專利名稱：表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的重組桿狀病毒毒株、其構(gòu)建方法及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒毒株構(gòu)建方法，尤其涉及一種豬圓環(huán)病毒2型 重組Cap蛋白表達及應用；本發(fā)明還涉及用于構(gòu)建該豬圓環(huán)病毒2型重組毒株的重 組表達載體以及該重組毒株在豬圓環(huán)病毒診斷、預防中的應用，屬于獸醫(yī)生物技術(shù) 領域。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2， PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰 竭綜合征(Postweaning multsystemic wasting syndrome, PMWS)的病原，弓l起 斷奶仔豬發(fā)生進行性消瘦、咳嗽、呼吸困難、腹瀉、皮膚蒼白或黃染、淋巴結(jié)腫大、 腎臟灰白水月中等癥狀(AllanGM， Ellis JA. Porcine circoviruses: A review[J]. J Vet Diagn Invest, 2000， 12: 3-14)。本病于1991年在加拿大首次被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn) 已證實呈世界性流行，我國的一些豬場也普遍存在本病。PCV2基因組含有2個主要 閱讀框架，即0RF1和0RF2。
PCV2-0RF1由945個堿基組成，編碼314個氨基酸，基因 產(chǎn)物與病毒復制酶相關(guān)(R印)；PCV2-0RF2由702個堿基組成，編碼233個氨基酸， 是構(gòu)成病毒衣殼蛋白 (Cap)成分(Cheung A K. Transcriptional analysis of porcine circovirus type 2[J]. Virology, 2003， 305: 168-180; Hamel A L， Lin L L， Nayar GPS. Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs[J]. J Viol， 1998， 72: 5262-5267. )。 Nawagitgul等(Nawagitgul P， Morozov I， Bolin S R， a丄Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein [J]. JGenVirol， 2000, 81: 2281-2287; Nawagitgul P， Harms P A， Morozov I， s丄 Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (0RF2)-based enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV[J"]. Clin Diagn Lab Immunol, 2002， 9: 33-40.)。用桿狀病毒表達了PCV2-ORF2基因獲得30kDa蛋白產(chǎn)物，電鏡下觀察這種
產(chǎn)物具有自我裝配假病毒顆粒的能力。由于該病毒感染細胞不呈現(xiàn)細胞病變，病毒
培養(yǎng)物毒價低、不易純化，給研究工作帶來一定困難。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)以其 表達外源蛋白產(chǎn)量高、抗原性好、產(chǎn)物易純化等特點，在多種疫病的研究中得到廣 泛利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種重組桿狀病毒毒株，該重組毒株可以表達PCV2-0RF2編 碼的Cap蛋白，所表達的重組蛋白具有良好的免疫活性，可作為豬圓環(huán)病毒2型亞單 位疫苗，也可作為豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體診斷抗原。
本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種重組桿狀病毒毒株(rBac/PCV2Cap)，其微生物保藏號是CGMCCNO. 2083; 分類命名是表達豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2) Cap蛋白的重組 桿狀病毒；保藏時間是2007年6月13日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心；保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學
院微生物研究所。
本發(fā)明首先擴增PCV2-0RF2基因，獲得699bp目的基因片斷，將其與昆蟲桿狀 病毒表達載體質(zhì)粒(優(yōu)選為pBlueBac4.5/V5-His-T0P0)連接，通過酶切反應鑒定 及序列分析得到重組表達質(zhì)粒；測序表明，擴增得到699bp的PCV2-0RF2基因，與 已發(fā)表的PCV2序列同源性達到96.7y。以上，表明該基因具有很高的保守性。將所得 到的重組表達質(zhì)粒與線性化桿狀病毒DNA共浴，加入細胞轉(zhuǎn)染試劑，取轉(zhuǎn)感細胞培 養(yǎng)上清做蝕斑克隆與篩選試驗，采用病毒培養(yǎng)物上清，接種昆蟲細胞，篩選獲得一 株穩(wěn)定、高效表達PCV2-Cap蛋白的重組桿狀病毒毒株(rBac/PCV2Cap)，病毒滴度 達到1.28X108 pfu/ral。該重組毒株可以在昆蟲細胞高效表達重組PCV2-Cap蛋白， 所表達的重組PCV2-Cap蛋白具有良好的免疫反應活性，可作為豬圓環(huán)病毒2型亞單 位疫苗，也可作為豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體診斷抗原。
本發(fā)明重組毒株所表達的重組蛋白除去融合部分，其分子量與文獻 (Nawagitgul P, Morozov I, Bolin S R, et a丄Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J]. J Gen Virol, 2000, 81: 2281-2287)報道的30kDa基本一致，而產(chǎn)物表達產(chǎn)量，高于文獻報道的表達水平。 由于本發(fā)明在重組蛋白的C末端設計了His-tag序列，為下一步重組蛋白的純化奠定
J承則。
據(jù)文獻報道(Mah6 D， Blanchard P， Truong C， et a丄Differential recognition of 0RF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes[J]. J Gen Virol, 2000， 81: 1815-1824.)， PCV1與PCV2在基因組序列上存在較高同源性，但分布不同，兩病毒 在0RF1與0RF2編碼區(qū)的氨基酸序列同源率分別為86。/G和56。/。。 Mah6等(Mah6 D， Blanchaxd P， Truong C， et s丄 Differential recognition of 0RF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant 印it叩es[J]. J Gen Virol， 2000， 81: 1815-1824.)分別表達了兩種病毒的0RF1， 證明它們的基因產(chǎn)物存在顯著的抗原交叉反應；但表達的0RF2基因產(chǎn)物間無顯著抗 原交叉反應。據(jù)此推斷，本發(fā)明重組桿狀病毒所表達的PCV2-0RF2表達產(chǎn)物，可作 為豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體檢測靶抗原，為進一步血清學鑒別診斷提供了基礎。 此外，PCV2-0RF2基因編碼的蛋白是組成病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重要成分，其在致病性和 誘導機體保護性免疫應答起重要作用。利用所表達的重組蛋白可作為亞單位疫苗免 疫動物，刺激機體產(chǎn)生保護性免疫應答，達到抗病毒感染的目的。
本發(fā)明為進一步進行豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗、診斷抗原及分子生物學研究奠定
基石出o


圖l 藍白斑篩選重組桿狀病毒的結(jié)果；A:野生型桿狀病毒(白斑)；B: 重組型桿狀病毒(藍斑)。
圖2重組毒株感染Sf-21細胞后形成的病毒包涵體；A:野生型桿狀病毒包涵 體；B:重組桿狀病毒包涵體。
圖3重組PCV2-Cap蛋白在昆蟲Sf-21細胞中的表達；A: SDS — PAGE分析結(jié)果， 第1一6泳道分別是0， 24， 48， 72， 96h時間點的表達產(chǎn)物，第7泳道為野生型桿狀病毒 對照，M泳道為標樣蛋白；B:免疫印跡分析結(jié)果，加樣順序同圖A;圖中箭頭所指 處為重組蛋白。
圖4重組PCV2-Cap蛋白用N:T親和層析柱純化結(jié)果；泳道1: Sf-21細胞對 照；泳道2:粗制表達產(chǎn)物；泳道3— 6 :純化的重組蛋白部分收集樣品。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述 而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方 案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例l:本發(fā)明重組桿狀病毒株(rBac/PCV2Cap)的構(gòu)建和重組蛋白的表達 1材料與方法 1. 1病毒、細胞及抗血清
豬圓環(huán)病毒2型毒株(PCV2/LG株)系從現(xiàn)地某豬場臨床表現(xiàn)PMWS癥狀的病 豬臟器，經(jīng)不含PCV1的豬腎傳代細胞系分離獲得，并連續(xù)傳29代。細胞培養(yǎng)采用 RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco)，添加10。/。胎牛血清和100U/ml青霉素及100n g/ml鏈霉素。 按常規(guī)方法進行細胞培養(yǎng)，采用同步法接種病毒，達到80%單層時，按文獻(Tischer I， Mields W， Wolff D， ef Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus[J]. Arch Virol， 1986， 91: 271-276.)方法做D-氨基葡萄 糖處理?？寡宓闹苽洳捎?0日齡病毒抗體陰性豬，經(jīng)氣管內(nèi)及腹股溝淋巴結(jié)接 種病毒細胞培養(yǎng)物，于接種42天后采血，制備PCV2陽性血清。昆蟲細胞株(Sf-21) 培養(yǎng)于Grace氏培養(yǎng)液，添加O. 26%磷酸胰蛋白肉湯，10%胎牛血清和50 u g/ml卡那 霉素，用于DNA轉(zhuǎn)染、蝕斑克隆及重組蛋白表達。
1. 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
PCV2-0RF2基因序列擴增取100n 1病毒培養(yǎng)物，加1蛋白酶K(20mg/ral) 于37。C消化2h，經(jīng)水浴沸煮5min， 15000r/min離心10min，取上清用于DNA擴增。 引物設計參考，GenBank登錄的PCV2序列(AF16652、 AF027217、 AF118097、 AF264043 和 AF201897 )。 上游引物5'-ATGACGTATCCAGGAGGCG-3'; 下游引物 5' -GGGTTTAAGTGGGGGGTCT-3')。采用大連寶生物工程公司試劑盒進行PCR擴增反應， 按說明書操作。DNA變性溫度為94'C2min;擴增反應共進行35個循環(huán)94°C45s， 55 。C45s，72。Clmin;延伸反應為72°C 7min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)鑒定后克隆到昆蟲桿狀病毒 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pBlueBac4. 5/V5-His-T0P0上(Invitrogen)，基因克隆及分析方法 參考文獻(薩姆布魯克，D W拉塞爾著(黃培堂等譯).分子克隆實驗指南[M].第 3板，科學出版社，2002.) 。 Qiagen柱純化的重組質(zhì)粒DNA， 373A型序列儀進行DNA序列分析(Perkin- Elmer試劑盒)，DMSIS軟件進行數(shù)據(jù)處理。 1. 3 DNA轉(zhuǎn)染與蝕斑試驗
純化的質(zhì)粒DNA與適宜比例的線性化桿狀病毒DNA共浴，加入適量細胞轉(zhuǎn)染試 劑(Cellfectin， Invitrogen)，按說明書操作。取轉(zhuǎn)感細胞培養(yǎng)上清做蝕斑克隆 與篩選試驗。蝕斑試驗采用10倍系列稀釋的病毒培養(yǎng)物上清，接種昆蟲細胞，于 28。C感作lh，吸出接種液后用終濃度為lX瓊脂糖一Grace氏完全培養(yǎng)液覆蓋(內(nèi)含 150ug/ml X-gal)，凝固后倒置于28t:培養(yǎng)箱培養(yǎng)4日，逐天觀察深藍色蝕斑的 出現(xiàn)，用毛吸玻璃管挑取藍斑，置0.5ml無血清Grace氏培養(yǎng)液中吹打，以此接種新 培養(yǎng)的Sf-21細胞，反復進行3次重組桿狀病毒的蝕斑克隆篩選，獲得的重組病毒滴 度按蝕斑形成單位(pfu/ml)計算。 1. 4重組蛋白質(zhì)表達分析
重組桿狀病毒基礎種子毒的制備取新培養(yǎng)的Sf-21細胞，接種劑量為0. 1 個感染單位，接種5 7日后收獲病毒細胞培養(yǎng)物。重組蛋白表達時，接種劑量為5 個感染單位，按不同時間點(0、 24、 48、 72、 96和120h)收取細胞培養(yǎng)物。收取 的細胞用PBS離心洗滌3次，加入SDS—PAGE樣品緩沖液，經(jīng)沸煮5min處理后， 12.5%的分離膠電泳，考馬斯亮藍R250染色，薄層掃描儀測定蛋白含量。免疫印跡 試驗用于檢測重組蛋白的免疫活性反應，方法見文獻(薩姆布魯克，D W拉塞爾著 (黃培堂等譯).分子克隆實驗指南[M].第3板，科學出版社，2002.)。
2實驗結(jié)果
2.1 PCV2-0RF2基因擴增與克隆PCR擴增獲得的DNA產(chǎn)物，大小與預期設計一致 (699bp)，刪除病毒蛋白終止密碼子。用限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒分析結(jié)果表明，
構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有PCV2-0RF2基因，連接方向正確。
2.2 DNA序列分析結(jié)果對3個重組質(zhì)粒進行的DNA測序分析結(jié)果一致，表明克 隆的PCR產(chǎn)物未發(fā)生錯配現(xiàn)象。序列數(shù)據(jù)與GenBank登錄的5個PCV2毒株基因序列同 源性達到96. 7X以上。PCV2-0RF2基因全長為702bp(含3個終止密碼子)，編碼233aa， 預測有一個潛在的糖基化位點。
2.3重組桿狀病毒的克隆篩選結(jié)果經(jīng)3個循環(huán)蝕斑克隆，獲得一株穩(wěn)定、高效 表達PCV2-Cap蛋白的重組桿狀病毒(rBac/PCV2Cap)，病毒滴度達到l. 28X 108 pfu/ml。重組病毒產(chǎn)生的蝕斑呈深藍色反應(圖1B)，野性型桿狀病毒產(chǎn)生的蝕斑
呈乳白色反應(圖1 A)。
從圖2可以看出，重組桿狀病毒接種Sf-21細胞后，可導致細胞內(nèi)出現(xiàn)獨特的
大型包涵體(圖2B);而野生型桿狀病毒感染細胞時產(chǎn)生數(shù)十個小型包涵體(圖2A);
正常對照細胞無此現(xiàn)象。
2.4重組蛋白的表達結(jié)果重組桿狀病毒接種Sf-21細胞，按不同時間收取 樣品進行SDS—PAGE電泳鑒定。見圖3 (A)結(jié)果顯示，在分子量32. 8kDa處出現(xiàn)目 的基因表達蛋白，隨取樣時間的推移，蛋白表達量逐漸增加。接種后48h，重組蛋 白開始表達，96h達到峰值。經(jīng)測定重組蛋白占蛋白含量的17.2%。健康細胞和野 生型病毒接種組在相同位置無此蛋白條帶出現(xiàn)。
2.5重組蛋白的免疫活性鑒定結(jié)果采用免疫印跡試驗對重組蛋白的免疫活 性進行了鑒定，如圖3 (B)所示，在SDS-PAGE電泳圖中(圖3A)表現(xiàn)的32. 8kDa蛋 白條，48h 120h之間收獲的樣品均能與PCV2抗血清產(chǎn)生特異性免疫染色反應，健 康細胞和野生型病毒接種組無染色。結(jié)果證實，獲得的重組蛋白屬于PCV2-Cap蛋白。
試驗例1 用本發(fā)明構(gòu)建的重組桿狀病毒株(rBac/PCV2Cap)表達的PCV2-Cap蛋 白制備亞單位疫苗
以本發(fā)明構(gòu)建的重組桿狀病毒株(rBac/PCV2Cap)，接種昆蟲細胞表達的PCV2 一Cap蛋白產(chǎn)物為抗原，制備亞單位疫苗。研究試驗對制備重組蛋白在昆蟲細胞的 表達參數(shù)進行了優(yōu)化，用5感染單位種毒接種昆蟲細胞，用表達的5批次重組蛋白 作為抗原進行了亞單位疫苗的研制。將重組蛋白培養(yǎng)物與免疫佐劑乳化制備亞單位 疫苗。按獸用生物制品規(guī)程要求進行了半成品與成品疫苗的檢驗，用檢驗合格制品 進行臨床試驗。
試驗結(jié)果用試制的PCV2—Cap亞單位疫苗2倍劑量(4ml/頭)肌肉接種25 日齡仔豬5頭，臨床觀察28天未見無異常反應，證明疫苗制品對本動物是安全的。 疫苗免疫效力試驗是采用0.5ml、 lml、 2ml三種劑量免疫25日齡仔豬，每組5頭， 設未接種疫苗對照豬3頭。所有疫苗免疫后28天抗體檢測全部轉(zhuǎn)陽；強毒攻擊試 驗結(jié)果表明，lml和2ml免疫組均獲得100X保護，0. 5ml組獲得80X (4/5)保護 率。
試驗例2用本發(fā)明構(gòu)建的重組桿狀病毒株(rBac/PCV2Cap)表達的PCV2-Cap蛋白
抗原建立ELISA診斷試劑盒
用本發(fā)明構(gòu)建的重組桿狀病毒株(rBac/PCV2Cap)，接種昆蟲細胞制備重組 表達的PCV2-Cap蛋白，利用重組蛋白C末端插入的6個His — Tag標簽序列，采用 商品化附2+親和層析柱一部法進行蛋白純化(圖4)。用純化的重組蛋白抗原包被 ELISA反應板，建立檢測PCV2特異性抗體診斷試劑盒。
ELISA診斷試劑盒操作程序取上述方法制備的檢測反應板置室溫預熱，用 PBS浸洗1次，待檢血清樣品用PBS-T液(含0. 05。/。Tween20 + 1XBSA)按1: 100稀 釋，以PCV2陽性和陰性血清作參照，每份稀釋的血清分別加入到2個抗原反應孔 (10(HiL/孔)，置37。C濕盒孵育lh; PBS-T洗滌3次，加入1: 3000倍稀釋的SPA 一HRP液(Zyraed產(chǎn)品)，每孔100yL，置37。C濕盒孵育lh; PBS-T洗滌3次，加50yL/ 孔底物反應液(ABTS，Sigraa產(chǎn)品)，置室溫顯色30min，加入l%NaF溶液終止反應， 用酶標測定儀測定405nm波長的光密度值(0D4。5)。結(jié)果判定標準，P/,[待檢血清 OD值-空白對照OD值]/[陰性對照血清OD值一空白對照OD值]》2. 1作為陽性反應 臨界值；陽、陰性對照血清均成立時判定結(jié)果有效。
試驗結(jié)果用重組蛋白包被ELISA板的最適濃度為1. 46 2. 39tig/mL;待檢血 清稀釋倍數(shù)為1: 100，感作時間為lh; 二抗酶標抗體稀釋倍數(shù)為1: 3000，感作時 間為lh。組裝的ELISA診斷試劑盒對已知PCV2陽性血清檢測敏感性為98X;對PCV2 陰性血清檢測特異性為100%。對豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂 犬病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、 豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)等參考陽性血清無交叉反應。 診斷試劑批間與批內(nèi)重復性良好，變異系數(shù)小于15%。與常規(guī)過氧化物酶單層細胞 染色試驗(IPMA)檢測血清樣本的符合率達89%。診斷試劑盒可置一20。C保存1年 有效。
權(quán)利要求
1、重組桿狀病毒毒株rBac/PCV2Cap，其微生物保藏號是CGMCC NO.2083。
2、 權(quán)利要求1的重組桿狀病毒毒株rBac/PCV2Cap在制備預防豬圓環(huán)病毒2型 疫苗中的用途。
3、 按照權(quán)利要求2的用途，其特征在于所述的疫苗是亞單位疫苗。
4、 權(quán)利要求1的重組桿狀病毒毒株rBac/PCV2Cap在制備診斷豬圓環(huán)病毒2型 血清抗體檢測診斷抗原的用途。
5、 權(quán)利要求1的重組桿狀病毒毒株rBac/PCV2Cap所表達的重組豬圓環(huán)病毒2 型Cap蛋白。
6、 權(quán)利要求5的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在制備診斷豬圓環(huán)病毒2型血 清抗體檢測診斷抗原的用途。
7、 一種檢測豬圓環(huán)病毒2型的ELISA診斷試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要 求5所述的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的重組桿狀病毒毒株rBac/PCV2Cap(微生物保藏號是CGMCC NO.2083)及其用途。本發(fā)明構(gòu)建的重組桿狀病毒毒株rBac/PCV2Cap可在昆蟲細胞中高效表達重組PCV2-Cap蛋白，所表達的重組Cap蛋白具有良好的免疫活性和抗原性，可作為預防豬圓環(huán)病毒2型感染引起的相關(guān)疫病用亞單位疫苗，也可作為豬圓環(huán)病毒2型血清抗體檢測診斷抗原。
文檔編號C12N15/866GK101358182SQ20071014341
公開日2009年2月4日 申請日期2007年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日
發(fā)明者劉長明, 危艷武, 張朝霞, 張超范, 童光志, 婧 袁, 陸月華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所