控制通氣條件，生成一定數(shù)量的菌球體；控制培養(yǎng)基中鈉與鉀離子比例，使米根霉菌絲球擴(kuò)增、保持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定；添加甲基硅油材料，形成一定直徑的菌球體細(xì)胞；菌球體截流，得米根霉無載體固定化細(xì)胞；(3)獲得的菌球體轉(zhuǎn)接大罐時，控制其菌球體的更新與數(shù)目的擴(kuò)增。本發(fā)明的優(yōu)點在于①懸浮培養(yǎng)體系中所形成菌球體的形狀規(guī)則、大小較均一，②細(xì)胞集聚成菌球體的條件溫和可控，③菌球體細(xì)胞密度大于10⁴個/L，細(xì)胞活力大于95％，④容易實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)，⑤可節(jié)約大量固定化載體成本。
文檔編號C12N1/14GK101157894SQ20071013151
公開日2008年4月9日 申請日期2007年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日
發(fā)明者姜紹通, 羽 朱, 李興江, 潘麗軍, 羅水忠, 志 鄭 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)