專利名稱：一個水稻鋅指蛋白基因及其耐逆性基因工程應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻鋅指蛋白基因ZFP207及其耐逆性基因工程應(yīng)用，屬于基因 工程領(lǐng)域，具體地講涉及植物高鹽、低溫、干旱脅迫應(yīng)答的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。
背景技術(shù)：
TFIIIA型鋅指蛋白廣泛地存在于各種植物中，參與植物的生長發(fā)育與環(huán)境脅 迫應(yīng)答(黃驥等，2007)。在矮牽牛、擬南芥、小麥、棉花等植物中己經(jīng)先后克 隆了近40個TFIIIA型鋅指蛋白基因，研究結(jié)果表明其主要參與了植物在生殖生 長階段的發(fā)育過程，或參與高鹽、低溫、干旱等非生物脅迫反應(yīng)。大豆此類鋅指 蛋白SC0F-1的研究表明，在擬南芥和煙草中過量表達(dá)SC0F-7基因顯著增強(qiáng)了 冷誘導(dǎo)蛋白基因的表達(dá)，從而提高了植物的耐冷性(Kimetal, 2001)。擬南芥鋅 指蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植株中的過量表達(dá)則提高了耐旱和耐鹽性 (Sakamoto et al.,2004)。因此植物TFIIIA型鋅指蛋白對于改良植物對非生物脅迫 的抗性具有重要的應(yīng)用價值。
水稻是重要的糧食作物以及單子葉植物的模式植物，關(guān)于水稻TFIIIA型鋅指 蛋白基因的功能描述還非常有限(Huang etal., 2007)。本發(fā)明從水稻中鑒定了單 子葉植物第1個與高鹽、低溫和干旱脅迫同時相關(guān)的TFIIIA型鋅指蛋白基因 ZF尸207，并研究了其與各種脅迫的關(guān)系，提出了利用Z尸尸207基因進(jìn)行植物提高 綜合耐逆性的基因工程改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于公開水稻鋅指蛋白基因ZFP207及其耐逆性基因 工程應(yīng)用，該基因可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锏木C合耐逆性，以進(jìn)行植 物品種改良。 技術(shù)方案
水稻鋅指蛋白基因ZFPM7，其序列為SEQIDNO. 1。
水稻鋅指蛋白基因的耐逆性基因工程應(yīng)用，包括
1) 總RNA的提取
選用水稻品種"韭菜青"，待水稻幼苗長至3葉期后，用150mMNaCl進(jìn)行處理， 12小時后立即取葉片置于液氮中冷凍保存，取部分葉片，用研缽研碎，加入盛有裂 解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)，勻漿后移至1.5mLEP管 中，抽提總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定 RNA含量；
2) 水稻鋅指蛋白基因ZFPM7的克隆
根據(jù)水稻鋅指蛋白基因的全長編碼序列，設(shè)計兩端引物
上游引物CCTAATAC AC AC AC AC AAAG 下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG
以步驟l)獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR程序如下94"C預(yù)變性4分鐘，94。C變性30s,55。C復(fù)性lmin, 72。C延伸 2min， 33個循環(huán)后，72°C 10min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18-T載體，測序后 獲得具有完整編碼區(qū)的水稻鋅指蛋白基因ZF尸M7的cDNA序列SEQ ID NO. 1;
3) 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)水稻鋅指蛋白基因的cDNA序列，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引 物，并在上游引物上引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物序列同步驟2): 上游弓I物GGATCCTTCTACTCCTAATAC AC AC 下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG
以步驟2)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將的cDNA 克隆至中間載體pMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121 。
4) 轉(zhuǎn)基因植株的獲得
將步驟3)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙草，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn) 行PCR, Southern雜交以及RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的耐逆性評價，轉(zhuǎn)基因植株的T2 代和對照植株進(jìn)行耐逆性分析。
耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株幼苗和對照植株進(jìn)行400mM NaCl的持續(xù) 處理，在鹽處理5天后轉(zhuǎn)移到不含有NaCl的濕濾紙上繼續(xù)生長，處理后表現(xiàn)明顯優(yōu) 于對照組的轉(zhuǎn)基因煙草植株即為獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因植株(圖2);
耐冷性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的幼苗于4t:處理5d后，放 置于25t培養(yǎng)箱中恢復(fù)12h，恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組的植株即為耐冷性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植 株(圖3);
耐旱性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對照植株于300mM甘露醇中處理30 天后生長優(yōu)于對照組的植株即為耐旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。 有益效果
1、 本發(fā)明公開了一種水稻TFIIIA型鋅指蛋白基因(ZF尸207基因)及其所編碼的蛋白 質(zhì)。該基因來自水稻(0o;za^^'vaL.)，可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物耐鹽 性、耐冷性和耐旱性，以進(jìn)行植物品種改良，所編碼的蛋白質(zhì)具有耐逆功能。
2、 本發(fā)明人提供的ZF戶207基因功能是參與植物的高鹽、低溫和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)， 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time RT-PCR)分析表明ZF尸M7基因在高鹽 (150mMNaCl)、低溫(4'C)和模擬干旱(20%PEG6000)誘導(dǎo)條件下表達(dá)增強(qiáng)。
3、 本發(fā)明的ZFi^07基因來自水稻，具有適合于水稻等單子葉植物表達(dá)的優(yōu)化密碼子， 其基因工程受體植物除了雙子葉植物，如煙草、大豆、棉花等之外更加適合于水稻、 玉米、小麥等單子葉植物。
4、利用本發(fā)明ZFi^07基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其中可用任何一種啟動 子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟動子，該表 達(dá)載體中必要時可包括增強(qiáng)子，不論是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子。為了簡化轉(zhuǎn)化細(xì) 胞的鑒定可使用選擇性標(biāo)記包括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如0 -葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發(fā)光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用 無標(biāo)記選擇。所用的表達(dá)載體可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方 法可用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉(zhuǎn)化植物。


圖l、 ZFP207的亞細(xì)胞定位。
(a)(b) pBI-GFP(對照)在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時表達(dá)。(c)(d) pBI-ZFP207-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的 瞬時表達(dá)。(a)(c)在激光共聚焦顯微鏡下的觀察；(b)(d)在可見光下的觀察。通過激光共聚焦顯微 鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)ZFP207-GFP嵌合基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)(白色箭頭處)(c)(d)，表明水稻ZFP207 為定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。 圖2、耐鹽性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
Z^P207轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草植株于含有400mM NaCl的濾紙上處理5天后，轉(zhuǎn)移到不含NaCl 的濾紙上恢復(fù)3天。(a)(b)為處理之后的轉(zhuǎn)基因煙草；(c)為處理之后的對照非轉(zhuǎn)基因煙草。 圖3、耐冷性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
ZF尸207轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草植株于4'C光照培養(yǎng)箱中處理5天后，轉(zhuǎn)移到25'C恢復(fù)12h。 (a)(b) 為處理之后的轉(zhuǎn)基因煙草；(c)為處理之后的對照非轉(zhuǎn)基因煙草。 圖4、耐旱性(甘露醇模擬干旱脅迫)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
ZF尸207轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草植株于300mM甘露醇模擬干旱脅迫中處理30天。(a)(b)為處理之
后的轉(zhuǎn)基因煙草；(c)為處理之后的對照非轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
選用水稻品種"韭菜青"(太湖流域粳稻地方品種，為強(qiáng)耐鹽品種)，待水稻幼苗 長至3葉期后，用150mM NaCl進(jìn)行處理，12小時后立即取葉片置于液氮中冷凍保 存。取部分葉片，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移 入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen, USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。 以獲得的總RNA為模板，按照美國Promega公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以植物TFIIIA型鋅指蛋白的保守結(jié)構(gòu)為探針序列(Probe sequence)搜索位于GenBank的水稻基因組數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過EST比較和序列拼接得到一 個全長605bp的水稻TFIIIA型鋅指蛋白基因的序列，根據(jù)此序列分別設(shè)計兩端引物 CCTAATACACACACACAAAG， CTACAAACTTATAACCGCAG，采用RT-PCR方法 進(jìn)行cDNA克隆，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性4分鐘，94'C變性30s, 55'C復(fù)性lmin，72。C延伸2min， 33個循環(huán)后，72°C 10min，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，測 序后獲得具有完整編碼區(qū)的水稻鋅指蛋白基因ZF尸207的cDNA序列SEQ ID NO. 1 。 ZF尸207全長605bp，其開放閱讀框位于31-597處。DNAssist軟件分析表明ZFi5207 共編碼188個氨基酸，其中含有1個典型的Cys2/His2型鋅指結(jié)構(gòu)，Cys-Xaa-Cys和 His-Xaaa-His區(qū)之間由12個主要為酸性或疏水性氨基酸組成的區(qū)段隔開，配位結(jié)構(gòu)加 上Phe和Leu所形成的疏水核心，確定了鋅指的基本機(jī)構(gòu)和形狀。ZFP207的鋅指結(jié) 構(gòu)包含植物特有的QALGGH保守結(jié)構(gòu)。使用BioXM軟件(版本2.6)估算其等電點(diǎn) pl=10.28，分子量MW=20.7KDa。以ZF尸M7搜索GenBank中現(xiàn)有水稻基因組(包括 粳稻和秈稻)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ZF尸M7為單拷貝基因。BLAST的結(jié)果及3D-PSSM數(shù)據(jù) 庫分析結(jié)果證明從水稻中新得到的基因確為一個編碼TFIIIA型鋅指蛋白基因。 實(shí)施例2
用實(shí)例1中設(shè)計的ZFP207兩端引物進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR分析ZF尸2O7基因在 水稻幼苗中的表達(dá)，以水稻actin基因7 ad (McElroy et a1,1990)的表達(dá)為內(nèi)參，結(jié) 果表明，的表達(dá)在150mMNaCl處理下2h顯著增強(qiáng)，24h時表達(dá)達(dá)最高，其 表達(dá)量約為對照的6倍；在低溫(4°C)脅迫下，ZFP207的表達(dá)在0.5h處理后即表 達(dá)量增加，6h時表達(dá)量達(dá)到最高，隨后表達(dá)量逐漸下降，但直到處理24h時ZFP207 的表達(dá)量仍然高于對照；在模擬干旱(20%PEG6000)處理下，的表達(dá)直到 處理12h時顯著增加，表達(dá)量約為對照的10倍，處理24h時表達(dá)量達(dá)到對照13倍。 本發(fā)明的水稻鋅指蛋白基因ZFP207為水稻中的首次報道，同時也是單子葉植物中首 次發(fā)現(xiàn)的同時與高鹽、低溫和干旱脅迫相關(guān)的TFIIIA型鋅指蛋白基因，有望應(yīng)用于 植物尤其是單子葉植物的綜合抗逆性遺傳改良。 實(shí)施例3
根據(jù)實(shí)施例1得到的ZF尸2( 7的全長序列，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物， 并在下游引物引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，上游引物 CCTAATACACACACACAAAG， 下游 引物
GATGGATCCTTAACCGCAGGCTCAAG。
以實(shí)施例1得到的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板， 經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將ZF尸207的cDNA克隆至中間載體pMD18-T ，進(jìn)一步克隆到修
改后的雙元表達(dá)載體pBi121 (將其中的e-葡糖醛酸糖苷酶報告基因替換成綠色熒光
蛋白報告基因)，構(gòu)建包含ZF尸207-Gi^嵌合基因的質(zhì)粒載體pBI-ZFP207-GFP。將 pBI-ZFP207-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后進(jìn)一步在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)，通過激光共 聚焦顯微鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)ZFP207-GFP嵌合基因產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)，表明水稻 ZFP207為定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子(圖l)。 實(shí)施例4
將步驟3)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙草，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn) 行PCR, Southern雜交以及RT-PCR驗(yàn)證后對轉(zhuǎn)基因植株的T2代和對照植株進(jìn)行耐逆
性分析。
耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株幼苗和對照植株進(jìn)行400mMNaCl的持續(xù) 處理，在鹽處理5天后轉(zhuǎn)移到不含有NaCl的濕濾紙上繼續(xù)生長，處理后表現(xiàn)明顯優(yōu) 于對照組的轉(zhuǎn)基因煙草植株即為獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因煙草(圖2);
耐冷性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的幼苗于4t:處理5d后，放 置于25'C培養(yǎng)箱中恢復(fù)12h，恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組的植株即為耐冷性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植 株(圖3);
耐旱性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對照植株于300mM甘露醇(模擬干旱) 中處理30天后生長優(yōu)于對照組的植株即為耐旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。
上述實(shí)施例表明本發(fā)明中克隆的水稻鋅指蛋白基因ZF尸207,為水稻中首次克隆 的同時與高鹽、低溫和干旱相關(guān)的水稻TFIIIA型鋅指蛋白基因。實(shí)施例2表明該基 因與植物的高鹽、低溫和干旱脅迫密切相關(guān)。實(shí)施例4表明該基因與過量表達(dá)后能夠 提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、耐冷和耐旱性，具有提高植物綜合耐逆性的功能。此類基因 由于來源于單子葉植物，具有單子葉植物優(yōu)化的密碼子，除了適合煙草等雙子葉植物， 也適合于水稻、玉米、小麥等單子葉作物的抗逆性遺傳改良。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下 (l)SEQIDNO. 1的信息
(1) 序列特征
(A) 長度605bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDNO. 1
(2) SEQ ID NO. 2的信息
(i)序列特征
(A) 長度188a.a
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型蛋白質(zhì)
(iii)序列描述SEQIDN0.2
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>一個水稻鋅指蛋白
<130〉麵
<140>000
<141>2007-U-09
<160>2
<170〉Patentln version 3.1
<210>S即DNO. 1
<2U>605
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220〉
<221>CDS
<222>(31)..(597)
<223〉
<220>
<221>mRNA
<222>") .(605)
<223>
<400>1
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<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa) <糊> 2
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85 90 95
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100 105 110
His His Met Arg Val Asn Pro His Ala Thr lie Leu Lys Val Asn Arg
115 120 125
Gly Tyr Ser Ser Ala Asp Gly Val Val Val Ala Lys Phe His Gly Gly
130 135 140
Gin Met Ser Ser Ser Trp Val Pro Phe Ala Val Glu His Gly Arg Gly 145 150 155 160
Ser Val Trp Pro Gly Ser Phe Lys Ala Ser Ser Gin Glu Gin Lys Lys
165 170 175
Arg Thr Glu Glu Asp Leu Asp Leu Ser Leu Arg Leu 180 18權(quán)利要求
1、水稻鋅指蛋白基因ZFP207，其序列為SEQ ID NO.1。
2、 權(quán)利要求1所述水稻鋅指蛋白基因Z7^M7的耐逆性基因工程應(yīng)用，包括1) 總RNA的提取選用水稻品種"韭菜青"，待水稻幼苗長至3葉期后，用150mMNaCI進(jìn)行處理，12小時后 立即取葉片置于液氮中冷凍保存，取部分葉片，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管， 充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)，勻漿后移至1.5mLEP管中，抽提總RNA，用甲醛變性膠 電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量；2) 水稻鋅指蛋白基因ZFP207的克隆 根據(jù)水稻鋅指蛋白基因的全長序列，設(shè)計兩端引物 上游引物CCTAATACACACACACAAAG下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG以步驟l)獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程 序如下94。C預(yù)變性4分鐘，94-C變性30s，55'C復(fù)性lmin， 72'C延伸2min, 33個循環(huán)后，72°C 10min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18-T載體，測序后獲得具有完整編碼區(qū)的水稻鋅指蛋白基 因Z尸尸207的cDNA序列SEQ ID NO. 1;3) 植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)水稻鋅指蛋白基因ZF尸207的cDNA序列，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上 游引物上引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物序列同步驟2): 上游弓I物GGATCCTTCTACTCCTAATACACAC 下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG以步驟2)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將ZFP207的cDNA克隆至中 間載體pMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121;4) 轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟3)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙草，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR, Southern雜交以及RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的耐逆性評價，轉(zhuǎn)基因植株的T2代和對照植株進(jìn)行耐 逆性分析。耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株幼苗和對照植株進(jìn)行400mM NaCl的持續(xù)處理，在鹽 處理5天后轉(zhuǎn)移到不含有NaCl的濕濾紙上繼續(xù)生長，處理后表現(xiàn)明顯優(yōu)于對照組的轉(zhuǎn)基因煙草 植株即為獲得的耐鹽轉(zhuǎn)基因植株；耐冷性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的幼苗于4'C處理5d后，放置于25'C培 養(yǎng)箱中恢復(fù)12h，恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組的植株即為耐冷性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株；耐旱性轉(zhuǎn)基因植株的獲得將轉(zhuǎn)基因植株和對照植株于300mM甘露醇中處理30天后生長優(yōu) 于對照組的植株即為耐旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻鋅指蛋白基因ZFP207及其耐逆性基因工程應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。ZFP207的cDNA序列見SEQ ID NO.1。ZFP207是定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，mRNA表達(dá)分析表明該基因受脫落酸、高鹽、低溫和干旱的顯著誘導(dǎo)。通過總RNA的提取、水稻鋅指蛋白基因ZFP207的克隆、植物表達(dá)載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因煙草植株的T2代和對照植株進(jìn)行耐逆性分析分別獲得耐逆性轉(zhuǎn)基因煙草植株。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明該基因的超量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性、耐冷性和耐旱性。ZFP207可作為目的基因?qū)胫参?，提高轉(zhuǎn)基因植物的綜合耐逆性。
文檔編號C12N15/29GK101182520SQ20071013526
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者張紅生, 燕 江, 王州飛, 王建飛, 鮑永美, 驥 黃 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)