專利名稱：：一種重組腺相關病毒載體感染滴度的測定方法一種重組腺相關病毒載體感染滴度的測定方法由2型腺相關病毒(Adeno-associatedVirusType2,AAV2)改造而來的重組腺相關病毒載體(簡稱rAAV2、或AAV2)是一種安全、有效的基因轉移載體，被廣泛用于人類基因治療研究和基因功能研究中。[1][2]AAV2載體的滴度測定通常分物理滴度和感染滴度。物理滴度通常采用點雜交(dot-blothybridization)或定量PCR的方法，測定病毒載體的基因組(vectorgenome,vg)[3][4]，或采用光密度法測定純化后的AAV2載體W。感染滴度(又稱活性滴度)測定方法比較復雜，由于AAV2感染細胞不會像腺病毒等病毒那樣引起細胞病變效應(cytopathiceffect,CPE)，因此無法用噬斑法測定AAV2載體的活性(感染滴度)。目前常用的AAV2感染滴度測定方法為"感染中心法"(infectiouscenterassay,ICA)，將梯度稀釋的AAV2載體和野生型腺病毒(wtAd5)共同感染攜帶AAV2的rep-c叩基因的重組Hela細胞株，培養(yǎng)一定時間后，將細胞轉移到膜上，用3￥標記的探針進行原位雜交，通過對雜交陽性細胞的計數(shù)得到病毒的感染滴度。ICA法的主要缺點是，對單個雜交陽性細胞的逐一計數(shù)誤差較大，另外，細胞轉膜雜交技術的穩(wěn)定性較差[7J。本文建立了一種新的AAV2感染滴度的測定方法，其原理是利用我們以前構建的一株攜帶AAV2的rep-cap基因的人l型單純皰疹病毒(HerpesSimplexVirustype1,HSVI)HSVl-rc/AUL2[8][9](HSVl-rc/AUL2是我們用于AAV2載體生產的輔助病毒，又稱HSVl—re,中國專利號ZL98120033.8)，毒種保藏號CGMCC2161。HSVl-rc/AUL2和待測滴度的AAV2載體樣品共同感染BHK-21細胞(也可以是其它HSV1敏感細胞，比如HEK-293、Hela、Vero、A549等)，前者支持AAV2載體基因組在細胞中復制，通過對AAV2載體基因組的增殖倍數(shù)的比較，得到載體的感染滴度。具體方法是，AAV2載體樣品經過梯度稀釋，分別感染96孔板中的BHK-21細胞，同時感染HSVl-rc/AUL2，48小時后裂解細胞，釋放DNA，將裂解液轉膜，經過DNA探針雜交，通過與AAV2載體標準品比較，得到待測AAV2樣品的相對感染滴度。本文方法首次報道用攜帶rep-cap基因的輔助病毒取代野生型腺病毒HSVl-rc/AUL2和攜帶AAV2的rep-cap基因的重組Hela細胞株，進行AAV2感染滴度檢測的方法。與ICA法相比，由輔助病毒攜帶的rep和cap基因的表達量在理論上遠高于整合在細胞基因組中的rep和cap的表達量，AAV2基因組的擴增數(shù)理論上會有較大幅度提高，從而提高檢測的靈敏度。另外，對細胞進行整體裂解釋放AAV2載體基因組DNA，并用梯度稀釋及終點判斷的方法取代了雜交陽性細胞計數(shù)，減少了系統(tǒng)誤差，操作更簡單、實驗結果更穩(wěn)定。除了目力判斷終點外，還可以采用掃描后軟件(比如BandScan軟件等)自動計算的方式對滴度進行定量。本方法對待檢樣品的純度和劑量等要求較低，可以對細胞裂解液、培養(yǎng)基上清、生產中間樣品、終產品等各種樣品進行AAV2滴度的相對定量測定。除了AAV2載體，本方法還可用于所有使用AAV2的ITR的AAV雜合載體(比如AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8等)的活性滴度檢測。本方法已經在AAV2生產服務中得到了迅速應用，其中包括高產細胞篩選、產量預測、生產工藝優(yōu)化等，均取得了良好的效果，促進了AAV2載體生產水平的提高，該方法的應用仍在不斷開發(fā)中。實施例實施例lAAV2載體的生產和純化文中所有AAV2載體的生產均采用上文提到的HSVl-rc/AUL2輔助病毒生產系統(tǒng)[9]和與之相配套的分離粗純化方法[1()]，并通過柱層析精純化得到。具體方法是，構建含目的基因的載體質粒，將其轉染入BHK-21細胞，通過G418篩選得到穩(wěn)定整合載體質粒的細胞株，經過擴大培養(yǎng)，用HSVl-rc/AUL2感染該細胞株，收獲的AAV2采用氯仿處理(滅活輔助病毒及初步純化)、PEG/NaCl沉淀、氯仿抽提三步粗純化，并通過陽離子交換層析(S印haroseSPFastFlow)精純化，用PBS(pH=7.4)透析。產品用點雜交方法檢測基因組物理滴度(vg/ml)[11]。熒光細胞計數(shù)法測定AAV2-EGFP的感染活性將BHK-21細胞接種至24孔板，37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將AAV2-EGFP用無血清培養(yǎng)基稀釋并感染BHK-21細胞(vg/cell=105)，同時加入丁酸鈉(終濃度40mM)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，熒光顯微鏡下觀察，估算熒光細胞占總細胞的比例，作為AAV2-EGFP的感染活性指標。實施例2HSVl-rc/AUL2病毒的擴增將HSV1^叢1^2按照]/101=1感染BHK-21細胞，細胞繼續(xù)培養(yǎng)38小時，收獲細胞培養(yǎng)上清，按此方法將HSVl-rc/AUL2擴增三代后，用噬斑法測定其感染滴度(PFU/ml)，作為工作毒種備用o實施例3HSVl-rc/AUL2加入量(MOI)的確定將BHK-21細胞接種至一塊96孔板(接種量1.5X10"個細胞/孔)，37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。將AAV2-EGFP(批號20051127，滴度lX1012vg/ml)10倍比稀釋(取20(ilAAV2-EGFP于180pl無血清培養(yǎng)基中，混勻后，再取20ial往下稀釋)，分別取100ial感染96孔板中BHK-21細胞，再按照MOIK)、1、10、50、100分別ira入HSVl-rc/AUL2(批號2FD06014，滴度為1X108pfu/ml)，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中感染90分鐘，換上含5。/。FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，各孔加入1/10體積的10X裂解液(4MNaOH,50MmEDTA,10(ag/mlSalmontestesDNA)，65'C孵育30分鐘，使細胞完全裂解。裂解液全部轉移至96微孔轉移器(Bio-Dot，170-6545)中，用陽離子尼龍膜，真空抽濾。將膜取出，經2XSSC漂洗后，用地高辛標記的CMV探針進行雜交、顯色。如圖1所示，HSVl-rc/AUL2以不同M01(MOI=l、10、50、100)分別感染，檢測同一批樣品(AAV2-EGFP)，其靈敏度不同，其中MOI40時的檢測靈敏度最高，雜交信號陽性的最高稀釋度均為1(T7;MOI=50靈敏度次之，約低10倍，為1(T6;MOI=1和MO》100靈敏度比MOI-10低約100倍，為10—5。分析原因，MO》l吋，HSVl-rc/AUL2處于不飽和狀態(tài)，導致AAV2復制不充分，而MOP50和100時，HSVl-rc/AUL2處于過飽和狀態(tài)，導致細胞過快凋亡，同樣也導致AAV2復制不足。而MOI40時，HSVl-rc/AUL2比較適量，AAV2復制最充分。另外，不加HSVl-rc/AUL2的AAV2復制非常低，以至在10"稀釋條件下，也幾乎沒有雜交信號，從此結果推算，HSVl-rc/AUL2的加入(MOI=10)，導致AAV2基因組的含量至少提高了106倍。實施例4感染后培養(yǎng)時間的確定同上方法，用選定的HSVl-rc/AUL2的MOI進行試驗，與AAV2-EGFP(批號20051127，滴度lX10^vg/ml)共同感染BHK-21細胞，分別培養(yǎng)24、48、72、96h后裂解細胞，轉膜，雜交、顯色。本實驗目的是選擇感染后的最佳培養(yǎng)時間。HSVl-rc/AUL2以MC^0.1、1、10，與經10倍比稀釋后的AAV2-EGFP，共同感染BHK-21細胞，分別培養(yǎng)24、48、72、96h后裂解細胞，轉膜，雜交、顯色。結果顯示(見圖2)，HSVl-rc/AUL2感染M0^10、感染后培養(yǎng)48小時及以上靈敏度均較好，達到10—7，因此選擇HSVl-rc/AUL2感染MOK0，感染48小時為本方法的標準實驗條件。實施例5方法驗證為了驗證本方法的準確性和可靠性，我們用本方法對3批次已知EGFP表達活性的AAV2-EGFP產品進行了感染滴度的檢測。上述3批AAV2-EGFP樣品各取50fil，加入450pl無血清培養(yǎng)液中，混勻后，取50)Ltl進行系列稀釋至l(r5，從10—5連續(xù)2倍比稀釋12個稀釋度，按上述方法分別感染96孔板中細胞，同時感染HSVl-rc/AUL2(MOI=10)，48小時后，裂解細胞、轉膜、探針雜交并顯色。表l:不同批次AAV2-EGFP感染活性驗證實驗結果統(tǒng)計<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>結果分析(見圖3和表1)，l號樣品(批號20060314-1)與3號樣品(批號20051127)陽性孔的最高稀釋倍數(shù)均為3.2X10—6，2號樣品(批號20060612)最高稀釋倍數(shù)為8X10—5。l號與3號樣品的感染滴度比2號高約4倍，結果與熒光計數(shù)法測得的感染活性結果相符(見表l)。實施例5產量預測我們挑選2株攜帶不同目的基因的重組BHK-21細胞(BHK-AAV2/l-6，BHK-AAV2-hCGRP)，將它們分別擴增至U6孔板中，按照生產規(guī)定的M0I加入HSVl-rc/AUL2，培養(yǎng)72小時后，刮下細胞，反復凍融三次，用本文方法檢測其中AAV2的感染滴度。結果分析圖中(見圖4)l號(AAV2/l-6)的4X10—3稀釋度(左起第3孔)、2號(AAV2-hCGRP)的2X10—3稀釋度(左起第2L)與陽性對照病毒AAV2-EGFP的1.6X10—6稀釋度的雜交信號強度基本相同，以此計算，1號和2號的AAV2滴度分別比AAV2-EGFP低400和800倍，艮卩2.5X10g和1.3Xl()9vg。以6孔板每孔細胞數(shù)為1.0X106、培養(yǎng)液3ml計，l號樣品的細胞單產量為2.5X109X3/1.0X106=7.5X103vg/cell，2號樣品的細胞單產量為3.9X103vg/cel1。1、2號樣品經過正式生產，得到的終產品換算成細胞單產分別為3Xl(^vg/cdl，1.75X103vg/cell。(見下表2)排除到中間環(huán)節(jié)的損失的影響，預測產量與實際產量之間是存在對應關系的。表2AAV產品產量預測與實際產量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例6AAV2生產細胞株的單克隆篩選產品AAV2-6078經數(shù)次生產，產量較低(產量2X1011vg)，為了提高產量，嘗試對生產細胞株進行單克隆篩選。我們挑取了ll株單克隆細胞，將它們分別擴增到6孔板中，按照生產規(guī)定的M0I加入HSVl-rc/AUL2，培養(yǎng)72小時后，刮下細胞，反復凍融三次，用本文方法檢測其中AAV2的感染滴度。從結果分析(見圖5)，11個細胞株中只有3株(1F7，2H2，4A10)滴度較高，其它均未測到滴度，說明不同單克隆的AAV2產量存在明顯差異。我們選擇4A10細胞株進行批量生產，得到的產量比未挑選單克隆的物理滴度(vg)高約5倍(1.0Xl(^vs2.0Xl()Uvg)。事實證明通過挑選單克隆，可以獲得相對高產的AAV2生產細胞株，本文的AAV2活性測定方法大大節(jié)省了人力、物力和時間，非常適用于對高產細胞株的挑選。本文采用梯度稀釋和終點判定的方法，通過與已知滴度的對照AAV2病毒的陽性斑點對比，獲得待測樣品的感染滴度，因此得到的是相對活性滴度。如果采取類似腺病毒TCID50測定的方法，對每個稀釋度做810個復孔，統(tǒng)計每個稀釋度的陽性孔數(shù)，用Karber公式m可以計算出病毒的絕對滴度。另外，如果用同位素等更靈敏的方法標記探針，用計算機掃描、軟件檢測光密度等，有望進一步提高本方法的靈敏度和重復性。圖l:HSVl-rc/AUL2不同加入量(MOI)的靈敏度比較從左到右為AAV2-EGFP樣品以10—^10—12稀釋后感染由上到下為HSVl-rc/AUL2分別以M01^、1、10、50、IOO感染。圖2:感染后不同培養(yǎng)時間的比較1/2/3:24h,HSVl-rc/AUL2，MOI=0.1/1/104/5/6:48h,HSVl-rc/AUL2，MOI=0.1/1/107/8/9:72h,HSVl陽rc/AUL2，MOI=0,1/1/1010/11/12:96h,HSVl-rc/AUL2，MOI=0.1/1/10從左向右，AAV2-EGFP稀釋度分別為1(T4、l(T5、l(T6、IO入l(T8、l(T9圖3:方法驗證雜交結果A1~B4:20060314-1(稀釋倍數(shù)依次為1(T5、2X1(T5、4X1(T5、8X1(T5、1.6X1(T6、3.2X10-6、6.4X10-6、1.3X10-7、2.6X10-7、5.2X10-7、l.OXl(T8、2.0XKT8);B5C8:20060612(稀釋倍數(shù)同上)；D1E4:20051127(稀釋倍數(shù)同上)；E6E8:BHK細胞(陰性對照)圖4:2株細胞株產量預測結果l:AAV2/l-6，稀釋倍數(shù)從左至右l(T3、2X1(T3、4X10-3、8X1(T3、1.6X1(T4、3.2X1(T4、6.4X1(T4、1.3X1(T5)2:AAV2-hCGRP，稀釋倍數(shù)從左至右l(T3、2X10-3、4X1(T3、8X10-3、1.6X1(T4、3.2X10-4、6.4X10-4、1.3X10-5)3:陽性對照AAV2-EGFP(批號20051127，滴度lX1012vg/ml)，稀釋倍數(shù)從左至右l(T5、2X10-5、4X10.5、8X10—5、1.6X10—6、3.2X10—6、6.4X10.6、1.3X10-7圖5:篩選BHK-AAV2-6078單克隆細胞株結果1~11:細胞編號分別為1F32、1F7、2H2、3A9、3B11、4A10、4E12、4F9、5C7、4G5、5H1012:陽性對照AAV2-EGFP(批號20051127，滴度1X1012vg/ml)注112所有樣品的稀釋倍數(shù)自上而下均為:l(T5、2X10-5、4X10—5、8X10-5、1.6X10-6、3.2X10-6、6.4X1(T6、1.3X10-7參考文獻1、High,K.A.AAV-mediatedgenetransferforhemophilia.Ann.N.Y.Acad.Sci.2001,953，64~742、Pfeifer，A.,andVerma，I.M.,Genetherapy:Promisesandproblems.Annu,Rev.GenomicsHum-Genet.2001,2,1772113、Clark,K.R.，Voulgaropoulou，F(xiàn).,Fraley,D,M.，andJohnson,P.R.,Celllinesfortheproductionofrecombinantadeno-associatedvirus.Hum.GeneTher.1995,6,132913414、ClarkK.R.,Liu,X.，McGrath,J.P,,andJohnson,P.R.，Highlypurifiedrecombinantadeno-associatedvirusvectorsarebiologicallyactiveandfreeofdetectablehelperandwild-typeviruses.Hum.GeneTher.1999,10，103110395、Sommer，J.M.，Smith,P.H.,Parthasarathy，S.，Iasaacs,J.,Vijay,S,,Kieran,J.,Powell,S.K.,McClelland,A.,and^Vright,J，F(xiàn).,Quantificationofadeno-associatedvirusparticlesandemptycapsidsbyopticaldensitymeasurement.Mol.Ther.2003,7,122-128.6、Zolotukhin,S.,Byrne，B.,Mason，E.,Zolotukhin,I.,Potter，M.,Ches皿t，K.,Summerford，C.,Samulski，R.，andMuzyczka，N.Recombinantadeno-associatedviruspurificationusingnovelmethodsimprovesinfectioustiterandyield.GeneTher"6:973—985,1999.7、ZhuZhen，YeroEspinoza,ThieuBleu，JurgM.Sommer，andJ.FraserWright,Infectioustiterassayforadeno-associatedvirusvectorswithsensitivitysufficienttodetectsingleinfectiousevents,Hum.GeneTher,2004,15:709715.8、伍志堅、吳小兵、侯云德，具有AAV載體包裝功能的重組HSV的產生，科學通報，1999，44(5)506~5099、伍志堅、吳小兵、曹暉、董小巖、王宏、侯云德，一種高效的重組腺伴隨病毒載體生產系統(tǒng)，中國科學C輯，2001，31(5)42343010、吳小兵、董小巖、伍志堅、屈建國、侯云德，一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法，科學通報，2000，15(19)2071207511、彭建強、彭閔、譚淑萍、曹暉、連忠輝、董小巖、吳小兵，一種高效快速濃縮腺相關病毒載體的方法，病毒學報，2005，21(1):111權利要求1.一種重組腺相關病毒載體(rAAV)的感染滴度檢測方法，其特征是該方法的主要包括以下步驟1)重組腺相關病毒載體(rAAV)樣品經過梯度稀釋，分別感染96孔板中的HSV1敏感細胞株BHK-21細胞，同時感染HSV1-rc/ΔUL2；2)48小時后裂解細胞，收集釋放的DNA，將含DNA的裂解液轉膜，經過DNA探針雜交，通過與AAV2載體標準品比較，得到待測AAV2樣品的相對感染滴度。2.根據權利要求l，HSV1敏感細胞株還可以是HEK-293、Hela、Vero、A549細胞。3.根據權利要求l，該感染滴度檢測方法可以用于基于AAV病毒而改造的AAV2載體的感染滴度的檢測，具體是可以用于AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8的活性滴度檢測。全文摘要本發(fā)明提出了一種新的AAV2感染滴度檢測方法，采用一株攜帶AAV2的rep-cap基因的重組HSV1病毒(HSV1-rc)作為輔助病毒，HSV1-rc和待測滴度的AAV2載體樣品共同感染BHK-21細胞(也可以是其它HSV1敏感細胞，比如HEK-293、Hela、Vero、A549等)，前者支持AAV2載體基因組在細胞中復制和產生子代AAV2載體，通過對AAV2載體基因組的梯度稀釋和核酸探針雜交顯色，得到載體的感染滴度。文檔編號C12Q1/70GK101386891SQ20071014947公開日2009年3月18日申請日期2007年9月13日優(yōu)先權日2007年9月13日發(fā)明者暉曹,王宏偉,蔣立新,譚淑萍申請人:本元正陽基因技術有限公司