專利名稱：：山窩苣素及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種山窩苣素及其制備方法和用途，具體的說是從新疆毛菊苣根中提取的山萵苣素，作為治療糖尿病藥物及功能食品的用途。
背景技術(shù)：
：菊苣是一種用途廣泛的植物，意大利居民用菊苣葉做蔬菜沙拉，味美可口，除此之外，菊苣更多是具有很多藥用價值。1)降血脂、降血糖在國內(nèi)外研究的己相當(dāng)之多。北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院研制了菊苣膠囊，張冰等發(fā)現(xiàn)菊苣膠囊對糖尿病復(fù)合高脂兔血糖血脂及血尿酸有一定影響，作者采用四氧嘧啶靜脈注射合高脂食餌的復(fù)臺兔模型，觀察菊苣膠囊對高血糖、高血脂模型兔血搪、血脂及血尿酸的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菊苣膠囊在連續(xù)口服培藥時，可降低模型動物第2周、第4周、第8周時空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇水平，同時降強第4周、第8周時血尿醚水平，作用時間持久，表明菊苣經(jīng)化學(xué)提取后制成的膠囊劑可降低復(fù)合動物模型的血糖、血脂、血尿酸水平，具有改善代謝紊亂的多方面作用。隨后張冰又發(fā)現(xiàn)菊苣醇提取物對實驗性高脂家兔的血液流變性有一定影響，作者采用復(fù)合高血糖高血脂兔模型，觀察菊苣醇提取物對血液流變性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菊苣醇提物能降低全血、血漿粘稠度；降低模型動物紅細胞沉降速率及血沉方程K值。張冰還發(fā)現(xiàn)菊苣提取物對a-amyrin對高糖高脂環(huán)境中家兔主動脈平滑肌細胞膜微粘度及過氧化脂質(zhì)有一定影響力，能明顯降低高脂^!模型細胞膜粘度、改善細胞流動性，降低培養(yǎng)液中LPO含量，兩者之間作用強度無明顯差異。高云艷等采用四氧嘧啶高血糖模型大鼠、觀察菊苣不同提取物對模型動物血糖、血TC及TG的影響。結(jié)果得出菊苣醇提物對模型降低血糖、血TC及TG方面療效優(yōu)于水煮醇沉提取物。鄭紅梅等將菊苣降血糖和降血脂的有效部位進一步縮小，通過對大鼠藥理實驗，發(fā)現(xiàn)菊苣正己烷提取物能降低四氧嘧啶大鼠血糖，對其胰島素水平無顯著影響，能降低高血脂大鼠血清總膽固醇、總甘油三脂、低密度脂蛋白含量，并能顯著降低其全血粘度、血漿粘度、血漿纖維蛋白原含量。在菊苣膠囊的對血糖影響的機理方面，張冰初步探討了菊苣膠囊防治糖尿病的作用機理，他采用體內(nèi)方法，通過對不同高血糖模型小鼠給藥，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菊苣膠囊可顯著降低四氧嘧啶及腎上腺素模型小鼠血糖含量，同時升高腎上腺素模型小鼠肝糖原含量。初步表明，菊苣膠囊降糖作用與胰外途徑有關(guān)，尤其是與增加肝糖原含量、減少肝糖原分解作用有關(guān)。鄭紅梅等從組織形態(tài)學(xué)上闡述了菊苣雙降膠囊藥理作用機理，她認為菊苣雙降膠囊能降糖作用與修復(fù)胰島P細胞和胰外途徑特別是促進肝糖原合成，抑制糖異性有關(guān)，另外還推測，菊苣雙降膠囊可能直接影響糖代謝，且其降糖作用與抑制腸道對葡萄糖的吸收有關(guān)。張冰等在已證明菊苣提取物在降糖降脂和改善血液流變性以及對兔動脈平滑肌細胞膜有良好的保護作用的基礎(chǔ)上，又對模型動物血漿相關(guān)因子做了測試，他們得出結(jié)論認為菊苣提取物能改善血漿多種細胞因子水平，減少高糖高脂等不良因素對血管壁壁的刺激，對抗由高脂高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮素(ET)、血管性假血友病因子(Vwf)水平升高，調(diào)節(jié)前列環(huán)素(PGI2)和血栓素(TXA2)的比值，維持正常舒縮狀態(tài)，減少兔動脈平滑肌細胞異常增殖的刺激，減少班塊的形成，起到抗動脈粥樣硬化的綜合作用，進一步闡述了菊苣提取物藥理作用機理。劉小青等將快速塑造大鼠高脂血模型用于小鼠高脂血模型，實驗結(jié)果證明不同劑量的菊苣提取物能明顯降低高脂血癥小鼠的血清總膽固醇、總甘油三脂、一氧化氮和過氧化脂質(zhì)水平，增強超氧化物歧化酶活性，結(jié)論菊苣提取物能改善高脂飲食引起的高脂血癥。薩翼等發(fā)現(xiàn)菊苣提取物N2還能降低該模型小鼠血清中的黃嘌呤氧化酶。劉小青等又用與人類代謝類似的鵪鶉高尿酸血癥模型證明小劑量菊苣提取物能明顯降低模型動物的血尿酸水平，菊苣提取物有明顯的降尿酸作用，但藥理作用機制并未提及。而孔悅等初步探討了其作用機理，他們通過用大、中、小不同劑量菊苣提取物給藥于高尿酸高甘油三酯血癥的鵪鶉，相對于對照組，三個不同劑量組的菊苣提取物能明顯降低鵪鶉血清中的尿酸和甘油三脂含量，而對腎功能沒有影響，證明菊苣提取物對這種交互紊亂具有良好的調(diào)節(jié)作用，其藥理作用具有多方面、多耙點的優(yōu)勢。最近又報道治療2型糖尿病復(fù)方草藥專利，這其中就包括菊苣提取物，R.Petlevski用該復(fù)方草藥的用兩種不同的工藝路線得到粗提物，同樣的藥材用60%醇水冷浸28天，過濾，分成兩份，一份凍干，得提取物l;另一份低壓回收醇水，同樣凍干，得提取物2，將提取物1和提取物2對四氧嘧啶誘導(dǎo)的非肥胖糖尿病小鼠進行實驗，結(jié)果提取物2相對于提取物1更能降低小鼠血清葡萄糖和果糖胺水平。在國外，ZahraAmirghofran對菊苣的免疫調(diào)節(jié)生理活性也做了評價他的實驗證明菊苣提取物在植物血球凝集素(PHA)存在下能明顯抑制淋巴細胞增殖。2)保肝GilaniA.H.從菊苣里面分離到的七葉內(nèi)酯能夠保護由于撲熱息痛和四氯化碳引起的肝損傷，這在一定程度上能夠解釋民間用菊苣作為治療肝損傷的藥。ChhayaGadgoli等將菊苣種子的水提取物，依次用丙酮、甲醇萃取，得到三個部位丙酮部位、甲醇部位和水溶性部位，將三個部位給藥于四氯化碳引起的肝損傷大鼠，結(jié)果證明甲醇部位能夠明顯降低由于四氯化碳引起的大鼠肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸馓酶(ALKP)和總膽紅素水平，具有最好抗肝毒活性，對由于四氯化碳引起的大鼠肝損傷具有很好的保護作用，其次是水溶性部位，丙酮部位沒有活性。RasheeduzZafar等發(fā)現(xiàn)菊苣的根和根皮的水提物都能夠?qū)τ捎谒穆然家鸬母渭毎麚p傷有很好的保護作用，作者進一步做了根和根皮水提物抗肝毒性活性的比較，結(jié)果根皮水提物優(yōu)于根的水提物。隨后，Go"knurAktay發(fā)現(xiàn)菊苣葉子80%水醇提取物對小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化起到一定的抑制作用，但不能改變谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性，總體上，菊苣葉子的水醇提取物對由于四氯化碳引起的大鼠肝中毒有很好的保護作用。Joung-HoonKim用菊苣根的95%醇提取物對由于酒精中毒小鼠實驗，菊苣根醇提取物對小鼠酒精中毒具有一定的保護作用，如果給藥300mg/Kg/Day菊苣根95。％醇提取物能明顯增強小鼠免疫功能。BaharAhmed對菊苣種子的醇提物分別用石油醚、乙酸乙酯、甲醇依次萃取，并且從甲醇部位分到一化合物AB-IV。得到的總的菊苣種子醇提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、甲醇部位及化合物AB-IV分別對由于四氯化碳引起肝損傷大鼠實驗，結(jié)果甲醇部位和化合物AB-IV相對于其他部位和陽性對照水飛薊素大幅度降低肝損傷大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸馓酶(ALKP)水平及增強總蛋白TP水平，其中作者說明了化合物AB-IV是一種苯酚類化合物，但未闡明其結(jié)構(gòu)。GabriellaGazzani發(fā)現(xiàn)在菊苣中同時存在氧化強化劑和抗氧化劑化合物，且兩者可以在化學(xué)系統(tǒng)或生物系統(tǒng)中同時具有活性。作者體外實驗和大鼠實驗的基礎(chǔ)上，利用電泳技術(shù)從菊苣中分離到了三個部位無色的氧化強化劑部位、抗氧化劑部位和"黃色"部位，其中"黃色"部位抗氧化活性最高，其分子量在300000以上，且不溶于酸性介質(zhì)中。作者還指出在三個部位同時存在于植物中時，菊苣的總提取物表現(xiàn)的抗氧化活性，相對于分離到的抗氧化劑化合物都弱，其中的原因可能是由于氧化強化劑部位掩蓋了一部分抗氧化劑部位。AdelePapetti利用反相高效液相色譜從菊苣中分離除了抗氧化劑化合物，并通過小鼠實驗，對抗DPPH，穩(wěn)定自由基，說明了菊苣中存在的氧化強化劑在與抗氧化劑存在時能完全抵消抗氧化劑的生理活性，但這種氧化強化劑又是不穩(wěn)定的，在溫度^5(TC水溶液20min，會自動分解失去活性。最近，AdeleP即etti在化學(xué)與生物學(xué)兩個系統(tǒng)中研究了菊苣族植物的抗氧化活性和氧化強化活性，同樣得出了分子量在3500Da以上的化合物在所選用的化學(xué)和生物學(xué)兩種系統(tǒng)中表現(xiàn)一定的抗氧化活性，而分子量在3500Da以下的小分子量化合物則具有氧化強化劑的活性，且這種結(jié)果在對其進行熱學(xué)處理例如加熱煮沸，冷卻，冷卻干燥等，都會得出相同的結(jié)論。ChangW.Choi將菊苣葉子的提取物抗氧化能力和清楚自由基作用與兒茶酚、蕓香苷、櫟精、桑色素、4，5，7-三羥黃烷酮等黃酮的抗氧化和清除自由基作用做了對比。作者分別用二氯甲烷、甲醇或乙醇依次作為菊苣提取物，和黃酮對比能給出較好抗氧化活性和清除自由基作用。3)抗腫瘤Hyun-JaJeong提到了一種韓國民間復(fù)方CancerB(CCB，IMSF-5)在韓國民間廣泛的用來治療各種瘤。其中菊苣在CancerB的質(zhì)量分數(shù)約為18%。Hyun-JaJeong通過對家兔實驗，證明了該復(fù)方能夠明顯增力口一氧化氣7_R平禾口月中瘤壞死因子_a(tumornecrosisfactor-alpha)水平，并指出核轉(zhuǎn)錄因子-KB(Nuclearfactor-kappaB)在調(diào)節(jié)該復(fù)方藥效上起到了重要作用。B.Hazra發(fā)現(xiàn)菊苣根醇提物具有腫瘤抑制作用，通過對Swiss小鼠實驗，菊苣根粗提取物在300-700mg/kg/day能明顯抑制歐利希氏腹水癌(Ehrlichascitescarcinoma)腫瘤的生長。作者將新鮮菊苣根陰涼處干燥后放入80%醇水中冷浸三周，慮出冷浸液，減壓除去溶劑得菊苣根醇提物。4)抗拒食菊苣具有繁茂的綠葉且沒有任何外部的防御，但無論是野生的菊苣還是人工培養(yǎng)的菊苣都能很好的防御外部食草動物的侵襲和另一些昆蟲不能靠近食用，SARAHB.REES通過拒食素實驗證明了的菊苣抗拒食作用，并指出菊苣中存在的具有拒食活性的化學(xué)物質(zhì)是倍半萜內(nèi)酯類化合物和酚類化合物，其中主要在發(fā)揮作用的是以下三個倍半萜內(nèi)酯類化合物山萵苣素(lactucin)，山萵苣苦素(lactupicrin)，8-脫氧萵苣苦素(8-deoxylactucin)。這三種倍半萜內(nèi)酯類化合物具有讓人惡心的苦味，菊苣微苦也是由于這三種倍半萜內(nèi)酯類化合物的苦味所引起的。M.J.Pascual-Villalobos對50種地中海植物做了抗拒食活性實驗，這其中就包括菊苣，他選用了菊苣葉子菊苣葉lg，在室溫2(TC下，先用10ml正己烷浸泡48h，再用10ml丙酮浸泡48h，最后用50X甲醇水浸泡48h，得到三個部位正己烷部位、丙酮部位和50%甲醇部位。通過抗拒食活性實驗，發(fā)現(xiàn)正己垸部位能使幼蟲蛹產(chǎn)生毒性，丙酮部位能使幼蟲拒食，丙酮部位和甲醇部位都能使幼蟲產(chǎn)生毒性。在3ug/每只的劑量下，丙酮部位和50%甲醇部位都能產(chǎn)生100%幼蟲死亡率。AbdulL.Molan做了菊苣中的凝縮類鞣質(zhì)和總倍半萜內(nèi)酯類化合物對紅鹿肺蠕蟲和胃腸線蟲運動性的影響。作者提取和精制了凝縮類鞣質(zhì)和總的倍半萜化合物，得到了凝縮類鞣質(zhì)(CondensedTannins)和黃色倍半萜內(nèi)酯類化合物粗提物(CrudeSesquiterpeneLactones)。AbdulL.Molan的實驗闡明了凝縮類鞣質(zhì)和黃色倍半萜內(nèi)酯類化合物粗提物都能顯著的抑制不同紅鹿肺蠕蟲和胃腸道線蟲的運動性。菊苣除作為草藥之外，還沒廣泛的種植用來做飼料，因為菊苣具有拒食性殺蟲性，所以用菊苣做飼料必然也會對牲畜的消化道的寄生蟲產(chǎn)生影響。C.L.Marley用菊苣做草料喂養(yǎng)綿羊，并觀察了綿羊糞便種的寄生蠕蟲的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用作菊苣做飼料于黑麥草做對比，前者綿羊的糞便中的寄生蟲密度明顯減小。5)抗菌H.A.deSilva又發(fā)現(xiàn)菊苣提取物具有抗菌作用。作者將菊苣根和菊苣地上部分分開，分別用水、乙醇和乙酸乙酯做溶劑在IO(TC水浴中浸泡菊苣lh。得到菊苣根的水提物、醇提物和乙酸乙酯提取物，菊苣地上部分的水提物、醇提物和乙酸乙酯提取物。作者將這九個部位分別對三種革蘭氏陽性菌和六種革蘭氏陰性菌抗菌實驗。結(jié)果顯示所有的提取物至少對四種菌有抗菌活性，其中，乙酸乙酯部位對所有的九種菌類都表現(xiàn)出最好的抗菌活性，水提物能抑制四種菌株的生長，根部提取物抗菌活性要優(yōu)于全草菊苣提取物。作者指出了在菊苣根中含有超過40%的安茴酰牛扁堿，其他還有單寧酸和膠質(zhì)。菊苣葉中含有菊苣苷。菊苣的苦味是由于菊苣中存在的倍半萜內(nèi)酯類化合物。但作者并未指出菊苣的抗菌作用與這些成分有關(guān)。6)抗瘧菊苣中的苦味和抗拒食活性都是由于菊苣中存在的倍半萜內(nèi)酯類化合物。TheodoreA.Bischoff等又發(fā)現(xiàn)菊苣中的倍半萜內(nèi)酯類化合物山萵苣素和山萵苣苦素具有抗瘧活性。阿富汗民間用菊苣根的水提液作為治療瘧疾的藥方選擇晚上取一株菊苣，將地上部分棄去，留根代用，然后將根的周圍用刀劃開幾個口，最后避光下將其浸在水中，隔夜，天明之前服用可治療瘧疾，如果不按照上述程序操作，菊苣提取液沒有抗瘧活性。菊苣作者利用VLC從菊苣中分離到山萵苣素和山萵苣苦素，并對其進行抗瘧實驗，這兩種化合物山萵苣素在IOHg/ml和山萵苣苦素50ug/ml均能抑制瘧原蟲的生長。HyungMinKim等發(fā)現(xiàn)菊苣水提取物(CIAE)在體外和體內(nèi)都能很好的抑制細胞介質(zhì)上的過敏反應(yīng)。CIAE以O(shè).1-1000mgKg1的劑量能明顯抑制由于化合物4880引起的小鼠身體組織過敏反應(yīng)，且小鼠血漿組胺水平降低。菊苣水提取物以I-IOOOmgKg1的劑量能明顯抑制由于化合物compound4880激發(fā)的大鼠腹間皮細胞(RPMC)對組胺的釋放。且CIAE劑量在1000ugml—'時大鼠腹間皮細胞中環(huán)化腺苷酸(cAMP)的含量升高。總之，菊苣水提物能在體外和體內(nèi)明顯的抑制過敏反應(yīng)。櫻井信子等從菊苣中分離得到(S,s)-酒石酸與咖啡酸的二酯化合物(即菊苣酸)，并通過對Wistar大鼠實驗證明這種二酯化合物能使血管平滑肌松弛，其機理是該化合物對NE所致收縮的抑制作用，部分與其阻滯受體依賴性Ca2+通道有關(guān)。在抗病毒方面，菊苣也表現(xiàn)一定的療效，有專利報道新的抗病毒成分體系包括菊苣。該專利提到的新的抗腫瘤成分體系由1加2組成:l.埃及田菁。2.a)家黑種草。b)菊苣嫩枝等。該品主要用來治療病毒感染，如乙肝丙肝，對人的副作用極小。另外，菊苣還和其他藥配伍起來治療胃潰瘍和胰腺炎，IlhanGurbuz和IbolyaKocsisl分別用兔子實驗從組織病理學(xué)上闡明了其藥理活性。以上主要闡述了菊苣的藥理活性進展，其主要的藥理活性主要包括降血脂、降血糖，保肝，抗氧化，抗菌，抗瘧，抗腫瘤，抗病毒以及治療胃潰瘍和胰腺炎等眾多的藥理活性。本論文的研究對象是作為其菊苣同屬植物的毛菊苣根，因為同屬植物的親緣性會在藥理活性和化學(xué)成分有很大相似，以上這些，菊苣的化學(xué)成分研究和藥理活性研究都為我們研究毛菊苣根的化學(xué)成分和體外生物活性篩選提供了科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)思想?？傊?，對于天然植物的化學(xué)成分研究，科學(xué)家們也在不斷地探索動物機體間和物質(zhì)間的相互關(guān)系的自然基礎(chǔ)，使人類對物質(zhì)的認識以更多的特征來加以判斷。早在17世紀，國外學(xué)者開始提出，自然植物類群具有化學(xué)成分和藥理活性上的相似性。直到20世紀初，格拉斯柯夫證明了產(chǎn)生氰化合物在大楓子科的亞科中存在，之后英國植物化學(xué)家斯密奇査明了數(shù)百科屬植物成分和科屬間的親緣關(guān)系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種從毛菊苣根中采用提取、減壓濃縮、萃取、干燥、梯度洗脫、硅膠柱色譜分離、純化得到的化合物山萵苣素，該化合物的結(jié)構(gòu)是由理化常數(shù)測定及波譜數(shù)據(jù)分析而確定的，經(jīng)初步的活性篩選試驗證明該化合物具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制劑作用，可用于治療糖尿病的藥物或保健品的應(yīng)用，同時該化合物或其衍生物可作為藥物組合物的應(yīng)用。本發(fā)明所述的一種從毛菊苣根中采用提取，減壓濃縮、萃取、千燥、梯度洗脫、硅膠柱色譜分離、純化得到化合物山萵苣素，按下列步驟進行-a、取干燥新疆毛菊苣根，用70%乙醇液提取，減壓濃縮至無醇味的浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，減壓濃縮至浸膏狀；b、浸膏用乙醇溶解，用硅膠拌樣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，干燥，以石油醚、石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、甲醇梯度洗脫，每500ml為一流分，TLC檢測，將相同組分合并，各洗脫部分經(jīng)多次硅膠柱色譜分離，葡聚糖凝膠LH-20凝膠柱層析，制備性薄層色譜分離、純化，得到化合物山萵苣素，化學(xué)名為Lactucin,化學(xué)結(jié)構(gòu)式為-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>該化合物或其衍生物作為藥物的組合物。山窩苣素的制備方法，按下列步驟進行a、取干燥新疆毛菊苣根，用70%乙醇液提取，減壓濃縮至無醇味的浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，減壓濃縮至浸膏狀；b、浸膏用乙醇溶解，用硅膠拌樣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，干燥，以石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇，甲醇依次洗脫，每500ml為一流分，TLC檢測，將相同組分合并，各洗脫部分經(jīng)多次硅膠柱色譜分離，葡聚糖凝膠LH-20凝膠柱層析，制備性薄層色譜分離、純化，得到化合物山萵苣素。一種從毛菊苣根中提取化合物山窩苣素作為治療糖尿病的藥物或保健品的用途。圖1為本發(fā)明Lineweaver-Burk作圖法分析山萵苣素對蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制作用的動力學(xué)圖。具體實施例方式實施例1取干燥的毛菊苣根3KG，用30%乙醇提取，減壓濃縮至無醇味的浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，減壓濃縮至浸膏狀；浸膏用乙醇溶解，用硅膠拌樣，用旋lt^:儀蒸去溶劑，干燥，以石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇，甲醇依次洗脫，每500ml為一流分，TLC檢測，將相同組分合并，再經(jīng)葡聚糖凝膠LH-20凝膠柱層析分離、純化，即可得到化合物山萵苣素。實施例2取干燥的毛菊苣根3KG，用70%乙醇依次提取，減壓濃縮至無醇味的浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，減壓濃縮至浸膏狀；浸膏用乙醇溶解，用硅膠拌樣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，干燥，以石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇，甲醇依次洗脫，每500ml為一流分，TLC檢測，將相同組分合并通過反復(fù)硅膠柱層析后，再經(jīng)制備性薄層色譜分離、純化，即可得到化合物山萵苣素。實施例3從毛菊苣根中提取化合物山窩苣素作為治療糖尿病的藥物或保健品的用途的生物活性篩選篩選方法用對-硝基苯基磷酸二鈉(PNPP)作為底物，以在陽性藥物釩酸鈉為對照，利用酶標儀進行(PTP1B)酶抑制劑的高通量篩選，根據(jù)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)水解對-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測定蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)的活性。酶反應(yīng)體系組成如下緩沖液(50mM服PES,pH7.3，100mM氯化鈉，0.1%牛血清蛋白和1mM二硫代蘇糖醇)，GST-蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)融合蛋白，對-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)特異抑制劑釩酸鈉(100ug/mL)。反應(yīng)體系混勻后在37'C放置30rnin，加入1M氫氧化鈉終止反應(yīng)，置比色儀上測定405波長條件下的吸收值(A)，測定結(jié)果減去本底值后計算酶活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)論:從實驗結(jié)果可知，從毛菊苣根中提取化合物山萵苣素具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制劑的功效，其IC5。約為lmM。半抑制濃度的測定篩選方法用對-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)作為底物，以在陽性藥物釩酸鈉為對照，利用酶標儀進行PTP1B酶抑制劑的高通量篩選，根據(jù)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)水解pNPP的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測定PTP1B的活性。酶反應(yīng)體系組成如下緩沖液(50mMHEPES，pH7.3，100mM氯化鈉，0.1%牛血清蛋白和1mM二硫代蘇糖醇)，GST-蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)融合蛋白，對-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)特異抑制劑釩酸鈉(100yg/mL)?；旌暇鶆蚝?，對溶液每隔4s測一次產(chǎn)物的濃度，共測150次，對實驗結(jié)果進行線性回歸。改變底物濃度按同樣方法測試，以反應(yīng)進程線的直線斜率為反應(yīng)速率，已底物濃度倒數(shù)為橫坐標作圖，得l/[V]一1/[S]曲線，即酶反應(yīng)動力學(xué)曲線，進而求得抑制劑對PTP1B半抑制濃度ICs。值。本實驗條件下以每分鐘釋放1.0z/molPNP為一個酶活力單位。其IG。約為lmM?；衔镨b定無色針狀結(jié)晶，mp:224—228。C.IR(KBr)cm_1:3354cnf1，1762cm—'，1664cm—'，1647cnf1，1618cnT1，1188cm—\1137.7cm—'，1086cm—1,1038cm_1，898cm—1;ESI-MS:277[M+H]+;'H-NMR(DMS0，400腿z)5ppm:6.29(1H，s，H-3)，6.14(1H，d，,2Hz，H-13')，6.02(1H，s,,2Hz，H-13)，4.6(1H，d，力20Hz，H-15),4.26(1H，d，力20Hz，H-15')，3.8(1H，m，H-5)，3.75(1H，m，H-6)，3.7(1H，m，H-8)，3.09(1H，m，H-7)，2.76(1H，dd，/二12Hz，12Hz，H-9a)，2.42(3H，s，H-14)，2.34(1H，dd，,12Hz，2Hz,H-9P);3C-NMR(DMS0，100MHz)5ppm:194.4(C-2)，174.9(04)，168.8(C—12)，146.6(C-10)，138.0(C-11)，132.3(C-l)，131.9(C-3),121.5(013)，80.7(C-6)，66.4(C-8)，61.2(C-15)，55.3(C-7)，48.3(C-9)，47.9(C-5)，21.1(C-14)。權(quán)利要求1、一種從毛菊苣根中采用提取，減壓濃縮、萃取、干燥、梯度洗脫、硅膠柱色譜分離、純化得到化合物山萵苣素，其特征在于按下列步驟進行a、取干燥新疆毛菊苣根，用70％乙醇液提取，減壓濃縮至無醇味的浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，減壓濃縮至浸膏狀；b、浸膏用乙醇溶解，用硅膠拌樣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，干燥，以石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇，甲醇依次洗脫，每500ml為一流分，TLC檢測，將相同組分合并，各洗脫部分經(jīng)多次硅膠柱色譜分離，葡聚糖凝膠LH-20凝膠柱層析，制備性薄層色譜分離、純化，得到化合物山萵苣素，化學(xué)名為Lactucin，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物山窩苣素，其特征在于該化合物或其衍生物作為藥物組合物。3、一種從毛菊苣根中提取山窩苣素的制備方法，其特征在于按下列步驟進行.-a、取干燥新疆毛菊苣根，用70%乙醇液提取，減壓濃縮至無醇味的浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，減壓濃縮至浸膏狀；b、浸膏用乙醇溶解，用硅膠拌樣，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，干燥，以石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酉L&酸乙酯-甲醇，甲醇依次洗脫，每500ml為一流分，TLC檢測，將相同組分合并，各洗脫部分經(jīng)多次硅膠柱色譜分離，葡聚糖凝膠LH-20凝膠柱層析，制備性薄層色譜分離、純化，得到化合物山萵苣素。4、一種從毛菊苣根中提取化合物山窩苣素作為治療糖尿病的藥物或保健品的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種化合物山窩苣素及其制備方法和用途，該化合物是從毛菊苣根中采用提取、減壓濃縮、萃取、干燥、梯度洗脫、硅膠柱色譜分離、純化得到的山萵苣素，其結(jié)構(gòu)是由理化常數(shù)測定及波譜數(shù)據(jù)分析而確定的，經(jīng)初步的活性篩選試驗證明該化合物具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制劑作用，可用于治療糖尿病的藥物或保健品的應(yīng)用，同時該化合物或其衍生物可作為藥物組合物的應(yīng)用。文檔編號A23L1/29GK101099566SQ20071014672公開日2008年1月9日申請日期2007年8月13日優(yōu)先權(quán)日2007年8月13日發(fā)明者信學(xué)雷,李勇猛,阿吉艾克拜爾·艾薩申請人:中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所