專利名稱：虎斑頸槽蛇解偶聯(lián)蛋白基因-sb及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及虎斑頸槽蛇解偶聯(lián)蛋白-SB(uncoupling protein-snake B, UCP-SB)分子克隆。
二背景技術(shù)：
線粒體的主要功能是參與能量代謝。當(dāng)線粒體進(jìn)行呼吸時(shí)，呼吸鏈傳遞電 子的同時(shí)，將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵到膜間隙，形成線粒體跨膜電位。質(zhì)子通過 驅(qū)動(dòng)ATP合成酶合成ATP，從而回到線粒體基質(zhì)，形成氧化與磷酸化的偶聯(lián)。 定位于線粒體內(nèi)膜的UCP能使線粒體膜間隙的質(zhì)子回漏到基質(zhì)中，從而降低線 粒體的膜電位，使氧化與磷酸化解偶聯(lián)。目前共發(fā)現(xiàn)5個(gè)UCP家族成員，由于 UCP4和UCP5與其余3個(gè)成員同源性較遠(yuǎn)，是否為UCP家族成員仍有爭論。
氧化磷酸化解偶聯(lián)是恒溫動(dòng)物產(chǎn)熱以維持自身體溫的機(jī)理之一。UCP1參與 恒溫動(dòng)物的非顫栗性產(chǎn)熱已得到公認(rèn)(Enerback S. et.al. Nature 387: 90 - 94,1997)。盡管有許多研究表明，UCP2和UCP3可能參與ATP的合成、調(diào)節(jié) 活性氧(reactive oxygen spicies， R0S)的生成、參與脂肪酸的代謝等 (Vidal-Puig AJ. et.al. J Biol Chem 275: 16258 - 16266, 2000. Arsenijevic D. et.al. Nat Genet 26: 435 - 439, 2000. Jos印h JW. et.al. J Biol Chem 279: 51049 - 51056， 2004. Jaburek M. et.al. J Biol Chem 279: 53097 - 53102， 2004)。但是，目前它們的功能仍有爭論。如果我們能夠?qū)ふ业経CP進(jìn)化的祖先， 明確其功能，然后沿動(dòng)物進(jìn)化路線，脊索動(dòng)物-圓口綱動(dòng)物-魚類-兩棲類-爬行類 -嚙齒類-人，逐一闡明不同進(jìn)化層次動(dòng)物UCP的功能，對(duì)我們了解變溫動(dòng)物向恒 溫動(dòng)物進(jìn)化過程中，UCP功能的變化，以及這種變化對(duì)變溫動(dòng)物向恒溫動(dòng)物進(jìn)化 的影響，無疑是有益的。UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫 瘤等(Zhang CY et al Cell 105: 745 - 755， 2001. Murrav AJ et al Lancet 364: 1786-1788, 2004. Mills EM et al J Biol Chem 277:27385-27392,2002)。 了解虎斑頸槽蛇(爬行類動(dòng)物)UCP的功能有助于我們更深刻理解哺乳類和人的 UCP的功能，因此，有助于我們以UCP作為靶點(diǎn)，制備治療這些疾病的藥物。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆虎斑頸槽蛇的UCP-SB基因并對(duì)其功能進(jìn)行研究?；哳i槽
蛇UCP-SB基因序列acgcgggggctcgtccgtctttctccgctgcccggctcgc
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本發(fā)明的技術(shù)解決方案:
虎斑頸槽蛇UCP-SB的分子克隆提取虎斑頸槽蛇肌肉的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。用簡并引物擴(kuò)增UCP片段，測序，經(jīng)同源性、保守序列等分析，以證實(shí)克 隆的片段為UCP家族成員。然后3' ，5' -RACE克隆全長序列，再次同源性、保 守序列等分析，以證實(shí)克隆的為UCP家族成員。
本發(fā)明首次從虎斑頸槽蛇肌肉中克隆了 UCP-SB基因。UCP與多種疾病相關(guān)。 如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤等。了解虎斑頸槽蛇UCP的功能，將有助于我 們更深刻理解哺乳類和人類UCP的功能。因此，有助于我們以UCP作為靶點(diǎn)，制 備治療這些疾病的藥物。具體實(shí)施例方式
提取虎斑頸槽蛇肌肉的總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用簡并引物從cDNA擴(kuò) 增UCP-SB片段，經(jīng)序列同源性比較后確定后，用3' ,5' -RACE擴(kuò)增出UCP-SB 全長序列。
材料與來源
試劑，Trizol購自Invitrogen公司;3' ,5' -RACE試劑盒(SMART1MRACE
cDNA Amplification Kit)購于Clontech公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶禾口 pMD18-T vector及應(yīng)用的酶類和試劑盒，除特殊標(biāo)明外，均購于大連寶生物工程有限公 司；引物合成及序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)完成。
手術(shù)器械剪刀，彎頭小鑷等購自江蘇思來科技有限公司。 材料及其它器材野生型虎斑頸槽蛇購自于南京夫子廟。HeidolphDIAX900 勻漿器；BIO-RAD公司PCR儀。 實(shí)施例
1、 虎斑頸槽蛇組織取材
實(shí)驗(yàn)用野生型虎斑頸槽蛇購于自于南京。處死后，取肌肉，用剪刀快速剪碎 后放于適量的Trizol中，于-8(TC保存?zhèn)溆谩?br> 2、 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄
將保存于Trizol中的虎斑頸槽蛇肌肉，用Heidolph DIAX900組織勻漿器 將其充分勻漿(4檔100秒)，將勻漿液轉(zhuǎn)入潔凈的1. 5ml離心管中，室溫放置5 分鐘后，12000g, 4'C離心5分鐘，取上清，加入200ul氯仿，強(qiáng)烈震蕩混勻， 室溫放置5分鐘，12000g, 4'C離心15分鐘，小心吸取上清至另一潔凈的1. 5ml 離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，12000g， 4'C離心 10分鐘，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥，適量DEPC水溶解，紫外分光 法定量。2pgRNA用于逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20ul，含2ugRNA， lmM dNTP， 1 U/u 1 RNA酶抑制劑，2. 5 pmol/u 1 Olig(dT) 18引物，0. 5 U/u 1 AMV逆轉(zhuǎn)錄 酶，輕輕混勻，42°C 1小時(shí)，冰上放置2分鐘，所得cDNA可用于PCR。
3、 虎斑頸槽蛇UCP-SB片段的克隆
將人、小鼠、斑馬魚、鯉魚等UCP2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，尋找保守序列設(shè) 計(jì)2對(duì)簡并引物。上游引物為5， -CTSCARMGKCAGATGAGCTT-3，，下游引物為 5， - GCAGGGRAGRTYRTCWGTCA-3，其中M:A-C; S: G-C; R: A-G; Y: C-T; K: G-T: W: A-T。
PCR為20 y 1反應(yīng)體系，含1 u 1 cDNA, 2 mM MgCU 0. 2函dNTP, 0. 025 U/ lUTag酶，2pmol/ul上、下游引物。反應(yīng)條件95。C5分鐘后，95。C30秒-46 。C2分鐘-72。C30秒(35個(gè)循環(huán))，72。C延伸10分鐘，電泳分析。
應(yīng)用寶生物工程(大連)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNA
Purification Kit Ver. 2. 0試劑盒(按說明書操作)切膠回收目的片段，然后 與pMD18-T vector連接(應(yīng)用Takara DNA Ligation Kit),反應(yīng)體系為pMD18-T vector lul，上述PCR產(chǎn)物0.2 pmol,加H20至5ul后，加入等量(5ul ) Ligation Mix,混勻，16。C反應(yīng)30分鐘，全量加入100 y 1 ToplO大腸桿菌感受 態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42。C90秒后，冰上放置l分鐘，加入890ul LB 培養(yǎng)基，37。C250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，取適量菌液涂布含有X-gal， IPTG和氨芐青 霉素的LB固體培養(yǎng)基，37t:過夜培養(yǎng)。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨芐青霉 素的LB培養(yǎng)基中37°C， 250rpm培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有 限公司UltmPureT"質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，按使用說明書操作。用Hand III 和Bam HI雙酶切和PCR鑒定后，對(duì)序列進(jìn)行測定。對(duì)序列進(jìn)行同源性和保守氨 基酸等分析證明，我們克隆的片段屬于UCP家族成員。根據(jù)此片段序列設(shè)計(jì)引物， 用于3' ,5' -RACE,以得到UCP全長序列。
4、 3， ，5， -RACE (SMART RACE cDNA Amplification Kit購于clontech 公司)
第一鏈cDNA的合成對(duì)于5， -RACE-Ready cDNA的合成，在離心管中配制 1 U g總RNA， 1 u 1 5， -CDS primer A， 1 u 1 SMART II A oligo，加水至體積為 5u 1;對(duì)于3， -RACE-Ready cDNA的合成，在離心管中配制1 u g總RNA， 1 u 1 3' -CDS primer A，加水至體積為5y 1;將上述2離心管混勻，7(TC處理2分 鐘后，冰上放置2分鐘。然后，向兩離心管中分別加入以下試劑，2ul 5X First-Strand Buffer, lul DTT(20mM), lul dNTP Mix(10mM)， 1 w 1 PowerScript ReverseTranscriptase,總體積為10yl，混勻，42。C孵育1.5小 時(shí)，分別加入100u 1 Tricine-EDTA Buffer, 72。C處理7分鐘后，-20。C保存?zhèn)?用。
PCR: 41. 5w IMaster Mix的配制5ul lOXAdvantage 2 PCR Buffer, 1 li ld,(lOmM), 1 u 1 50X Advantage 2 Polymerase Mix,混勻備用。5， -RACE: 在PCR管中配制2.5ul 5， -RACE-Ready cDNA， 5ul UPM(10X)， 1 u 1 GSP(10uM),序列為5' -GAGCCCTTGGTGTAGAAGTGCTT-3'，加入配好的 41.5ulMaster Mix,總體積50nl，混勻。3， -RACE:在PCR管中配制2. 5u 1
5， -RACE-Ready cDNA, 5ul UPM(10X)， lul GSP(IO u M),序列為5'-GACCATTGCCAAGGAAGAAGG-3'，加入配好的41. 5 u IMaster Mix,總體積50ul， 混勻PCR反應(yīng)條件95。C5分鐘后，94。C30秒-72。C2分鐘5個(gè)循環(huán)，94。C30秒 -70。C30秒-72。C2分鐘5個(gè)循環(huán)，94°C30秒-68。C30秒-72°C2分鐘25個(gè)循環(huán)， 然后72'C10分鐘，電泳分析。
應(yīng)用Clontech公司提供的Nucleo Trap Gel Extraction Trial Kit (按i兌 明書操作)切膠回收目的片段，然后與pMD18-T vector連接(應(yīng)用TaKaRa DNA Ligation Kit),反應(yīng)體系為pMD18-T vector lul，上述PCR產(chǎn)物0. 2 pmol, 力口H20至5ul后，加入等量(5yl ) Ligation Mix,混勻，16。C反應(yīng)30分鐘， 全量加入100ul ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42。C90秒 后，冰上放置1分鐘，加入890u 1 LB培養(yǎng)基，37。C250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，取適 量菌液涂布含有X-gal， IPTG和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37'C過夜培養(yǎng)。 挑取白色菌斑，加入3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37'C ， 250rpm培養(yǎng)過夜。 質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司UltraPur^質(zhì)粒DNA小量提取試劑 盒，按使用說明書操作。用Hand III和Bam HI雙酶切和PCR鑒定后，對(duì)序列進(jìn) 行測定。對(duì)序列進(jìn)行同源性和保守氨基酸等分析證明，該基因?qū)儆赨CP家族成員。 我們得到虎斑頸槽蛇的解偶聯(lián)蛋白基因，命名為UCP-SB。
虎斑頸槽蛇解偶聯(lián)蛋白-SB (uncoupling protein-snake B， UCP-SB)基因序列 <110>南京大學(xué)
〈120虎斑頸槽蛇解偶聯(lián)蛋白基因-SB及其應(yīng)用
<160>1
<210>1
<21>2476
<212>DNA
<213>虎斑頸槽蛇(Rhabdophistigrinus) <400>1
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1.一種虎斑頸槽蛇肌肉解偶聯(lián)蛋白-SB基因，其序列為acgcgggggc tcgtccgtctttctccgctg cccggctcgc ttgctcgctc gccccggacg ccgccgccgc cgcctctgcagcgcttcgct gggcgcttgg cttgccgcgt ttcttcaccc cccaccccga tggcagggtcaatattatga ttatttggtg ccccttttct ggccgtcttt ctatggccca ccgagggagctcggctgaac ttctgtccaa tcaatttgac aaatgggaaa cctttagaga cgcttgatcagagcgatcga gtcgatcctg acctacttga agaagagact gagtcgctct ctctggtctttcggttccca cgctcctcgg ccgcttctgc tggttgcttt tgaagccttc gctcgctcttctctgccctc cagtcgccat ggttggattc aagccctccg acatccctcc cacggccagcgtgaagtttt tgggagccgg gacggcggcc tgcatagctg acctcatcac cttccccctggacacggcaa aagtccggtt acagatccaa ggagagaaga aagccagcgt cgcccccaaaacgacgcagt accggggggt ctttggcacc atggccacca tggtgaagaa cgaggggccccggagcctct acaacgggtt ggtggccggt ctccagcgcc agatgagctt cgcctcggtccgcatcgggc tctacgactc ggtgaagcac ttctacacca agggctccga gcatgctggcgtagggagcc ggctccttgc tggttgcacc acgggggcca tggcggtcat ggtggcccagcccacggacg tggtcaaagt gcggttccag gcccaggtcc ggacagatgc tggccggcgctaccaaggca ctctgcatgc ctacaagacc attgccaagg aagaaggagt ccgaggcctgtggaaaggga ccctccccaa cgtttcgcga aacgccattg tgaactgcgc cgaactggtgacctatgaca tcatcaagga caccctgctc aagtaccgcc tcatgacaga cgacattccctgccacttcc tctccgcctt cggggccggc ttctgcacca ccatcatcgc ctcgccggttgatgtggtga aaaccaggta catgaattct ccccctgggc agtacaggaa cgccgggagatgcgccctcc ggatgctcca ggatgaagga cctctggcct tctacaaggg cttcacgccctcgtttcttc gcctgggatc ctggaacgtg gtgatgtttg tgacttacga acagctgaagcgggcactga tggcagcccg ggcatcgtgg gcaacgccat cctgagccga ccggcgaggcagttttcaaa cttctgctcc gatcctatcc atccatttcc ctcccttctc ctgacctgctgcgtttctac taaagctctg cggatttccc gttttttaaa atgttggcat ggttttaacgcttaacacgc gtctcggcct ggctgtagct gctgattcag gatctgcaga tattccttttatttttattt ttttaaagta atttatcttt gctggaccta caatcccatg caaagatgctttttaaaccc ctgctttaaa aagctggctg gagaagtctg ggagctgaag cccttcagacttgaagttgc aaaggttggg gaccctgctt taaaaagctg gctggagaag tctgggagctgaagtctttc agacttaaag ttgcaaaggt tggggacccc tgctttaaaa agctggctggagaagtctgg gagctgaagc ccttcagact taaagttgca aaggttgggg acccctgccctggaggatca aaggtactta atcttgcatt gaagtcttcc ttctgtcctt gcaccagccttgcacgcccc ttcaacaaaa agcgggatga atttcgttcc gcttgcacac tcggtttcccaaaaggcttc gcttggctcc cacgaattca attgaatttg ttcccttttg gggaattgggaaagaatcgt tttttcccac gcttgctagc ttcctagaag tctttttaaa aaatgcccaccttctccaga ttgctggcat ttggggaagg ggacggcgga gcagcccaaa atgtgttttgagatcccccc gcttggcttt caagtttctt cctcacattg caaagcttga attcagaccccctgaatcca gatttttttt ccccactctt gtcctttggg cagagctgat ttgacggatgatcggggttt tcaccgcact ttggttcggc tggcaaattt ggggagtggg gaacagaacaatggcactta ggaaaagctt tctttttttg tccgtgggcg agccctgctg tgaaattatttatgaggctg cgttgatgtt ttaaaacaga aaagaaaata cgcgctacga atgttgatttttttttttta aataaagctc aagcaaagaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述虎斑頸槽蛇解偶聯(lián)蛋白基因的克隆方法，其特征在于提取虎斑頸槽蛇肌肉總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)已經(jīng)克隆的其它物種解偶聯(lián)蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，從cDNA擴(kuò)增解偶聯(lián)蛋白基因片段，經(jīng) 序列同源性比較，確定其為解偶聯(lián)蛋白基因片段后，用3' ，5' -RACE擴(kuò)增出解 偶聯(lián)蛋白基因的全長序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述虎斑頸槽蛇解偶聯(lián)蛋白基因在制備治療糖尿病、心血管 疾病以及腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及虎斑頸槽蛇肌肉解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein-snake B，UCP-SB)分子克隆。本發(fā)明應(yīng)用簡并引物和3′，5′-RACE首次從虎斑頸槽蛇肌肉中克隆了UCP-SB基因。UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤。因此，以UCP作為靶點(diǎn)，可以制備治療這些疾病的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101177681SQ20071013449
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日 公開號(hào)200710134495.發(fā)明者侯冬霞, 孫國勛, 張峻峰, 張玉婧, 張紅杰, 張辰宇, 威 徐, 江雪源, 進(jìn) 王, 鄒季虹, 陳均遠(yuǎn), 陽 項(xiàng) 申請(qǐng)人:南京大學(xué)