專利名稱：檢測(cè)堿性鞘磷脂酶的分析方法以及用于該方法的試劑盒的制作方法
檢測(cè)堿性鞘磷脂酶的分析方法 以及用于該方法的試劑盒本案為分案申請(qǐng)，母案申請(qǐng)?zhí)枮?2825879.7 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/IT02/00811 )，申請(qǐng)日為2002年12月19日，發(fā)明名稱為"檢測(cè) 堿性鞘磷脂酶的分析方法以及用于該方法的試劑盒"。本發(fā)明涉及一種評(píng)估需要此種評(píng)估的患者糞便或生物學(xué)流體中的 堿性鞘磷脂酶的分析方法。本發(fā)明還涉及用于該方法的試劑盒。更具體地，本發(fā)明方法是用于檢測(cè)堿性鞘磷脂酶的體外熒光分析 方法，其中所述堿性鞘磷脂酶(如下所述)是嚴(yán)重的病理狀態(tài)如結(jié)腸 癌及家族性腺瘤性息肉的標(biāo)記物。鞘磷脂酶(鞘磷脂磷酸二酯酶，SMase)催化鞘磷脂水解為神經(jīng) 酰胺及磷酸膽堿。迄今為止，已經(jīng)鑒定了三種不同的SMase (酸性、中性和堿性), 它們以如下的幾種同工型存在-溶酶體酸性SMase ( A - SMase );-胞質(zhì)Zn2 +依賴性酸性SMase;-膜中性鎂依賴性SMase ( N - SMase );-胞質(zhì)鎂非依賴性N-SMase;和-堿性SMase 。SMase顯示在許多生理和病理過(guò)程中起作用，包括內(nèi)吞SM的
溶酶體水解、神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳輸、動(dòng)脈粥樣硬化形成、終 末分化、細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡、炎癥形成及調(diào)節(jié)真核生物應(yīng)激反 應(yīng)。與通常存在于細(xì)胞中分別充當(dāng)溶酶體及膜固定酶的酸性和中性SMase相反，堿性SMase顯示出組織和種屬差異性。對(duì)人而言，堿性 SMase存在于腸粘膜和膽汁中。堿性SMase首先產(chǎn)生于十二指腸，在 腸內(nèi)具有較高的含量，特別是在空腸末端，并在結(jié)腸和直腸內(nèi)含量很 高。該SMase的最佳堿性pH值為9.0，并且是Mg2+非依賴性的、膽 鹽依賴性的和胰蛋白酶抗性的。堿性SMase的病理學(xué)重要性最近才被認(rèn)識(shí)到，由于以下原因促進(jìn) 了某些研究的發(fā)展。首先，該酶可能負(fù)責(zé)主要存在于奶、蛋、肉和魚(yú)中的飲食鞘磷脂 的水解。其次，該酶可能調(diào)節(jié)膽固醇的吸收。第三，堿性SMase在腸道中的存在以及其在結(jié)腸直腸癌中檢測(cè)到的選擇性降低說(shuō)明該酶在腸道癌變中起作用，因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下，該酶刺激細(xì)胞凋亡，保護(hù)腸粘膜免遭癌變。先前的研究表明，在生理?xiàng)l件下，堿性SMase可被膽鹽從腸粘膜 解離進(jìn)入腔內(nèi)。然而，在病理?xiàng)l件下，由于膽鹽濃度反常的升高，被 膽鹽解離的堿性SMase便超過(guò)了正常的酶生物合成，導(dǎo)致堿性SMase 在粘膜中的低活性水平，及反常的糞便或生物學(xué)流體即膽汁中酶的排 泄的升高。因此，超過(guò)了正常的基礎(chǔ)值的過(guò)量堿性SMase在糞便或生 物學(xué)流體中的排泄可作為結(jié)腸直腸癌變及家族性腺瘤性息肉的有價(jià)值的診斷標(biāo)記物；因此，有需要獲得可靠的檢測(cè)方法以檢測(cè)可能處于前 述腸道病理狀態(tài)的患者糞便或生物學(xué)流體中的堿性SMase。
另外， 一些細(xì)菌(如Streptococcus termophilus Lactobacilli)含 有高水平的SMase，對(duì)堿性SMase的評(píng)估可以提供評(píng)估所述細(xì)菌數(shù)量 變化的方法，也就是說(shuō)，用微生態(tài)調(diào)節(jié)劑或/和基于微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的 產(chǎn)品治療后進(jìn)行。
先前的評(píng)估堿性SMase的方法是>5^知的。SMase的活性可以進(jìn)行 體內(nèi)確定，即用SM的放射性前體標(biāo)記細(xì)胞，然后確定標(biāo)記產(chǎn)物的水 平，或者也可以用放射性標(biāo)記的SM或SM的顯色類似物、或中性SM 的著色或熒光衍生物進(jìn)行體外確定。
這些已知的方法由于具有放射性而有潛在的危險(xiǎn)，并且敏感度低 于熒光檢測(cè)而并不完全令人滿意。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可靠的、不昂貴的檢測(cè)可能患有結(jié)腸直 腸癌及家族性腺瘤性息肉、或膽囊或肝臟疾病的患者糞便或生物學(xué)流 體中的堿性SMase的方法，該方法克服了已知方法的缺陷。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供用于上述檢測(cè)方法的檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是評(píng)估在不同的健康條件下，或疾病之后或 用藥物或微生態(tài)調(diào)節(jié)劑或食物補(bǔ)充劑治療后的細(xì)菌繁殖情況。
附圖簡(jiǎn)述
圖l表示應(yīng)用熒光檢測(cè)法檢測(cè)鞘磷脂酶，每個(gè)反應(yīng)物包括所示量 的特定檢測(cè)緩沖液中的細(xì)菌鞘砩脂酶。反應(yīng)物在37t:孵育一小時(shí)，用 熒光微板讀取器測(cè)定熒光。在530nm波長(zhǎng)下激發(fā)，并在5卯nm波長(zhǎng) 下檢測(cè)焚光。
本發(fā)明的間接熒光分析方法是基于以下順序的反應(yīng)。
在存在于糞便或其它生物學(xué)流體中的堿性SMase的作用下，鞘磷 脂水解為神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿，在堿性磷酸酶的作用下，磷酸膽堿水解產(chǎn)生膽堿。在膽堿氣化酶的存在下，膽堿生成過(guò)氣化氫(H202). 在辣根過(guò)氧化物酶的存在下，過(guò)氧化氫與10-乙?；?3，7-二羥基吩
噁嗪(H202的靈敏的熒光探針)(以下稱為"Amplex Red試劑，，)發(fā)生 反應(yīng)，產(chǎn)生高熒光物質(zhì)試卣靈。熒光是用熒光計(jì)數(shù)微板熒光儀，在 530-560nm下激發(fā)，并在590nm下檢測(cè)的。根據(jù)前述的反應(yīng)順序和熒光檢測(cè)方法，本發(fā)明的用于檢測(cè)糞便中 的堿性SMase的檢測(cè)方法包括以下步驟。然而，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，很明顯本方法可以容易地進(jìn)行一些常規(guī)改變而應(yīng)用于生物 學(xué)流體，如膽汁。1) 收集患者的糞便樣品并干燥；2) 稱取大約3-4克干燥樣品，并懸浮于20ml包含0.25M蔗糖、 0.15M的KC1、 50mM的KH2P04的勻漿緩沖液中，pH值7.4;3) 在+4。C, 4000rpm下離心樣品60分鐘；4) 回收上清液，再在+4。C， 4000rpm下離心15分鐘；5) 應(yīng)用Pierce Protein Assay,使用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)參照，測(cè) 定上清液中的蛋白含量，對(duì)于每個(gè)樣品，所用的蛋白濃度在"mg/ml -40mg/ml之間，每孑L吸入25jil樣品；6) 每25jil樣品加入65nl包含50mM Tris/HCl、 2 mM EDTA、 0.15M NaCl的pH值9.0的緩沖液和10^1 29fiM的鞘磷脂，并加入3mM 濃度的膽鹽(TC、 TDC、 GC、 GCDC);7) 在37。C下孵育1小時(shí)；8) 吸量每種標(biāo)準(zhǔn)參照物各lOOjil和10fU鞘磷脂(29jiM )，如樣品 一樣在37。C下孵育1小時(shí)；9) 1小時(shí)后，加入lOOfil包含50 mM Tris/HCl(pH7.4)、 10mM |3畫(huà) 磷酸甘油、750fiM ATP、 5 mM EDTA、 5 mM EGTA、 IOOjiM的Amplex Red、 8U/ml堿性磷酸酶、0.2U/ml膽堿氧化酶、2U/ml辣根過(guò)氧化酶的反應(yīng)緩沖液；10) 避光在37。C下孵育1小時(shí)或更長(zhǎng)；11) 使用范圍在530 - 560nm的激發(fā)光源和熒光微板讀取器在
590nm檢測(cè)發(fā)射熒光；12)對(duì)每一個(gè)值，通過(guò)減去非鞘磷脂酶對(duì)照值來(lái)校正背景熒光。本發(fā)明還涉及根據(jù)前述的檢測(cè)方法用于檢測(cè)患者糞便或生物學(xué)流 體中的堿性鞘磷脂酶的檢測(cè)試劑盒，其中包含分別含有以下試劑樣品 的測(cè)試管a) 將被存在于糞便或生物學(xué)流體中的堿性鞘磷脂酶水解以生成 磷酸膽堿的神經(jīng)鞘磷脂；b) 用于催化磷酸膽堿水解成膽堿的堿性磷酸酶；c) 用于氧化膽堿至過(guò)氧化氫的膽堿氧化酶；d) 用于輔助過(guò)氧化氫反應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶；e) Ampler Red試劑(10-乙?；?3,7-二羥基吩噍嗪)，用于得到熒 光化合物試卣靈，其熒光為存在于糞便或生物學(xué)流體中的堿性SMase 的標(biāo)i己；以及f) 用作標(biāo)準(zhǔn)濃度的凍干的細(xì)菌鞘磷脂酶。為了本發(fā)明的分析方法的適當(dāng)應(yīng)用，除上述的試劑盒成分外，以 下的材料和設(shè)備也是需要的蔗糖；氯化鉀(KC1); 磷酸二氫鉀(KH2P04); Trizma base^ EDTA; 氯化鈉；牛磺膽酸(TC);?；敲撗跄懰?Taurodeoxycholate) ( TDC ); 甘氨膽酸(GC);
羥鵝脫氧膽酸(GCDC);P-磷酸甘油；ATP 二鈉鹽；EGTA;BCA Protein Assay Reagent;牛血清白蛋白；冷凍離心才幾；能夠在550-562nm下檢測(cè)的微板讀數(shù)器，和熒光計(jì)數(shù)微板熒光儀。 為完成SMase活性的定量，將進(jìn)行以下的檢測(cè)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試劑盒中有標(biāo)準(zhǔn)的SMase制品，該制品由含有在pH9起作用的 SMase的細(xì)菌提取物組成。進(jìn)行以下操作。制作SMase校準(zhǔn)曲線稀釋標(biāo)準(zhǔn)濃縮液，得到一系列稀釋液。用lml檢測(cè)緩沖液(pH值9.0)重構(gòu)SMase標(biāo)準(zhǔn)液，得到96mU/ml 的貯備溶液。吸量0.500ml的檢測(cè)緩沖液于每管中。應(yīng)用貯備溶液得到一系列 稀釋液。下一次轉(zhuǎn)移前將每管完全混和。未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液作高濃度標(biāo) 準(zhǔn)(96mU/ml)，標(biāo)準(zhǔn)曲線包括以下濃度值(mU/ml): 96-48-24-12-6-3。 緩沖液作為0濃度標(biāo)準(zhǔn)(0 mU/ml )。典型標(biāo)準(zhǔn)曲線在附

圖1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅用作示范。對(duì)每一個(gè)測(cè)試樣品都要制作
標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算結(jié)果求算每一標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的兩次讀數(shù)的平均值，并減去零濃度標(biāo)準(zhǔn) 的熒光平均值。繪制標(biāo)準(zhǔn)品的焚光對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品活性(mU/ml)的最佳曲線。為了確 定每一樣品的SMase活性，首先找到y(tǒng)-軸上的熒光值，再水平延伸至 標(biāo)準(zhǔn)曲線上。在交點(diǎn)處垂直延伸至x-軸，可讀取相應(yīng)的SMase活性。所述的方法可以體外檢測(cè)SMase的活性；已經(jīng)發(fā)展了用于檢測(cè)有 機(jī)樣品中的堿性SMase的方法。為特異性檢測(cè)堿性SMase，該方法應(yīng)用檢測(cè)酸性和中性SMase活 性的條件。實(shí)際為-勻漿緩沖液處于中性pH值，但沒(méi)有蛋白酶和磷酸酶抑制劑從 而可以排除中性SMase，因?yàn)楹笳邔?duì)蛋白酶和磷酸酶的活性敏感并因 此被這些酶抑制；-在勻漿緩沖液中沒(méi)有MgCl2，從而阻斷了 Mg依賴性中性 SMase的活性；-反應(yīng)緩沖液包含P-磷酸甘油和ATP以防止酸性SMase在中性 pH值具有過(guò)多活性，在該緩沖液中，EDTA和EGTA均以高濃度存 在，以抑制中性SMase。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)患者糞便中的堿性鞘磷脂酶的方法，包括以下步驟1)收集患者的糞便樣品并使其干燥；2)稱取大約3-4克干燥樣品，并懸浮于20ml包含0.25M蔗糖、0.15M的KCl、50mM的KH2PO4并且pH值為7.4的勻漿緩沖液中；3)在+4℃，4000rpm下離心樣品60分鐘；4)回收上清液，再在+4℃，4000rpm下離心15分鐘；5)應(yīng)用Pierce Protein Assay測(cè)定上清液中的蛋白含量，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)參照，對(duì)于每個(gè)樣品，所用的蛋白濃度在32mg/ml-40mg/ml之間，吸取25μl各樣品至孔中；6)向各25μl樣品加入65μl包含50mM Tris/HCl、2mM EDTA、0.15M NaCl的pH值為9.0的檢測(cè)緩沖液和10μl 29μM的鞘磷脂，并向檢測(cè)緩沖液中加入3mM濃度的膽鹽(TC、TDC、GC、GCDC)；7)在37℃下孵育1小時(shí)；8)吸取每種冷凍干燥的細(xì)菌鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)參照100μl和10μl神經(jīng)鞘磷脂(29μM)，與樣品一樣在37℃下孵育1小時(shí)；9)1小時(shí)后，加入100μl包含50mM的pH值為7.4的Tris/HCl、10mM β-磷酸甘油、750μM ATP、5mM EDTA、5mM EGTA、100μM的Amplex Red、8U/ml堿性磷酸酶、0.2U/ml膽堿氧化酶、2U/ml辣根過(guò)氧化酶的反應(yīng)緩沖液；10)在避光條件下于37℃孵育反應(yīng)物1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間；11)用熒光微板讀取器檢測(cè)熒光，其中激發(fā)波長(zhǎng)為530-560nm，并在590nm處檢測(cè)發(fā)射光；12)對(duì)每一個(gè)值，通過(guò)減去非鞘磷脂酶對(duì)照的值來(lái)對(duì)背景熒光進(jìn)行校正。
2. 權(quán)利要求l的方法，其應(yīng)用于生物學(xué)流體。
3. —種檢測(cè)患者糞便或生物學(xué)流體中的堿性鞘磷脂酶的試劑盒， 其中含有分別包含以下試劑樣品的檢測(cè)管 a) 將被存在于糞便或生物學(xué)流體中的堿性鞘磷脂酶水解以生成 磷酸膽堿的鞘磷脂；b) 用于催化磷酸膽堿水解成膽堿的堿性磷酸酶；c) 用于氧化膽堿至過(guò)氧化氫的膽堿氧化酶；d) 用于輔助過(guò)氧化氫反應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶；e) Ampler Red試劑(10-乙酰基-3，7-二羥基吩鳴"秦)，用于得到熒 光化合物試卣靈，其焚光為存在于糞便或生物學(xué)流體中的堿性SMase 的才示i己；以及f) 用作標(biāo)準(zhǔn)濃;l的凍干的細(xì)菌鞘磷脂酶。
4. 一種檢測(cè)來(lái)自患者的生物學(xué)材料中的堿性鞘磷脂酶的方法，包 括以下步驟1) 收集生物學(xué)材料樣品；2) 懸浮樣品于包含0.24-0.26M蔗糖、0.14 - 0.16M的KCl、 45 -55mM的KH2P04的勻漿緩沖液中，該緩沖液的pH值調(diào)節(jié)至約7.4;3) 至少離心樣品一次，回收上清液；4) 測(cè)量上清液的蛋白含量；5) 向上清液樣品中加入包含44- 55mM Tris/HCl、 1.9 - 2.2 mM EDTA、 0.14-0.16M NaCl并且pH值為8.9-9.1的檢測(cè)緩沖液和 28-30nM的鞘磷脂以及含有濃度為2.9-3.1mM的膽鹽(TC、 TDC、 GC、 GCDC)的檢測(cè)緩沖液；6) 在大約37。C下孵育檢測(cè)混和物大約1小時(shí)；7) 步驟6)的樣品與28-31jiM的鞘磷脂混和，在約WC下孵育 約1小時(shí)；8) 加入包含pH7.3-7.5的45- 55 mM Tris/HCl、 9一llmM卩-磷酸甘油、745- 755nMATP、 4 - 6 mM EDTA、 4 - 6 mM EGTA、 95 -105jiM的Amplex Red試劑、7 - 9U/ml堿性磷酸酶、0.1 - 0.3U/ml 膽堿氧化酶和1.5 - 2.5U/ml辣根過(guò)氧化酶的反應(yīng)緩沖液；9) 在避光條件下于約37。C下孵育所述反應(yīng)混和物至少1小時(shí)；10) 檢測(cè)熒光，使用530-560nm的激發(fā)光，并在約590n'm下檢測(cè)發(fā)射光。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中對(duì)每一個(gè)樣品，通過(guò)減去非鞘磷脂酶 對(duì)照的值使熒光讀數(shù)對(duì)背景熒光進(jìn)行校正。
6. 權(quán)利要求4或5中的方法，其中蛋白含量是通過(guò)Pierce Protein Assay檢測(cè)的。
7. —種檢測(cè)患者生物學(xué)樣品中堿性鞘磷脂酶的試劑盒，其中包括a) 鞘磷脂；b) 堿性磷酸酶；c) 膽堿氧化酶；d) 辣根過(guò)氧化物酶；e) Ampler Red試劑；f) 凍干的細(xì)菌鞘礴脂酶。
8. —種檢測(cè)堿性鞘磷脂酶的方法，其基本如此處參照附圖的描述。
9. 一種檢測(cè)堿性鞘磷脂酶的試劑盒，其基本如此處參照附圖的描述，
全文摘要
本發(fā)明披露了一種熒光分析方法及用于該方法的檢測(cè)試劑盒，該方法用于檢測(cè)需要此種檢測(cè)的患者糞便中的堿性鞘磷脂酶(SMase)，因?yàn)閴A性SMase是重癥病理狀態(tài)，如結(jié)腸癌，的標(biāo)記物。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK101126716SQ200710147169
公開(kāi)日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2002年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者西蒙 C·德 申請(qǐng)人:艾蒂爾藥物有限公司