專利名稱：：基因工程改造的藍(lán)細(xì)菌及其生產(chǎn)乙醇的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物能源
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株、篩選藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株的方法、導(dǎo)入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒表達(dá)載體、導(dǎo)入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列的上述集胞藻突變株、以及上述突變株在制備乙醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自250多年前英國的工業(yè)革命以來，人類社會(huì)的發(fā)展便與能源的使用息息相關(guān)。隨著全球經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，以石油，煤炭和天然氣為主的化石能源的開發(fā)和使用問題顯得日益突出其一，石油，煤炭和天然氣等都是不可再生的資源，不久的將來它們會(huì)被消耗枯竭；其二，美國等發(fā)達(dá)國家對(duì)進(jìn)口石油的依賴，使得世界局部地區(qū)的動(dòng)蕩即可產(chǎn)生油價(jià)的巨大變化，直接影響到經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定、甚至是國家安全；其三，使用傳統(tǒng)化石能源會(huì)排放大量二氧化碳等溫室氣體，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和全球性的氣候變化。所以，現(xiàn)在能源問題和環(huán)境問題已成為國際高峰會(huì)談最重要的議題。為了保障能源安全，保護(hù)環(huán)境，走可持續(xù)發(fā)展的道路，替代能源和可再生能源獲得了各國越來越多的重視?？稍偕茉粗?，生物質(zhì)能的發(fā)展最為迅速。生物質(zhì)(Biomass)主要指的是自然界中的各類植物，包括農(nóng)作物，通過光合作用將太陽能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能蘊(yùn)涵在植物有機(jī)體內(nèi)。建立在生物質(zhì)發(fā)酵法的燃料乙醇生產(chǎn)，是以谷物、玉米、小麥、薯類、糖蜜等為原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾制得，將發(fā)酵法乙醇進(jìn)一步脫水后形成變性燃料乙醇。生物質(zhì)乙醇生產(chǎn)存在許多缺憾之處。首先，它將爭奪消耗眾多的植物資源，使得糧食、飼料的供應(yīng)出現(xiàn)緊缺。其次，生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇需要考慮原料和乙醇運(yùn)輸問題，生物質(zhì)預(yù)處理以及固體廢棄物處理等問題。再者，生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇生產(chǎn)過程排放的溫室氣體二氧化碳將加劇全球溫度的升高。為克服上述新能源生產(chǎn)存在的問題，有必要研發(fā)新型生物技術(shù)用以生產(chǎn)乙醇。對(duì)此，加拿大EnnolEnergyInc.申請(qǐng)'的專利(美國專利號(hào)6，306，639，2001年；和6，699，696，2004年)以及美國夏威夷大學(xué)申請(qǐng)的美國專利("MethodsandCompositionforEthanolProducingCyanobacteria",pending,2007年)均涉及通過基因工程改造的藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)乙醇。但是加拿大EnnolEnergyInc.專利技術(shù)存在如下缺陷a、藍(lán)細(xì)菌單胞藻Sy"ec/20coccwPCC7942使用咸水培養(yǎng)液，生產(chǎn)線不易清洗，設(shè)備和管道易受鹽分腐蝕；b、啟動(dòng)子為溫度誘導(dǎo)，必須升高溫度以表達(dá)乙醇生產(chǎn)基因。這會(huì)影響藍(lán)細(xì)菌單胞藻活性；c、無耐熱耐乙醇性能；d、乙醇生產(chǎn)濃度低；e、乙醇生產(chǎn)基因pdc和adh以質(zhì)粒形式存在于單胞藻7942中，穩(wěn)定性不好。需要使用大量抗生素維持單胞藻菌株內(nèi)質(zhì)粒的穩(wěn)定性，因而提高了生產(chǎn)成本。另外，對(duì)于美國夏威夷大學(xué)專利技術(shù)，其存在的問題為-a、藍(lán)細(xì)菌集胞藻6803的乙醇生產(chǎn)基因表達(dá)啟動(dòng)子為光誘導(dǎo)，夜間或陰天時(shí)乙醇生產(chǎn)效率下降；b、無耐熱性能，插入來自O(shè)e"ococcwsoew'的omrA基因或同源基因(丄m"，ZmrCD)提高耐乙醇性能沒有得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確認(rèn)；c、乙醇生產(chǎn)濃度不夠高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了不懈的研究，結(jié)果通過定向進(jìn)化藍(lán)細(xì)菌集胞藻6803(購自美國AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，ATCCNumber:27184)而獲得其突變株Synechocystisstrictus(簡稱為S.strictus)，該突變株具有較強(qiáng)的耐熱耐乙醇性能。進(jìn)一歩地，本發(fā)明人通過基因工程的手段對(duì)該菌株進(jìn)行操作，最終使得集胞藻突變株能夠集光合作用，二氧化碳收集和乙醇生產(chǎn)三功能于一體，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種藍(lán)細(xì)菌集胞藻的突變株、篩選這種集胞藻的突變株的方法、導(dǎo)入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒表達(dá)載體、導(dǎo)入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列的上述集胞藻突變株、以及上述突變株在制備乙醇中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案1、藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其保藏號(hào)為CGMCCNO.2137。2、篩選上述1所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻的方法，其使用了熱休克的方法。3、藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其為在上述1所述的藍(lán)細(xì)菌中導(dǎo)入了編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的多核苷酸。4、上述3所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其中所述的多核苷酸為(a)多核苷酸，其含有由序列號(hào)1堿基序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有與序列號(hào)1的堿基序列組成的多核苷酸或序列號(hào)1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；或(C)多核苷酸，其為序列號(hào)1的堿基序列或其互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸。5、上述4所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其進(jìn)一步含有硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。6、上述5所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其中所述的啟動(dòng)子為(a)多核苷酸，其含有由序列號(hào)2堿基序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有與序列號(hào)2的堿基序列組成的多核苷酸或序列號(hào)2的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性的多核苷酸；或(c)多核苷酸，其為序列號(hào)2的堿基序列和/或其互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸。7、上述3-6任意一項(xiàng)所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其中所述的編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的多核苷酸和/或啟動(dòng)子是由質(zhì)粒表達(dá)載體所承載。8、上述7所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其中所述的質(zhì)粒表達(dá)載體序列為序列號(hào)3所示的序列。9、上述1-8任意一項(xiàng)所述的藍(lán)細(xì)菌在生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。圖1重組質(zhì)粒pSKBPDC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2重組質(zhì)粒pPDCNIRA的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3在戶外利用光生物反應(yīng)器觀察乙醇生成率的試驗(yàn)，其中圖3a為溫度變化曲線，圖3b為細(xì)胞濃度和乙醇生產(chǎn)能力。具體實(shí)施例方式對(duì)于所有能夠生產(chǎn)乙醇的微生物細(xì)胞(例如大腸桿菌，酵母菌，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌等)而言，已知乙醇生產(chǎn)路徑是從糖酵解途徑的丙酮酸經(jīng)過乙醛再到末端代謝產(chǎn)物乙醇。丙酮酸到乙醛的反應(yīng)過程由丙酮酸脫羧酶基因pdc控制，乙醛到乙醇的反應(yīng)過程由乙醇脫氫酶基因adh控制。藍(lán)細(xì)菌存在地球已有35億年以上，是地球上最古老的生物之一。它的適應(yīng)能力非常強(qiáng)，可忍受高溫，冰凍，缺氧，干涸及高鹽度，強(qiáng)輻射等許多惡劣生存條件。由于其基因組中不存在丙酮酸脫羧酶基因pdc，造成野生株集胞藻6803的乙醇生產(chǎn)路徑殘缺，因而不具有乙醇生產(chǎn)能力。本發(fā)明采用基因工程的方法，對(duì)一種低等水生綠色植物藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria，簡稱藍(lán)細(xì)菌，俗稱藍(lán)綠藻或藍(lán)藻)進(jìn)行改造。從而使得藍(lán)細(xì)菌吸收太陽光中的能量，直接將二氧化碳轉(zhuǎn)換為乙醇。本發(fā)明使用的藍(lán)細(xì)菌集胞藻Synechocystissp.PCC6803(以下簡稱為"集胞藻6803")是一種非絲狀和非固氮淡水菌株，兼具自養(yǎng)和異養(yǎng)生長能力。集胞藻6803是第一個(gè)基因組被完全測(cè)序的光自養(yǎng)微生物(Ikeuchietal.,TanpakushitsuKakusanKoso1996,41(16):2579-2583)，這為藻類基因工程的發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。集胞藻6803可以融合外源DNA，通過同源重組把外源DNA整合到染色體DNA上。因?yàn)槟軌蜃匀晦D(zhuǎn)化，它的基因組可通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行精確調(diào)節(jié)(Aoki"a/.,JMicrobiolMethods2002,49(3):265-74.,Vermaasda/"ProcNatlAcadSciUSA,1986,83(24):9474-9477,Williams,MethodsEnzymol.，1988,167:766—778)。所以，集胞藻6803是一種研究利用植物放氧光合作用的生物和代謝過程的理想系統(tǒng)。它也是藻類基因工程研究中常用的表達(dá)系。人們已將解毒酶基因、人源超氧化物歧化酶基因及小鼠金屬硫蛋白基因成功地轉(zhuǎn)入到集胞藻6803中(孫軍.生物工程進(jìn)展，1994，14(6):3942)。本發(fā)明是利用基因工程技術(shù)人工合成丙酮酸脫羧酶pdc和nirA啟動(dòng)子，將其與高表達(dá)質(zhì)粒載體PSKAIIKS連接，構(gòu)建出了重組質(zhì)粒pPDCNIRA，然后將其插入以"熱休克"定向進(jìn)化而篩選的藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株51.^7'd"5,從而連通乙醇合成路徑，構(gòu)建出重組菌株，其中所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株S.具有很強(qiáng)的耐熱耐乙醇能力。構(gòu)建出的該重組菌株可以用硝酸鹽誘導(dǎo)，高效地利用太陽光能和二氧化碳生產(chǎn)乙醇，從而使得該集胞藻重組菌株能夠集光合作用，二氧化碳收集和乙醇生產(chǎn)三功能于一體。本發(fā)明的發(fā)明人通過"定向進(jìn)化"的方法提高集胞藻6803耐熱耐乙醇能力。使用二氧化碳(co2)作為碳源的大規(guī)模燃料乙醇生產(chǎn)需要采用室外封閉式管道藍(lán)細(xì)菌集胞藻工業(yè)用光合生物反應(yīng)器系統(tǒng)并且在日間采集太陽光滿足藍(lán)細(xì)菌光合反應(yīng)的需求。一般集胞藻的生長溫度在3(TC左右，而夏季中午室外溫度可能高達(dá)4CTC以上，這對(duì)集胞藻的正常生長和燃料乙醇生產(chǎn)能力帶來了不利的影響。例如，野生株集胞藻6803在未加溫度控制的室外光合生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，使用BG-ll培養(yǎng)液。由于日間的高溫很快便使得藍(lán)細(xì)菌葉綠素全部失活，從而產(chǎn)生"白化"現(xiàn)象，失去生長能力；再者，野生株集胞藻6803加溫度控制的實(shí)驗(yàn)室光合生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，采集50毫升置于小瓶中，放入45。C水浴箱內(nèi)"熱休克"二小吋后取出。放回30。C搖床培養(yǎng)，三天后藍(lán)細(xì)菌同樣產(chǎn)生了完全的"白化"現(xiàn)象。燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)如果需要增加溫度控制，將會(huì)額外增加設(shè)備和能源方面的投資。本發(fā)明的發(fā)明人采用了"定向進(jìn)化"的方法提高藍(lán)細(xì)菌耐熱能力，使其能夠在高溫條件下正常生長和生產(chǎn)燃料乙醇，從而避免了溫度控制的需要。藍(lán)細(xì)菌突變株提高耐熱能力的同時(shí)，也會(huì)提高耐乙醇能力。由"定向進(jìn)化"獲得的藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株除了耐熱能力之外，還具有耐乙醇能力。使用藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)燃料乙醇的一大問題是當(dāng)乙醇在培養(yǎng)液中積累到一定的濃度(例如5%濃度)，就會(huì)阻礙藍(lán)細(xì)菌的生長。當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加，藍(lán)細(xì)菌可能開始死亡。提高藍(lán)細(xì)菌集胞藻耐乙醇能力成為燃料乙醇生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵因素。最新研究結(jié)果表明，溫度升高，乙醇濃度增加等外界不利因素，對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生類似的應(yīng)力，都會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白高度表達(dá)(Royetal.,JOURNALOFBACTERIOLOGY,180(15):39974001,1998;Glatzetal,ActaBiologicaSzegediensis.46(3-4):53,2002)。同時(shí)，研究結(jié)果表明也表明，耐熱耐乙醇具有交互性(Micheletal.,1986)。當(dāng)大腸桿菌，酵母菌和藍(lán)細(xì)菌的抗熱能力增加時(shí)，它們的抗乙醇能力也同時(shí)增力B(Horvathetal.,Biochemistry,95:3513—3518，1998)。在野生株藍(lán)細(xì)菌和"定向進(jìn)化"藍(lán)細(xì)菌菌株中加入5%乙醇進(jìn)行培養(yǎng)，三天后發(fā)現(xiàn)野生株藍(lán)細(xì)菌集胞藻6803出現(xiàn)"白化"，而"定向進(jìn)化"的集胞藻突變株未受影響。本發(fā)明將通過上述定向進(jìn)化而篩選的藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株命名為藍(lán)細(xì)菌集胞藻6)，te"erj's加ecte/"/s(簡稱為6:"/7'"^)，該微生物于2007年8月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行了保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNO.2137)。本發(fā)明釆用分子克隆技術(shù)將人工合成的丙酮酸脫羧酶基因pdc(序列號(hào)1)和可用硝酸鹽誘導(dǎo)的nirA啟動(dòng)子(序列號(hào)2)與藍(lán)細(xì)菌集胞藻6803的同源高表達(dá)質(zhì)粒載體PSKAIIKS連接,構(gòu)建出了重組質(zhì)粒pPDCNIRA，再轉(zhuǎn)入上述藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株，從而構(gòu)建出重組菌株，該工程菌可以用硝酸鹽誘導(dǎo)，高效地利用太陽光能和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明采用化學(xué)誘導(dǎo)的nirA啟動(dòng)子(不受溫度，光照影響)達(dá)到穩(wěn)定高效的乙醇生產(chǎn)基因表達(dá)，提高乙醇生產(chǎn)效率；而且本發(fā)明采用"熱休克"定向進(jìn)化獲取具有耐熱耐乙醇性能的藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株。另夕卜，相比而言，EnnolEnergyInc.和夏威夷大學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均產(chǎn)生自實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光生化反應(yīng)器，而本發(fā)明人除了用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光生化反應(yīng)器外，還使用戶外實(shí)驗(yàn)裝置獲得了比它們更高的乙醇生產(chǎn)結(jié)果。為獲得生產(chǎn)乙醇的本發(fā)明的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，可將編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的多核苷酸導(dǎo)入上述所獲得的藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株，只要導(dǎo)入的多核苷酸能夠編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽就能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的，這樣的多核苷酸優(yōu)選為序列號(hào)l所示的序列。另一方面，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明所使用的酮酸脫羧酶基因和可用硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列并不限于序列號(hào)l和序列號(hào)2所述的序列，編碼具有酮酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的其它多核苷酸或核酸以及其它的可被硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列均可用于本發(fā)明。例如，本發(fā)明所述的丙酮酸脫羧酶基因以及可用硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列也包含如下多核苷酸，其含有與序列號(hào)l或序列號(hào)2堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且具有丙酮酸脫羧酶活性或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性的多核苷酸，或者其含有與序列號(hào)1或序列號(hào)2堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且具有丙酮酸脫羧酶活性或硝酸鹽誘導(dǎo)的化學(xué)啟動(dòng)子活性的多核苷酸。此處的"在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸"，是指由序列號(hào)1或序列號(hào)2的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。雜交方法，例如可禾U用MolecularCloning3rdEd.、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons1987-1997等中所述的方法。對(duì)于本說明書中所述的"嚴(yán)格條件"，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、32。C的條件；或者，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42。C的條件；或者，例如，為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50。C的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴(yán)格性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適宜選擇這些因素，可實(shí)現(xiàn)同樣的嚴(yán)格條件。還需要注意的是，本文所述的乙醇不僅僅指燃料乙醇，其它用途的乙醇也包含在本發(fā)明之內(nèi)。以下，通過實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1具體操作野生株集胞藻6803接種在光合生物反應(yīng)器組內(nèi)(由一個(gè)改裝搖床內(nèi)置6個(gè)150ML搖瓶組成，工作液為50ML)，且由BG-ll培養(yǎng)液培養(yǎng)，搖床內(nèi)置光源，反應(yīng)器表面光強(qiáng)度約為200Einstein/m2/s。搖床溫度調(diào)控在低于30°C，速度為200RPM。5天后放入熱水浴箱內(nèi)加溫?zé)嵝菘?。然后放?0。C光合生物反應(yīng)器內(nèi)，待產(chǎn)生了完全的"白化"現(xiàn)象后(約3天)，離心分離集胞藻6803細(xì)胞，倒掉上清液，使用新鮮BG-11培養(yǎng)液培養(yǎng)"白化"的集胞藻6803細(xì)胞。適應(yīng)了熱休克的集胞藻細(xì)胞將會(huì)重新生成葉綠素，進(jìn)而恢復(fù)光合作用和生長能力。同時(shí)，細(xì)胞的代謝機(jī)理會(huì)發(fā)生緩變，集胞藻突變株將能適應(yīng)溫度的升高。本發(fā)明人花費(fèi)了一年的時(shí)間反復(fù)進(jìn)行上述藍(lán)細(xì)菌集胞藻細(xì)胞熱休克-白化-復(fù)蘇的"定向進(jìn)化"過程，逐漸增加溫度(從35。C升到47°C)和熱休克時(shí)間(從30分鐘升到4小時(shí))。最后得到了本發(fā)明保藏的集胞藻突變株，其能在夏季室外高溫條件(>45。C)下正常生長。實(shí)施例2:丙酮酸脫羧酶基因pdc和nirA啟動(dòng)子設(shè)計(jì)由生物信息學(xué)的方法，很容易獲得丙酮酸脫羧酶基因pdc和nirA啟動(dòng)子的序列(本發(fā)明的發(fā)明人使用日本KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes提供的搜索引擎http://www.kegg.com/獲得丙酮酸脫羧酶基因pdc和nirA啟動(dòng)子的序列)。Pdc(序列號(hào)1)和nirA(序列號(hào)2)可以依次用人工合成的方法獲得(Roy,etal.EuropeanJournalofBiochemistry.191(3):647-652，1990;Shabalina,etal.NucleicAcidsRes.34:2428-2437，2006;Satyaetal.ProcIEEEComputSocBioinformConf.2:294-305，2003;Kim，etal.Gene.199:293-301，1997)。將上述獲得的序列用Sanger方法(F.Sanger,Science,214,1215，1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。實(shí)施例3:pdc基因轉(zhuǎn)化集胞藻突變株根據(jù)藍(lán)細(xì)菌集胞藻6803內(nèi)源質(zhì)粒PSBAIIKS中氨卡青霉素抗性基因、和果聚糖蔗糖酶基因^cfi的位置和序列，為轉(zhuǎn)化丙酮酸脫羧酶基因pdc設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物P1(序列號(hào)4)和P2(序列號(hào)5):P1(5端引物)5，誦GGAGTAAGCATATGAGTTATACTG國3，NdelP2(3'端引物)5,-GGATCTCGACTCTAGAGGATCC-3,BamHI其中引物Pl設(shè)計(jì)了一個(gè)NdeI酶切位點(diǎn)，其序列為CAITATG，引物P2設(shè)計(jì)了一個(gè)BamHI酶切位點(diǎn)，其序列為GGATCIC。以常規(guī)PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增后得1410bp的pdcDNA片段P。PCR反應(yīng)物在0.5mL無菌離心管中依次加入去離子水3610XTaq酶緩沖液5fxl;4XdNTP(2.5mmol/L)5pl;Pl引物l^il;P2引物1^1;模板(即人工合成的pdc)Taq酶(3U/fi1)lfil。共50pl。PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)首先94'C預(yù)變性5分鐘.；接著94"C變性30秒.；50。C復(fù)性45秒.；72。C延伸50秒；35個(gè)循環(huán)；72。C再延伸5分鐘.；4'C終止。反應(yīng)結(jié)束后，取2.5^1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(2XTAE,100V電壓，40分鐘)，在電泳圖譜上出現(xiàn)一條約1410bp亮帶，表明要擴(kuò)增的是預(yù)期要轉(zhuǎn)化的pdc基因片段。電泳回收1410bp片段。根據(jù)引物中的酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶Ndel和BamHI同時(shí)雙酶切片段P和載體PSBAIIKS，然后用T4DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌co//C600，通過Amp篩選獲得重組質(zhì)粒pSKBPDC，該質(zhì)粒大小為5.58kb(圖1)。如圖1所示，人工合成的丙酮酸脫羧酶基因pdc被插入啟動(dòng)子psbAII的下游，即原來aphX和sacB基因的位置。利用自然轉(zhuǎn)化將整合表達(dá)載體導(dǎo)入集胞藻突變株S.Wn'"M，并通過單交換同源重組使人工合成的丙酮酸脫羧酶基因pdc整合到集胞藻突變株51.Wn'"w染色體上。轉(zhuǎn)化后，先將含藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株S.WnW^細(xì)胞的BG-ll培養(yǎng)液涂布在復(fù)蓋在不含氨芐青霉素(Amp)的BG-11固體培養(yǎng)基上的Millipore濾膜上培養(yǎng)20小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移濾膜至含氨芐青霉素濃度為15pg/ml的BG-ll固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。一周后，濾膜上出現(xiàn)抗Amp的綠色單藻落，即為轉(zhuǎn)化集胞藻菌株。重復(fù)BG-ll固體培養(yǎng)基培養(yǎng)并逐步提高氨節(jié)青霉素濃度，可篩選得到遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因集胞藻突變株S.Wn'"w。為了證明外源基因已整合到集胞藻突變株51.WW"^染色體上，從而整個(gè)乙醇合成路徑(丙酮酸—乙醛—乙醇)已被連通，使用希夫試劑(Schiff，sreagent)測(cè)試乙醛的生成。野生株集胞藻6803沒有pdc基因，不能催化丙酮酸—乙醛反應(yīng)，希夫試劑加在BG-ll固體培養(yǎng)基上的野生株集胞藻6803菌落時(shí)，沒有顏色變化。然而，希夫試劑加在BG-ll固體培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因集胞藻突變株S.^7'"^菌落時(shí)，菌落及周邊變成暗紅色。表明集胞藻產(chǎn)出的乙醛與希夫試劑發(fā)生反應(yīng)。實(shí)施例4:nirA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化集胞藻本發(fā)明人進(jìn)一歩用硝酸鹽誘導(dǎo)nirA啟動(dòng)子置換pSKBPDC中的psbAII啟動(dòng)子，從而變光誘導(dǎo)為化學(xué)誘導(dǎo)。nirA啟動(dòng)子引物設(shè)計(jì)如下Tl(序列號(hào)6)(5'端引物)5，—GAGAGAGAGCTGCAGAGCGTTCCAGTGGATATT-3'PstlT2(序列號(hào)7)(3'端引物)5，-ATTATATATATCATATGTTCATCTGCCTACAAAGCAGC-3'Ndel其中引物Tl設(shè)計(jì)了一個(gè)PstI酶切位點(diǎn)，其序列為CTGCA1G，引物T2設(shè)計(jì)了一個(gè)NdeI酶切位點(diǎn)，其序列為CA1TATG。以常規(guī)PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增后得528bp的nirA片段T。PCR反應(yīng)物在0.5mL無菌離心管中依次加入去離子水3610XTaq酶緩沖液5|il;4XdNTP(2.5mmol/L)5jxl;Pl弓l物P2引物liil;模板(即人工合成的nirA啟動(dòng)子)l)til;Taq酶(3U/iul)1^1?？偣?0pl。PCR反應(yīng)條件與擴(kuò)增1410bp的pdcDNA片段P相同。反應(yīng)結(jié)束后，取2.5^1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(2XTAE，100V電壓，40分鐘)，在電泳圖譜上出現(xiàn)一條約528bp亮帶，表明要擴(kuò)增的是預(yù)期要轉(zhuǎn)化的nirA啟動(dòng)子片段。電泳回收528bp片段。根據(jù)引物中的酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶Pstl和Ndel同時(shí)雙酶切片段T和載體質(zhì)粒pSKBPDC，然后用T4DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌五.co//C600，以Amp篩選，獲得重組質(zhì)粒pPDCNIRA(圖2)，該質(zhì)粒大小為5.96kb。利用自然轉(zhuǎn)化將整合表達(dá)載體導(dǎo)入集胞藻突變株S.欲/c加。轉(zhuǎn)化后，先將含藍(lán)細(xì)菌集胞藻S.細(xì)胞的BG-ll培養(yǎng)液涂布在不含氨芐青霉素(Amp)的BG-ll固體培養(yǎng)基上的Millipore濾膜上，并培養(yǎng)20小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移濾膜至含氨芐青霉素濃度為5)Lig/ml的BG-ll固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。一周至10天后，濾膜上出現(xiàn)抗Amp的綠色單藻落，即為轉(zhuǎn)化集胞藻菌株。重復(fù)BG-ll固體培養(yǎng)基培養(yǎng)并逐步提高氨芐青霉素濃度(至濃度為15|ag/ml),可篩選得到遺傳性狀穩(wěn)定的集胞藻突變株S.WW^^工程菌。挑取生長好的不同藻落接種到6個(gè)150ML搖瓶組成，BG-ll培養(yǎng)液工作液位為50ML的光合生物反應(yīng)器組培養(yǎng)，搖床內(nèi)置光源，反應(yīng)器表面光強(qiáng)度約為200Einstein/m2/s。搖床溫度調(diào)控在低于30°C，速度為200RPM。5天后，從6個(gè)反應(yīng)器各取lml懸浮液，離心得上清液。用酶反應(yīng)試劑(R-Biopharm,Inc.,Marshall,MI,USA)測(cè)乙醇的生成濃度。經(jīng)比較得乙醇高產(chǎn)集胞藻突變株S.欲&加菌株。實(shí)施例5:實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光生物反應(yīng)器培養(yǎng)觀察乙醇生成率液體培養(yǎng)實(shí)施例4中獲得的集胞藻突變株S.^7'"M工程菌不但能確定外源基因已經(jīng)得到高效表達(dá)，而且還提供優(yōu)化生物反應(yīng)過程的可能性。本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光生物反應(yīng)器為1升(CelliGenPlus,NewBrunswickScientificInc.,Edison,NJ,USA)。該系統(tǒng)自帶溫度，pH，轉(zhuǎn)速，溶氧等測(cè)量和控制器。在此基礎(chǔ)上，加裝可調(diào)節(jié)光源，使反應(yīng)器外壁光強(qiáng)達(dá)1000Einstein/m2/8。并設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)采樣和控制系統(tǒng)，軟件則用LabVIEW6.0(NationalInstrumentsCorp.,Austin,TX,USA)編程。在此系統(tǒng)中，硝酸鹽誘導(dǎo)乙醇合成是在集胞藻工程菌細(xì)胞光學(xué)密度達(dá)OD730=0.5時(shí)開始的。結(jié)果，藍(lán)細(xì)菌集胞藻工程菌生產(chǎn)的乙醇濃度可達(dá)14mM。實(shí)施例6:利用戶外光生物反應(yīng)器觀察乙醇生成率在戶外使用10升光生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)實(shí)施例4中獲得的藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株S.Wr/"附工程菌。用控制pH的方式控制二氧化碳的加入量。溫度不加控制。該自制反應(yīng)器由玻璃制成，上升管中加置內(nèi)件可以有效地促進(jìn)氣泡的分散，改善氣液兩相的混合，強(qiáng)化二氧化碳傳遞過程。圖5a為溫度變化曲線，圖5b為細(xì)胞濃度和乙醇生產(chǎn)能力。硝酸鹽誘導(dǎo)乙醇合成是在集胞藻工程菌細(xì)胞光學(xué)密度達(dá)0073。=0.5時(shí)開始的。結(jié)果乙醇濃度可達(dá)50mM，比室內(nèi)光生物反應(yīng)器結(jié)果提高了約5倍。為了更清楚地理解本發(fā)明，將本發(fā)明與另外兩個(gè)同類相關(guān)發(fā)明進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110〉黃娟<120〉基因工程改造的藍(lán)細(xì)菌及其生產(chǎn)乙醇的用途〈130〉PIF072427C〈160〉7〈170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉1766〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>首先根據(jù)生物信息學(xué)的方法獲取序列信息然后人工合成的序列〈400〉1atgagttatactgtcggtacctatttagcgg解cggcttgtccagattggtctcaagcat60cacttcgcagtcgcgggcgactacaacctcgtccttcttgacaacctgct120aacatggagcaggtttattgctgtaacgaactgaactgcggtttcagtgcagaaggttat180gctcgtgcca卿gcgcagcagcagccgtcgttacctacagcgtcggtgcgctttccgca240tttgatgctatcggtggcgcctatgcagaaaaccttccggttatcctgatctccggtgct300ccg朋c朋caatgatcacgctgctggtcacgtgttgcatcacgctcttgg360tatcactatcggccaagaacatcacggccgcagctgaagcgatttacacc420ccagaagaagctccggctaaaatcgatcacctgctcttcgtgag^g犯g■ccggtttatctcgaaatcgcttgca^cattgcttccatgccctgcgccgctcctggaccg540gcaagcgcattgttcaatgscgaagccagcgacga已gcttctttgaatgc3gcggttg皿600gaaaccctgaaattcatcgccaaccgcgacaaagttgccgtcctcgtcggcagcaagctg660cgcgcagctggtgctga卿agctgctgtcaaatttgctgatgctctcggtggcgcagtt720gctaccatggctgctgcaaaaagcttcttcccagaagaaaacccgcattacatxggtacc780tcatggggtgaagtcagctatccgggcgtttga犯gaagccgatgcggtt840atcgctctggctcctgtcttcaacgactactccaccactggttggacggatattcctgat900tggttctcgctgaaccgcgttctgtcgtcgttaacggcgttcgcttcccc960agcgttcatctgaaagactatctgacccgtttggctcaga33gtttCC33gaaaaccggt1020gctttggacttcttcaaatccctcaatgcaggtgaactgaagaaagccgctccggctgat1080ccgagtgctccgttggtcaaCgC3g3a3tCgcccgtcaggtcgaagctcttctgaccccg1140aacacgacggttattgctgaaaccggtgactcttggttcaatgctcagcgcatgaagctc1200ccgaacggtgCtCgCgttg￡Latatgaaatgcagtggggtcacatcggttggtccgttcct1260gccgccttcggttatgccgtcggtgctccggaacgtcgcaacatcctcatggttggtgat1320ggttccttccagctgacggctcaggaagtcgctcagatggttcgcctgaaactgccggtt1380atcatcttctctatggttacaccatcgaagttatgatccatgatggtccg1440tcaagaactgggattatgccggtctgatggaagtgttcaacggtaacggt1500ggttatgacagcggtgctggtaaaggcctgaaggctaaaaccggtggcgaactggcagaa1560gctatcaaggttgctctggcaaacaccgacggcccaaccctgatcgaatgcttcatcggt1620cgtgaagactgcactgaagaattggtcaaatggggtaagcgcgttgctgccgccaacagc1680cgtaagcctgttaac33gctcctctagtttttggggatcaattcgagctcggtacccaaa1740ctagtatgtagggtgaggtt1766〈210〉2<211〉528〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉啟動(dòng)子〈400〉2g卿g卿gctgc卿gcgttccagtggatatttgctgggggttaatgaaacattgtggc60ggaacccagggacaatgtgaccaaaaaattcagggatatcaataagtattaggtatatgg120atcataattgtatgcccgactattgcttaaactgactgaccactgaccttaagagtaatg180gcgtgc皿ggcccagtgatcaatttcattatttttcattatttcatctccattgtccctg240gtgtcgcccctctacacagcccagaactatggtaaaggcgcacgaaaaac300cgccaggtaaactcttctcaacccccaaaacgccctctgtttacccattccctctcagct360caatgattacttaatgtttgttctgcgcaaacttcttgcagaacatgcat420aagttgtagtttctgttaccaattgcgaatcgagaactgcctaatctgcc480gagtatgcaagctgctttgtaggcagatgaacatatgatatatataat528〈210〉3<211>5962<212〉DNA〈213〉pPDCNIRA轉(zhuǎn)化質(zhì)粒<400〉3tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta60tcagctcactca卿gcggtaatacggttatCC￡LC3gaatcaggggataacgcagga卿120aacatgtgagcaaaaggccagcaaa已ggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg180tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctc卿tcagagg240tggcgaaacccgacsggacta^33gataccaggcgtttccccctgga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2的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性的多核苷酸；或(C)多核苷酸，其為序列號(hào)2的堿基序列和/或其互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸。7、根據(jù)權(quán)利要求3-6任意一項(xiàng)所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其中所述的編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的多核苷酸和/或啟動(dòng)子是由質(zhì)粒表達(dá)載體所承載。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的藍(lán)細(xì)菌集胞藻，其中所述的質(zhì)粒表達(dá)載體序列為序列號(hào)3所示的序列。9、權(quán)利要求l-8任意一項(xiàng)所述的藍(lán)細(xì)菌在生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及生物能源
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種藍(lán)細(xì)菌集胞藻突變株、篩選這種集胞藻突變株的方法、導(dǎo)入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒表達(dá)載體、導(dǎo)入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子序列的上述集胞藻突變株、以及上述突變株在制備乙醇中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12P7/06GK101372669SQ20071014278公開日2009年2月25日申請(qǐng)日期2007年8月23日優(yōu)先權(quán)日2007年8月23日發(fā)明者娟黃申請(qǐng)人:娟黃