專利名稱：蟲熒光素酶的制作方法
蟲熒光素酶
本申請是申請日為1995年3月22日，申請?zhí)枮?5193259.4,發(fā)明名 稱為"蟲熒光素酶"的發(fā)明專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及新的具有蟲熒光素酶活性的蛋白以及編碼及表達該蛋白的DNA和栽體.具體地說，^發(fā)明提供了在30 'C以丄時具有^穩(wěn)定 性的蟲熒光素酶.
螢火蟲熒光素酶在ATP、 Mg"和分子氧存在時，催化熒光素的氧 化反應，結(jié)果產(chǎn)生光.該反應具有約0.88的量子產(chǎn)率(見德魯加和麥 克埃里(1978)以及塞利格爾和麥克埃里(1960)),并且其發(fā)光特性可以 用于測量ATP水平的光度分析中.
蟲熒光素酶可以從昆蟲(如螢火蟲)體內(nèi)直接獲取，或者通過含有 編碼該酶的重組DNA構(gòu)建體的微生物表達獲得.可以從四種值得注意 的螢火蟲中獲得該酶或編碼該酶DNA,它們是日本的GENJI和HEIKE 十字螢火蟲(Luciola cruciata)和橫纟文安火蟲(Luciola lateralis),東歐的明 格列爾螢火蟲(Luciola mingrelica)和北美的螟螢火蟲 (Photinus Pyralis).夜光螢火蟲(Lampyris noctiluca)是該酶的另 一來源，它的蟲焚
光素酶的氨基酸序列有84°/。與螟螢火蟲的同源.
野生型和重組型的蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)為當它們暴露于約 30'C,尤其是35'C以上時會迅速失去活性.這樣的不穩(wěn)定性不能滿足 該酶在高溫環(huán)境下使用或保存，或通過加熱提高反應速度的要求.已 知日本安火蟲熒光素酶可以通過在217位用一個異亮氨酸殘基取代一 個蘇氨酸殘基引起突變來使其在熱失活反應中保持穩(wěn)定(Kajiyama & Nakano(1993)生物化學^ 1"95 - l"99頁)，通過這種方式，增 加了該酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及比活，螟螢火蟲和明格列爾螢 火蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定化尚未見才艮道.
本發(fā)明提供了新的蟲熒光素酶，它們具有比野生型蟲熒光素酶更高 的熱穩(wěn)定性，這是通過用其它氨基酸,特別是賴氨酸和精氨酸，取代 分別存在于螟荄火蟲、明.格列爾螢火蟲、橫紋螢火蟲和十字安火蟲中的保守序列中的一個谷氨酸殘基完成的。該谷氨酸殘基位于螟螢火蟲熒光素酶的第354位，即保守氨基酸序列TPEGDDKPGA的第三個氨 基酸，這個序列發(fā)現(xiàn)于該種和其它種螢火蟲的蟲熒光素酶中。
因此，本發(fā)明的第一個方面，是提供了一種具有蟲熒光素酶活性的 蛋白，并且其氨基酸序列60%以上與螟螢火蟲、明格列爾螢火蟲、土字螢火蟲和橫紋螢火蟲的同源,該序列的特征在于相應于螟螢火蟲蟲 焚光素酶第354殘基和明格列爾螢火蟲、十字螢火蟲和橫紋螢火蟲蟲 焚光素酶第356殘基的氨基酸殘基不是谷氨酸。
該氨基酸可以是一個天然存在的氨基酸，或是一個所謂罕見氨基酸 (unusual amino acid )，例如^修飾的天然存在的氨基酸或其類似物。除谷氨酸以外的氨基酸類似物應被理解為那些同與它們類似的氨基酸 對蛋白有相同功效的化合物。典型的罕見氨基酸列于美國和歐洲專利 手冊和專利案件實施細則包舍核苷酸和/或氨基酸序列的申請公開 修飾的和罕見的氨基酸，
優(yōu)選的蛋白的特征在于它包含一個氨基酸序列XGDDKPGA其中 X不是谷氨酸。更優(yōu)選的蛋白包含氨基酸序列TPXGDDKPGA，并且 出于熱穩(wěn)定性考慮，優(yōu)選的X是除天門冬氨酸、脯氨酸和甘氨酸以外 的其它任何氨基酸；更優(yōu)選的是色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸 或天門冬酰胺，但最優(yōu)選的是賴氨酸或精氨酸，或它們中任襯一個的 類似物。
應該注意到，有些種的蟲熒光素酶可能在保守區(qū)TPXGDDKPA中有 一個或兩個氨基酸不同，但是，相應于序列中第三位氨基酸不是谷氨酸的蟲熒光素酶的所有活性蛋白均由本發(fā)明提供。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，本發(fā)明的蛋白還把相應于Luciola螢火蟲 熒光素酶217位氨基酸或螟螢火蟲215位的氨基酸變成疏水性氨基酸，優(yōu)選的是異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸，如EP 0524448 A所述。 已發(fā)現(xiàn)這樣的變化所導致的熱穩(wěn)定性的增加超過了第354位單獨的變化；因此這兩個變化具有的效果基本上是相互獨立的，并且可以同時使用。
本發(fā)明的第二個方面，是提供編碼本發(fā)明的蛋白的DNA ,并且第 三方面是提供一個載體，具體地說是一個質(zhì)粒，它包含&c基因(編碼 蟲熒光素酶的基因)，該基因以能夠表達本發(fā)明的蛋白的形式存在。
所述的存在形式是指載體包含能夠控制本發(fā)明的蛋白表達的DNA序 列，以便當該DNA序列導入到微生物宿主細胞中后，在加入適當?shù)恼T
導劑的條件下，可以按照需要表達蛋白。
螟螢火蟲、明格列爾螢火蟲、十字螢火蟲和橫紋螢火蟲的luc基因
是眾所周知的，并且可以通過標準的分子生物學技術(shù)分離。螟螢火蟲
的luc基因可以以pGEM質(zhì)粒形式從普羅麥格公司買到。因此，制備 本發(fā)明的DNA的適當方法和起始材料的來源是(i)使用天然存在的螢 火蟲基因組DNA,并用例如PCR法擴增從中獲得的luc基因，(ii) pGEM 以及(iii) Kajiyama&Nakano的pGLf37質(zhì)粒，編碼具有蟲焚光素酶活 性(即氧化蟲焚光素同時發(fā)光的活性)的蛋白的其它基因，也將是獲 得一個DNA，并最終通過該基因表達本發(fā)明的蛋白的起始材料的合適 的來源。
用于搡縱野生型或其它的基因DNA以制備本發(fā)明的DNA的適 合的載體是能夠包容DNA ，同時可以將天然存在的谷氨酸變換成可選 的氨基酸的任何載體。對于化學誘變的基因突變，可以使用例如羥胺 進行，本領域的技術(shù)人員會想到許多適合的載體，它們使基因突變前 和突變后的基因搡縱變得容易。
優(yōu)選的是使基因在谷氨酸位點特異性突變，因此，需要一個定
點基因突變操作。這樣的操作在載體中最容易進行，它們對本領域的 技術(shù)人員是熟知的。
為了表達野生型和已知型的，以及本發(fā)明的luc基因，適合的載體 包括pKK223-3 、 pDR540 ( Boehringer Mannheim公司提供)和 pT7-7;具有tac啟動子的前兩個載體受控于乳糖阻遏子，允許在異丙 基-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的情況下誘導表達'pT7:允許被T7-RNA聚合酶啟動子控制，由此為在包含T7 RNA聚合酶的大腸桿菌細 胞內(nèi)非常高水平的基因表達提供了基礎。在這些載體中，當luc基因插
入pT7-7載體時，發(fā)現(xiàn)表達效率是最高的。
由插入pKK223-3和pDRMO的/wc基因表達蟲熒光素酶會導致具有 野生型N末端序列的蟲熒光素膝的表達，而由插入pT7-7的/wc基因表 達會導致具有附加的N末端氨基酸序列M-A-R小Q的融合蛋白的合 成。帶有基因的每個載體(稱為構(gòu)建體pPW204 , pPW116和 pPW304 )中/wc基因的核糖體結(jié)合位點和啟始密碼子示于實施例的表1中。
本發(fā)明的第三方面提供了能夠表達本發(fā)明的蛋白的細胞；用這些細 胞制備這些蛋白的方法和包含本發(fā)明的蛋白的測試試劑盒.和試劑。本以明還提供了檢測方法，其中ATP的檢測使用了蟲熒光素/蟲熒光素酶試劑，它是本領域已知的，其特;f正為蟲熒光素酶是一種本發(fā)明的蛋白。 本發(fā)明的蟲熒光素酶的制備物與野生型和重組野生型蟲熒光素酶相比，在3(K70'C時，特別是在37-60'c時，尤其是在40-50 。C時相對耐 熱。
能夠在DNA或載體(如細胞中的質(zhì)粒)中用DNA序列表達異源蛋 白的任何細胞，都可以用來表達本發(fā)明的蛋白。典型的這類細胞的是 酵母和細菌細胞，例如哞酒酵母和大腸桿菌細胞,但是本領域的技術(shù)人員將會想到許多其它的適合蛋白表達的宿主生物。由于該蛋白是一 種昆蟲蛋白，因此昆蟲細胞可能是優(yōu)選的。該蛋白可以表達為具有與 天然的和已知的重組蟲焚光素酶相同結(jié)構(gòu)的蛋白，或可以表達為該蛋 白與其它氨基酸、肽、蛋白或其它化學物質(zhì)例如上述M-A-R-I-Q序列的融合體或結(jié)合體。
本領域的技術(shù)人員應該意識到 一些宿主可能具有特殊的密碼子偏 向，例如，細菌在某些情況下用不同于酵母的密碼子，因此導入這樣 的宿主的DNA可能被更有利地改變，為給定的氨基酸提供一個簡并密 碼子，以便在該宿主中更好地表達.這樣的簡并DNA當然包持在本發(fā) 明的DNA范圍之內(nèi)。
大腸桿菌BL21(DE3)是一個合適的宿主,并且具有可以穩(wěn)定地整合 到其染色體組中的T7 RNA聚合酶，它受控于可誘導的lacUV5啟動
子，因此它與pT7-7得到的構(gòu)建體相容。大腸桿菌B抹如BL21缺少 /o"蛋白酶和owpr外膜蛋白酶。這些缺陷有助于使外源蛋白在大腸桿
蓋中的表達和積累更穩(wěn)定。對包含上述三種表達構(gòu)建體之一的大腸桿 tBL2I(DE3)粗提物的逐個分析表明，蟲熒光素酶最高水平的表達來 自于含有PPWS04的構(gòu)建體的細胞(見表2 )。
本發(fā)明的突變蛋白除了熱穩(wěn)定性以外，還具有其它的優(yōu)點。已發(fā)現(xiàn) 在Photi鵬354位/Luciola 356位的氨基酸突變導致了在蟲熒光素氧化
時發(fā)出的光的波長的變化，它依賴于替代谷氨酸的氨基酸或類似物。 因此，本發(fā)明還提供了用作特異性結(jié)合試劑標記或報告基因(reporter gene )的蟲熒光素酶，當使用它們的蛋白產(chǎn)物進行蟲螢光素酶氧化時， 報告基因?qū)⒈尘疤匦詧蟾鏋樘貨i波長的光；這一特性為甘氨酸、脯氨 酸和天門冬氨酸的突變提供了用途。本發(fā)明的蛋白的另 一個優(yōu)點是如 以下的實施例中所述，可以在更高的溫度，例如37 r或更高的溫度下 制備它們并相應有高的產(chǎn)率，這一優(yōu)點來自于它們的較高的熱穩(wěn)定 性。
本發(fā)明的蛋白、DNA 、載體和細胞將通過參照下面的非限制性實 施例、圖、表以及序列表，以示例的方式描述。本領域的技術(shù)人員還 會因此想到其它蛋白、蛋白結(jié)合物、DNA、載體和細胞、帶有上述材 料的分析和檢測試劑盒。
附圖
圖l:顯示了 pPW204質(zhì)粒的限制圖譜，該質(zhì)粒是如以下實施例所 述，通過插入一個/"c基因，從pKK223-3得到的。
圖2:顯示了 pPW116質(zhì)粒的限制圖譜，該質(zhì)粒是如以下實施例所 述，通過插入一個/"c基因，從pDR540得到的。
圖3:顯示了 pPW304質(zhì)粒的限制圖鐠，該質(zhì)粒是如以下實施例插 入一個/wc基因，從pT7-7得到的，
圖4:顯示了 pPW601a質(zhì)粒的限制圖譜，該質(zhì)粒是利用pDR540和 去掉Xho位點的PGEM-luc的BamHl/Sstl片段得到的。
圖5:顯示了重組的和野生型的Photinus蟲熒光素酶(西格瑪公司) 熱失活曲線。如以下實施例所逸，該酶在給定的溫度下溫育20分鐘。
圖6:顯示了在不同溫度下生長的大腸桿菌BL"(DE"pPW！304粗 提物的活性曲線。
圖7:顯示了從pPW304和pPW304M-l (本發(fā)明的編碼用賴氨酸 替代354位的谷氨酸編碼的蛋白的質(zhì)粒)獲得的蟲熒光素酶的熱失活 曲線。
圖8 :顯示了在37 'C下西格瑪公司的野生型、pPW304和 pPW304M-l的重組蟲熒光素酶隨時間的失活曲線。
圖9:顯示了在Tabor后的pT7-7的限制圖傳。


圖10:顯示了證明在普羅麥格公司裂解緩沖液中，在40。C下本發(fā) 明的大腸桿菌表達的蟲熒光素酶的細胞粗提物的熱失活曲線，該蟲熒 光素酶在"4位的野生型的谷氨酸已分別被丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、
異亮氨酸、酪氨酸、笨丙氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、.天門冬 酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸取代。
圖ll:顯示了在磷酸緩沖液中，47"下，與A215L和E354K單 突變相比，具有E354K賴氨酸和A215L亮氨酸變化的純化的雙突變的 蟲熒光素酶的熱失活曲線。
圖12:顯示了賴氨酸E354k突變的、重組野生型的和天然的荄火 蟲熒光素酶在37 。C pH7.75 HEPES緩沖液加0.02%疊氮化物的條件 下，殘留初始活性的百分比隨時間變化曲線。
圖13 :顯示了重組野生型的、E354K單突變的和E354K+A215L 雙突變的蟲熒光素酶在37 。C表達時，用來檢測培養(yǎng)細胞濃度的光密度 的增加對蟲焚光素酶活性的曲線。
圖14 顯示了 10ng/ml的A215L和E354K單突變、A215L+E354K 雙突變、重組的以及西格瑪公司野生型的蟲焚光素酶在，pH7.75的包 含1Q/。BSA和0.02%疊氮化物的HEPES緩沖液、37 'C時起始活性的百 分數(shù)在5小時內(nèi)隨時間變化的曲線，
圖15:顯示了 10ng/ml的A215L和E354K單突變、A215L+E354K
雙突變、重組的以及西格瑪公司野生型的蟲熒光素酶在PH"7.75的包含 1%BSA 、 0.02%疊氣化物、2mM EDTA和2mM DTT的HEPES緩沖
液、37。C時，初始活性的百分比在5小時內(nèi)隨時間變化的曲線。
序列表
在本說明書的結(jié)尾提供的序列表描述了如下的DNA和氨基酸的序
列
第1號序列顯示了編碼本發(fā)明蟲熒光素酶的DNA的DNA序列， 其中螟螢火蟲野生型密碼子在第1063至1065位被突變；為了突變成 賴氨酸，1063位的堿基突變成A。
第2號序列顯示了本發(fā)明蛋白的氨基酸序列，其中螟螢火蟲野生 型第354位的氨基酸谷氨酸變成了其它的氨基酸。
第3號序列顯示了用于pPW601的SDM突變的寡聚核苷酸序列， 用于在實施例2中在第354位以賴氨酸替代谷氨酸。
第4號序列顯示了用于PPW601的SDM突變的寡聚核苷酸序列， 用于在實施例5中在第215位給出亮氨酸。
第5號序列顯示了本發(fā)明蛋白的氨基酸序列，其中螟螢火蟲野生 型第354位的氨基酸谷氨酸變成了任一種其它氨基酸，并且215位的
氨基酸變成了亮氨酸。
實施例
實施例1 :含有本發(fā)明的DNA的質(zhì)粒的制備
質(zhì)粒pKK223-3和pDR540 /人Boehringer Mannheim />司獲得； pDR540可義人Pharmacia />司獲《尋。
質(zhì)粒pT7-7 (參見現(xiàn)代分子生物學協(xié)定Vol II 16.2.1 )是從StanTabor，生化系，哈佛醫(yī)學院，波士頓，麻省40"15處獲得，并且(如 圖8所示)包含T7RNA聚合酶啟動子(t)10和插入pT7-5中PvuII和Clal 位點之間的T7基因10蛋白(T7 bp 22857至22972 )的翻譯起始位點，
建立融合蛋白的獨特的限制性位點(在填補5'末端后)是框架0 : EcoRl ;框架1 : Ndcl 、 Smal 、 Clal ;框架2 : BamHI 、 Sail 、 HindIII。原來的多聯(lián)體Sacl位點通過刪除而被移去，并且在起始密碼 子上游提供了一個附加的Xbal位點。
螢火蟲熒光素酶(由晶狀懸液制得，Cat No L9009 ),輔酶A和 ATP得自西格瑪化學公司。甲蟲熒光素酶鉀鹽由普羅麥格公司得到。
細胞提取物的制備依照普羅麥格技術(shù)公告第101號，等分的大腸桿菌 培養(yǎng)物在細胞裂解試劑(25mM Tris-磷酸，pH7.8， 2mM DTT， 2mM EDTA, 10%甘油，1% Triton X-IOO， 2.5 mg/ml BSA, 1.25 mg/ml溶菌 酶)中室溫下裂解10分鐘，然后在檢驗前存放于冰浴中。
細胞系的蟲熒光素酶的活性是通過監(jiān)測菌落發(fā)出的生物光.來檢測 的，這些菌落被轉(zhuǎn)移到尼龍濾片(HybondN, Amersham )上，并將濾 片浸入含有0.5mM蟲熒光素的lOOmM pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液 (Wood&Dduca， (1987)生化年鑒竺p501-507 )。蟲焚光素酶的體 外檢測在25 °C 的檢測緩沖液(20mM Tricine, ImM MgS04，
O.lmM EDTA， 33.3mM DTT, 0.27mM輔酵A， 0.47mM蟲焚光素， 0.53mM ATP和1至2)il的樣品)中進行。檢測混合液的最終pH值是 7.8，光的測量是用一臺BioOrbit 1250光度計進行的，
為了制備非特異性化學突變的DNA ，包含/"c基因的質(zhì)粒根據(jù) Kironde et al (1989) Biochem. J. 259， p421-426的方法用含0.8mM的輕 胺，ImM EDTA的pH6.0的O.lmM的磷酸鈉溶液在65 °c的條件下處 理2小時，突變后的質(zhì)粒在G60 DNA級的Nick柱(Pharmacia )上脫 鹽，之后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),
熱失活研究是通過將具有蟲熒光素酶活性的細胞粗提物在不同的溫 度下溫育20分鐘后測量剩余活力而進行的.在研究從西格瑪?shù)玫降募?化的蟲熒光素酶時，在失活前用普羅麥格裂解緩沖液稀釋。為進行與
時間有關(guān)的研究，包含50|^1的細胞粗提物或溶于裂解緩沖.液的西格瑪 蟲熒光素酶的Eppendorf管在37 ℃下溫育。在不同的時間取出試管并 在檢測前放入水浴中冷卻。剩余活力以初始活力的百分比表示。
pPW204 、 pPW116和pPW304的構(gòu)建體在大腸桿菌BL21(DE3)中 表達蟲熒光素酶的相對水平是0.!:0.5:1.0。細胞在LB培養(yǎng)基中37 ℃ 下培養(yǎng)至OD600的值為O.3 ,然后用IPTG誘導，并繼續(xù)生長4小時， 之后制備粗提物并測量活性。
表1 :實施例1使用的表達構(gòu)建體的核糖體結(jié)合位點(下劃線)和 起始密碼子。
pPW304 AAGGAGATATACAT ATG* CGT AGA ATT CAA ATG pPW116 AGGAAACAGGATCCA ATG* pPW204 AGGAAACAGCAA ATG*
將谷氨酸轉(zhuǎn)變成其它氨基酸所需的定點基因突變用如下方案進行。 因為谷氨酸到賴氨酸的突變依賴于一 個獨特的Aval限制位點并將它破 壞，因此有可能使用單一寡聚核苷酸作為基因突變和選擇的寡聚核苷 酸。
定點基因突變方案
所選質(zhì)粒用賴氨酸選擇/突變的寡聚核苷酸變性并退火5'-CATCCCCCT工GGGTGTAATCAG-3'，其中下劃線的T被錯配。突變
的DNA鏈被合成并連接，所有原來的限制性位點被Aval消化。
使用Bio-Rad Gene Pulser version 2-89將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細胞中，這里使 用的是大腸桿菌BMH 71-18 mut S細胞。所得到的收獲的細胞以及純 化的包含突變質(zhì)粒和親本質(zhì)粒的混合質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 細胞之前，用Aval進行二次消化。這些細胞在選擇性培養(yǎng)基上(LB 瓊脂+SOjag/ml氨節(jié)青霉素)鋪平板，通過純化質(zhì)粒DNA和分析Aval 限制性位點的缺失篩選菌落。每次使用Bimboim and Doly( 1979)核 酸研究7, pl513)的堿裂解法純化質(zhì)粒DNA 。精確的方案描迷見于TransformerRTM定點基因突變試劑盒(2版)，由Clontech Laboratories 公司(美國)銷售，目錄號K1600-l。
圖4顯示了 pPW601a的P艮制圖譜，p W601a是用Pharmacia pDR540和從pGEM-Zwc得到的除去Xho位點的BamHl/Sstl片段的 pPW116異構(gòu)體。定點基因突變按照上述方法和Clontech的指示進行， 例如將插入的野生型Photinus /wc基因轉(zhuǎn)變?yōu)槿缧蛄?一所示的序列，其 中1063-I0"位為AGG,它能夠表達如序列二所示的在第354位修飾 為賴氨酸的蛋白序列.
實施例2:蟲焚光素酶的熱秀急定性
在如上述方法制備的大腸桿菌的載體中,由/"c基因表達的未修飾 的和修飾的(即本發(fā)明的)各種蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性已被測量，結(jié) 果示于圖5至圖S。
50pg/ml的蟲焚光素酶在43.5 。C的條件下，在S0mM pH7.8的磷酸 鉀緩沖液、1mM EDTA 、 0.2%(w/v) BSA 、 lmM DTT和10%硫銨中 的活性t172 (半衰期)的比較所顯示的達到剩余50%活性所需的時間如 下
西格瑪野生型蟲焚光素酶達到11/2約1.5分鐘 pPW601(354-谷氨酸) 達到嚴約5分鐘 pPW601aK(354-賴氨酸)達到 —/2約30分鐘
從前述的圖表中，我們可以清楚地看出用一個賴氨酸替代354位 的谷氨酸，可以在高達至少43.5 。C時提高蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性。
實施例3:蟲焚光素酶的熱穩(wěn)定性
用與實施例1中類似的方法制備的多種蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性已被 檢測，這些酶是由大腸桿菌載體中的相應于本發(fā)明的其它354位突變 的SDM修飾的luc基因表達的，結(jié)果圖示于圖10。
在40 。C的普羅麥格裂解緩沖液中進行了 t'"的比較，所得的t'"以分
鐘為單位如下
pPW601aK(354=:賴氨酸)達到t"2約13分鐘
pPW601aR(354=:精氨酸)達到約13分鐘
pPW601aL(354==亮氨酸)達到約io分鐘
pPW601al(354=:異亮氨酸)達到t1/2約10分鐘
pPW601aN(354=:天門冬酰胺)達到t1/2約io分鐘
pPW601aV(354=:纈氨酸)達到約9分鐘
pPW601aW(354=:色氨酸)達到t1/2約8分鐘
pPW601aA(354==丙氨酸)達到t1/2約6.5分鐘
pPW601aY(354=:酪氨酸)達到約6.5分鐘
pPW601aM(354==甲硫氨酸)達到t1/2約5.5分鐘
pPW601aF(354==苯丙氨酸)達到約5分鐘
pPW601aH(354==組氨酸)達到約5分鐘
pPW601aT(354==蘇氨酸)達到t1/2約4.5分鐘
pPW601aQ(354==谷氨酰胺)達到t1/2約《5分鐘
pPW601aC(354==半胱氨酸)達到t1/2約4分鐘
pPW601aS(354==絲氨酸)達到t1/2約3.5分鐘
pPW601aE(354=谷氨酸)達到t1/2約1分鐘
pPW601aD(354==天門冬氨酸)達到t1/2約1分鐘
pPW601aP(354==脯氨酸)達到約1分鐘pPW601aG (354=甘氨酸〕
達到t1/2約小于1分鐘
實施例4:蟲熒光素酶在37 。C和室溫下的穩(wěn)定性
pPW601K賴氨酸突變的蟲熒光素酶(86ng/ml)、重組野生型蟲熒光素 酶。50ng/ml)、和天然型蟲焚光素酶(西格瑪公司)(61Sng/ml)在37 。C 下，在加入0.02%疊氮化物作為防腐劑的1。/。BSApH7.75的HEPES緩 沖液中溫育4小時。為了測量剩余活力，將lng蟲熒光素酶加于D-蟲 熒光素底物，每分鐘記錄光度計的讀數(shù)。
在37 。C下溫育2小時和在室溫下10天后的剩余活力的測量結(jié)果如下。
37 'C 2小時后 E354K突變的蟲熒光素酶
重組野生型蟲焚光素酶 西格瑪天然蟲熒光素酶
室溫下10天后
E35々K突變的蟲焚光素酶
重組野生型蟲熒光素酶 西格瑪天然蟲焚光素酶
70%剩余活力 12%剩余活力 18%剩余活力
85%剩余活力 59%剩余活力 71%剩余活力
實施例5: 354K:215L雙突變的制備和穩(wěn)定性
pPW601a螟螢火蟲蟲焚光素酶的354賴氨酸215亮氨酸雙突變體 的制備是通過使用如實施例1所描述的pPW601aESMK，并將它用第 四號序列的寡聚核苷酸5，-GAATCTGACGCAGAGAGTTCTATGCGG-3'進行突變，其中下劃線的堿基代表引起突變的錯配。這一突變的確認 是通過對如實施例1的方法在大腸桿菌體內(nèi)表達的合成的蟲熒光素酶進行DNA測序并進行熱穩(wěn)定性檢測實現(xiàn)的，該檢測是在如實施例2至4所描迷的條件下進行的，即使用包含lmMEDTA, 0.2%(w/v) BSA, lmMDTT和10。/。硫銨的pH7.8的磷酸緩沖液作為熱失活介質(zhì)。
在43.5'C磷酸緩沖液中，32分鐘之后只失去不到5%的活力，而在 WC時，？/2約是38分鐘。在50 。C溫育16分鐘后，雙突變體保留了 大約15%的活力。失活檢測的結(jié)果圖示于圖12。
實施例6 :蟲焚光素酶的純化
表達重組野生型或突變型蟲焚光素酶的大腸桿菌JM109細胞在含有 50fig/ml的氨千青霉素的Luria Broth(LB)培養(yǎng)基中在30 。C下培養(yǎng)，并 在對數(shù)早期用IPTG(lmM)誘導表達，細胞在穩(wěn)定期中期收獲，并重懸 于含有50mM KC1, lmM dithiothreitol, 1.2mM甲疏磺酰氣(PMSF) 和lmM EDTA的Tris-HCl pH8.0緩沖液(緩沖液A )。細胞的破碎是 通過一臺MSE soniprep 150超聲機(振幅14ji )裂解進行的，然后將 細胞裂解液在30000 x g離心30分鐘，之后將上清中的粗提物用硫酸 銨進行分級分離，發(fā)現(xiàn)在飽和度35%至55%之間的沉淀部分含有蟲熒 光素酶活性，將其溶于緩沖液A。
提取物在用舍有0.5mMDTT的50mM Tris-HCl pH8.0緩沖液(緩沖 液B )平衡的Pharmacia PD10柱上脫鹽，脫鹽后的提取物加于Pharmacia Mono Q陰離子交換柱，用具有從0至500mMNaCl線性梯度的緩沖液 B洗脫，流速為4ml/分鐘，每部分為2ml。收集蟲熒光素酶活性的峰 值部分并用含有0.5mM DTT和12。/。(v/v)甘油的pH 7.5的25mM硫酸 鈉緩沖液透析以利于長期保存。
實施例7:純化的蟲焚光素酶的熱失活
含有無細胞的蟲熒光素酶提取物的Eppendorf管如實施例6.中所述 進行準備。純化的蟲熒光素酶制備物在由PH7.8 50mM磷酸鉀緩沖液組成的熱穩(wěn)定緩沖液中溫育，該緩沖液包含10°/。飽和度'的硫酸銨、 lmM dithiothreitol和0.2y。的牛血清白蛋白(BSA)。在設定的時間取出一只試管，并在檢測前在冰/水浴中冷卻，檢測剩余活力占初始活力的百分比。
純化的重組野生型的和熱穩(wěn)定的蟲熒光素酶的阿里紐斯圖是通過測
量在熱穩(wěn)定緩沖液中從42 。C到50 。C的溫度范圍內(nèi)失活的半衰期來繪 制的'以分鐘記的11/2的自然對數(shù)對1/K作圖，在相同的失活速率下， E354K突變體的熱穩(wěn)定度在這一溫度范圍內(nèi)增加了 2 'C，與之相比， A215L突變體增加了 5 。C, E354K+A215L雙突變體增加了 6 。c ;后者
顯示了雙突變體的加和屬性，
實施例8:與野生型重組蟲熒光素酶相比，突變型蟲熒光素酶在大 腸桿菌體內(nèi)更高效的表達
檢測大腸桿菌JM109細胞在37 。C的液體培養(yǎng)基中生長時表達的熒 光素酶，發(fā)現(xiàn)表達熱穩(wěn)定突變體的細胞在生長過程中積聚的活性蟲熒 光素酶比表達重組野生型酶的細胞要多。圖13通過蟲熒光素酶的活性 與重組野生型、E3MK+A21SL雙突變體和E354K的培養(yǎng)基在60011111
處的光密度的增加圖示了這一結(jié)果?？梢钥吹剑瑔瓮蛔凅w和雙突變體 的提高的熱穩(wěn)定性允許在37 'C的培養(yǎng)溫度下生產(chǎn)更多的蟲熒光素酶。
實施例9:在37。C下，緩沖液對蟲熒光素酶突變體的穩(wěn)定性的影響
A215L、 E354K、 E354K+A215L 、重組野生型和西格瑪蟲焚光素 酶1 Ong/ml的溶液分別制備于含有1 % BSA和0.02%疊氮化物的HEPES pH17.5緩沖液，其在37 。C時的熱穩(wěn)定性與相同條件下加入2mMEDTA 和2mN DTT相比較。結(jié)果示于圖14和15 ，該結(jié)果說明A215L和E354K 的相對穩(wěn)定性在37 'C下隨緩沖液的不同而不同。
實施例10:氨基酸的取代對氧化D -蟲焚光素時所發(fā)出的光的波 長的影響
對用實施例3中列出的本發(fā)明的各種蟲焚光素酶氧化D -蟲熒光素所發(fā)射的光的波長進行測量，發(fā)現(xiàn)其隨氨基酸取代的不同而不同。重 組野生型(E354 )和E354K所發(fā)射的光的波長之間有Snm的差異， 而E35斗K和E3 5"之間有大約15nm的差異，
在D -蟲熒光素存在的情況下，野生型重組大腸桿菌有機體發(fā)出黃 綠色的_^。當加入D-蟲熒光素后，各突變大腸桿菌發(fā)出的光的顏 色如下
E354G黃綠色
E354N黃綠色
E354A綠色
E354V橙紅色
E354M橙紅色
E354F黃綠色
E354L黃色
E354Y黃綠色
E354S黃綠色
E354C黃綠色
E354K黃色
E354Q黃緣色
E354W黃綠色
E354T黃綠色
E354P橙色
E354R橙黃色
E354H黃綠色
E354N黃色e354i
紅色
序列表
() 一般信息 (1 )申請者
a)名稱the secretary of state for defence in her britannic majesty
b) 街名
c) 城市
e) 國家
f) 郵編
a) 姓名
b) 街名 q城市
d) 州名
e) 國家
f) 郵編
a) 姓名
b) 街名
c) 城市
d) 州名
e) 國家
f) 郵編
:a)姓名
b) 街名
c) 城市
:d)州名
e) 國家
f) 郵編
白廳 倫頓
英國(gb ) sw1a2hb
chrstopher robin lowe 劍橋大學；tennis court road
劍橋 劍橋郡 英國(gb )
cb21qt
peter john white
劍橋大學；tennis court road
劍橋 劍橋郡 英國(gb )
cb2
james augustus henry murray 劍橋大學；tennis court road 劍橋 劍橋郡 英國(gb )
cb2iqt
(A) 姓名DAVID JAMES SQUIRRELL
(B) 街名CBDE， PORTON DOWN
(C) 城市SALISBURY
(D) 州名WILTSHIRE
(E) 國家英國(GB )
(F) 郵編SP4 0JQ
(ii )發(fā)明名稱蟲熒光素酶 (Hi )序列數(shù)5
(iv )計算機可閱讀形式
(A) 介質(zhì)類型軟盤
(B) 計算機IBMPC兼容機
(C) 搡作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D) 軟件Patentln Release @1.0， Version @1.25 (EPO) (vi )以前申請資料
(A) 申請?zhí)朑B 9405750.2
(B) 提交日期1994年3月23曰 (vi )申請?zhí)朑B 9501170.6 (B)提交日期1995年1月20曰
(2 )第1號序列信息
(i )序列特性
(A) 長度1722個堿基對
(B) 類型核酸
(C) 鏈型雙鏈
(D) 拓樸結(jié)構(gòu)未知
(ii )分子類型DNA (染色體)
(iii )假設無
(iii )反義無
(vi )最初來源 (A)有機體Photinus pyralis
(ix )特性 (A)名稱/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置4..1653
(xi )序列描述第1號序列
<sequence>see original document page 22</sequence>
GATTACCTCG CCAGTCAAGT AACAACCGCG AAAAAGTTGC GCGGAGGACT TGTGTTTGTG 1560
GACGAAGTAC CGAAAGGTCT TACCGGAAAA CTCGACGCAA GAAAAATCAG AGAGATCCTC 1620
ATAAAGGCCA AGAAGGGCGG AAACTCCAAA TTCJTAAAATG TAACTGrTATT CAGCGATGAC 1680
GAMTTCTTA 'GCTATTGTAA TCCTCCGAGG CC丁CGAGGTC GA 1722
(2 )第2號序列信息 (i)序列特點
(A) 長度550個氨基酸
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓樸結(jié)構(gòu)未知
(H )分子類型蛋白質(zhì) (iii )假設無 (vi )最初來源 (A)有機體螟螢火蟲 (ix )特性
(A) 名稱/關(guān)鍵詞修飾位點
(B) 位置354
(xi )序列描述第2號序列
Met Glu Asp Ala Lys Asn lie Lys Lys
Leu
Tyr
Val
Glu Asp
Ala Leu 35
Asn lie 50
Gly 20
Thr Ala Gly Val Pro Gly Thr
Glu
工le 40
Gin 25
Thr
Glu 65
Ala Met Lys Cys Ser Glu Asn Phe工le Gly
Tyr Arg
Ala
Tyr 70
Glu 55
Ser 85
Val 100
Leu Gin Phe Phe Ala Val Ala Pro
Glu
L>eu Leu 115
Asn Ser Met Asn
lie 120
Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 10 巧
Leu His Lys Ala Met Lys Arg 30
Ala Phe Thr Asp Ala His lie Glu
Met Ser Val Arg Leu Ala 60
Asn His Arg lie Val Val
75 80
Met Pro Val Leu Gly Ala Leu 90 95
Asn Asp工le Tyr Asn Glu Arg 110
Ser Gin Pro Thr Val Val Phe Val 125
Tyr Phe Glu Gly Leu Asn Thr
Ala 105<formula>see original document page 24</formula> <sequence>see original document page 25</sequence>
(2 )第3號序列信息
(i )序列特點
(A) 長度22個堿基對
(B) 類型核酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓樸結(jié)構(gòu)未知
(H )分子類型DNA (染色體) (Hi )假設無 (vi )最初來源
(A)有機體螟螢火蟲 (ix )特性
(A) 名稱/關(guān)鍵詞misc-.區(qū)別
(B) 位置代替(10,"，，)
(xi )序列描述第3號序列 CATCCCCCTT GGGTGTAATC AG
(2 )第4號序列信息
(i )序列特點
(A) 長度27個堿基對
(B) 類型核酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓樸結(jié)構(gòu)未知
(ii )分子類型DNA (染色體) (iii )假設無 (vi )最初來源 (A)有機體螟螢火蟲 (ix )特性
(A) 名稱/關(guān)鍵詞misc-.區(qū)別
(B) 位置代替(16..17,"") (xi )序列描述第4號序列
GAATCTGACG CAGAGAGTTC TATGCGG
(2 )第5號序列信息
(i )序列特點
(A) 長度550個氨基酸
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈型單鏈
(D) 拓樸結(jié)構(gòu)未知
(ii )分子類型蛋白質(zhì)
(iii ) 假設無 (vi )最初來源 (A)有機體螟螢火蟲 (ix )特性
(A) 名稱/關(guān)鍵詞'.修飾位點
(B) 位置354 (ix )特性
(A) 名稱/關(guān)鍵詞修飾位點
(B) 位置215
(xi )序列描述'.第5號序列
<formula>see original document page 27</formula>
<formula>see original document page 28</formula>
權(quán)利要求
1.一種具有蟲熒光素酶活性的蛋白，其為可從螢火蟲中獲得的蟲熒光素酶的突變形式，其特征為對應于螟螢火蟲的蟲熒光素酶第354位殘基或明格列爾螢火蟲、十字螢火蟲和橫紋螢火蟲的蟲熒光素酶第356位殘基的氨基酸殘基是非谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或天門冬氨酸的氨基酸。
2. 權(quán)利要求1中的蛋白，其特征在于它包含一段氨基酸序列 XGDDKPGA,其中X是非谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或天門冬氨酸的 氨基酸殘基。
3. 權(quán)利要求2中的蛋白，其特征在于它包含一段氨基酸序列 TPXGDDKPGA,其中X是非谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或天門冬氨酸 的氨基酸殘基。
4. 權(quán)利要求l、 2或3中的蛋白，其特征在于氨基酸X是色氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和天門冬酰胺中的一種。
5. 權(quán)利要求l、 2或3中的蛋白，其特征在于氨基酸X是賴氨酸 或精氨酸中的一種。
6. —種包含第2號序列中所描述的氨基酸序列的蛋白，其中Xaa 是權(quán)利要求4或5中所列的一種氨基酸。
7. 權(quán)利要求1、 2、 3、 6任一權(quán)項中的蛋白，其特征為對應于螟 螢火蟲的蟲熒光素酶第215位殘基或明格列爾螢火蟲、十字螢火蟲和 橫紋螢火蟲的蟲熒光素酶第217位殘基的氨基酸殘基是疏水氨基酸。
8. 權(quán)利要求7中的蛋白，其中疏水氨基酸是異亮氨酸、亮氨酸或 纈氨酸中的一種。
9. 一種蛋白，其含有第5號序列所示的氨基酸序列，其中Xaa是 權(quán)利要求4或5中所列的一種氨基酸。
10. 編碼權(quán)利要求1至9任一權(quán)項中的蛋白的DNA。
11. 權(quán)利要求10中的DNA,它包含如第1號序列所描述的核 苷酸序列，其中在1063至1065位的三個N堿基形成編碼非谷氨酸、 甘氨酸、脯氨酸或天門冬氨酸的氨基酸密碼子。
12. 權(quán)利要求11中的DNA，其中的密碼子編碼權(quán)利要求4或5 中所列的氨基酸。
13. 權(quán)利要求10中的DNA,其包含第1號序列所示的核苷酸 序列，其中在1063至1065位的三個N堿基形成編碼非谷氨酸、甘 氨酸、脯氨酸或天門冬氨酸的氨基酸的密碼子，在646至648位的三 個堿基形成編碼疏水氨基酸的密碼子。
14. 權(quán)利要求13中的DNA，其中第646和647位的堿基分別 是C和T。
15. —種包含編碼權(quán)利要求1至8任一權(quán)項中的蛋白的/wc基因 的載體。
16. 權(quán)利要求15中的載體，它可以通過將包含野生型或重組型 /wc基因的載體進行定點基因突變得到，該突變將編碼螟螢火蟲的蟲 熒光素酶第354位的谷氨酸或明格列爾螢火蟲、十字螢火蟲或橫紋螢 火蟲的蟲萸光素酶第356位的谷氨酸的密碼子改變成編碼其它氨基酸 的密碼子。
17. 權(quán)利要求16中的載體，其中其它氨基酸是權(quán)利要求4或5 中列出的一種氨基酸。
18. 權(quán)利要求10至12任一4又項中的載體，它選自連接了/wc基 因的pKK223-3、 pDR540和pT7-7。
19. 一種載體，其含有權(quán)利要求10至14任一權(quán)項中的DNA。
20. —種可以表達權(quán)利要求1至9任一權(quán)項中的蛋白的細胞， 它含有權(quán)利要求10至14任一權(quán)項中的DNA或權(quán)利要求15- 19任 一權(quán)項中的載體。
21. 權(quán)利要求20中的細胞，它是大腸桿菌、啤酒酵母或昆蟲細胞。
22. —種通過測量ATP來進行檢測的測試試劑盒，其特征在于 該試劑盒所含的熒光試劑中含有權(quán)利要求1至9任一權(quán)項中的蛋白。
23. —種檢測方法，其中ATP的測量是通過蟲熒光素和蟲熒光 素酶產(chǎn)生光來進行的，所產(chǎn)生光的量與ATP的數(shù)量有關(guān)，該方法的 特征在于蟲熒光素酶是權(quán)利要求1至9任一權(quán)項中的蛋白。
24. 權(quán)利要求23中的檢測方法，其中檢測是在30°C至70°C的 溫度下進行的。
25. 權(quán)利要求24中的檢測方法，其中檢測是在37°C至60°C的 溫度下進行的。
26. 權(quán)利要求25中的檢測方法，其中檢測是在40°C至50°C的 溫度下進行的。
27. 將權(quán)利要求1至9任一權(quán)項中的具有蟲熒光素酶活性的蛋 白用作特異性結(jié)合試劑標記的應用。
28. —種檢測試劑盒，其特征在于它包含用權(quán)利要求1至6任 一權(quán)項的具有蟲熒光素酶活性的蛋白標記的特異性結(jié)合試劑。
29. 將權(quán)利要求10至15任一權(quán)項中編碼蟲焚光素酶的DNA用 于表明細胞或DNA特性的應用。
30. 將權(quán)利要求15至19任一^L項中的載體用于表明細胞或DNA 特性的應用。
全文摘要
本發(fā)明通過將對應于Photinus pyralis蟲熒光素酶第354位或Luciola蟲熒光素酶第356位的谷氨酸替換成其它的氨基酸，尤其是賴氨酸的方法，提供了具有比野生型蟲熒光素酶更高的熱穩(wěn)定性的具有蟲熒光素酶活性的蛋白。本發(fā)明還提供了編碼或表達該蛋白的DNA、載體或細胞，它們被用作使用本發(fā)明蛋白的進行熒光檢測的測試試劑盒或試劑。優(yōu)選的蛋白在相當于Photinus pyralis蟲熒光素酶第215位或Luciola蟲熒光素酶第217位的位置有第二個替換的氨基酸。
文檔編號C12N9/02GK101173254SQ200710142238
公開日2008年5月7日 申請日期1995年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月23日
發(fā)明者C·R·勞韋, D·J·施柯雷爾, J·A·H·默雷, P·J·懷特 申請人:大不列顛及北愛爾蘭聯(lián)合王國國防大臣