專利名稱：：一種與腫瘤易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法一種與腫瘤易感性相關(guān)的苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一個(gè)與腫瘤易感性相關(guān)的苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用，屬于生命科^^:領(lǐng)域。背景駄腫瘤的^fe涉及環(huán)境、遺傳、生活飲食習(xí)慣等多種因氣具體到正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的過(guò)程，又與癌基因的歡活、抑癌基因的失活、細(xì)胞凋亡、細(xì)鵬期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)^基因的突^w關(guān)。隨著各種^生物學(xué)s^的成熟，研究人員己發(fā)現(xiàn)了大量與腫瘤s^m^相關(guān)的基因?；蛟跊Q定個(gè)體表型方面皿決定性作用，i!31賦予個(gè)體對(duì)疾病的易感性或皿力，以及影響機(jī),環(huán)境因素的相互作用，基因?qū)膊〉腶^著間接皿接作用。最近大量的研究表明細(xì)胞端粒酶激活是多數(shù)惡魁中瘤發(fā)生的先決條件。端粒酶在惡'翻中瘤組織汲相落細(xì)胞中檢出率很高，由于端豐魏短和端粒酶無(wú)活性，體細(xì)M常逐,老死亡。僅有極少數(shù)細(xì)胞偶然ffl3i撒活端粒酶而M,性老化，其生存延長(zhǎng)可能給另外的基因損傷的積累提供機(jī)會(huì)，導(dǎo)miS行性腫瘤性發(fā)展[2]。在大多數(shù)癌細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞中端粒酶均有高7]C平表達(dá)[3]。表明纟辭立酶的激活敏與細(xì)胞的無(wú)限增歹節(jié)密切絲，M^除細(xì)臓^31程中的增生受限，端粒酶的重新活化可能是體細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化的，步驟。機(jī)體對(duì)各種慢性損傷的抗?fàn)幠芰κ怯忻黠@個(gè)體差異的。誠(chéng)差異的遺傳物質(zhì)基te—就礦泛雜于基因中的SNPs。SNPs的存在并不直髓鵬胞的癌，中瘤的發(fā)生，但可能會(huì)賦予個(gè)體對(duì)某種特殊的環(huán)境因素易感。例如p53基因是，的細(xì)胞周期、凋亡調(diào)節(jié)基因，皿，鍵位點(diǎn)的突頓以直J魏成細(xì)胞增殖的異常。而在p53基因非熱點(diǎn)區(qū)，如72位密碼子的點(diǎn)突變(C《)會(huì)造成編碼氨基酸的改變(Pro—Arg)。這種多態(tài)性在自然人群中有一定的分布，并不直麟成細(xì)胞的癌變。因此在本發(fā)明中選擇TERT基因作為所研究的基因。同時(shí)選擇TERT基因上的SNP位點(diǎn)為所研究的方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的^IM"^f立酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)基因上的單^^酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2736098謝辦異性的研究，提出一個(gè)可作為在判定腫瘤易感人群的方法中應(yīng)用的易感SNP位點(diǎn)，以利于指導(dǎo)腫瘤的預(yù)防和治療。本發(fā)明所述的與腫瘤易感性相關(guān)的TERT基因序列，，苷,列如序列^0f示，皿428位為A。所述的與腫瘤易感性相關(guān)的TERT基因上的靴苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，MlNCBIim庫(kù)，按常規(guī)方、織得，該基因餅列長(zhǎng)度為41878bp的TERT基因；該基因的一糊苷酸多態(tài)性是rs2736098,rs2736098位于2號(hào)外顯子；rs2736098堿基為G突變?yōu)锳;rs2736098的SNP序列，為CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。獲得rs2736098SNP序列的具體步驟如下MMhttp:〃麗.ncbi.nlm.gov/snp繊庫(kù)，在TERT基因J^擇報(bào)苷酸多態(tài)性rs2736098;依據(jù)相應(yīng)的堿基序列合成引物5'—CGMGAAGCCACCTCTTTGGA—3'和5,—MGTGCTTGGTCTCGGCGTAC—3';PCR反應(yīng)體系25(4:2.5|410XTaqBuffer，2Ml2.5mMdNTP，1|410mMPrimer，TemplateDNA，0.2uTaq，用(1(20補(bǔ)足25|4;PCR鵬^f牛94。C8min;94。C40sec，57°C30sec，72°Clmin，35個(gè)循環(huán)；72°C10min;擴(kuò)增，為168bp，用2%的瓊月旨糖凝膠電泳，溴化乙,色檢測(cè)(見(jiàn)圖l)。戶艦的與腫瘤易感性相關(guān)的TERT基因序歹啲應(yīng)用，fflim取^^基因組DNA進(jìn)行雜苷酸多態(tài)性rs2736098的基因分型，其中rs2736098鵬為A的個(gè)體為腫瘤的易感人群。本發(fā)明的儲(chǔ)和積極鄉(xiāng)本發(fā)明的研究結(jié)果表明TERT基因劍中瘤相關(guān)的易感基因，rs2736098自為A的個(gè)體腫瘤易感性高，該對(duì)亥苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可作為在判定腫瘤的易感人群的方法。圖1是顯示多態(tài)性位點(diǎn)rs2736098的序列擴(kuò)增圖，其中，M為DNA舒量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCR，。具條Jfc^實(shí)施例1.51取^#基因組DNA進(jìn)行TO苷酸多態(tài)性rs2736098的基因分型，其中rs2736098堿基為A的個(gè)體為腫瘤的易感人群。具體作腿-1.基因組DNA的提取Si^^J由夕卜周靜脈抽她2-3ml，翻酚氯份鵬取其基因組DNA，-70。C保存。2.PCR擴(kuò)增目的片斷用以下引物5'—CGMGMGCCACCTCTTTGGA—3'禾口'一AAGTGCTTGGTCTCGGCGTAC—3'。PCR反應(yīng)體系(25Pl):10XTaqBuffer，2rt2.5mMdNTP，lOmMPrimer，TemplateDNA，0.2uTaq，用ddH20補(bǔ)足。PCR鵬^f牛94。C8min;94。C40sec，57。C30sec，72。Clmin(35個(gè)循環(huán))；72。C10min。擴(kuò)增^為168bp，用2%的瓊月|^繊電泳，溴化乙錠^fe檢測(cè)(見(jiàn)圖1)。3.基因分型采用點(diǎn)雜交的方法進(jìn)行基因分型。具#^、法如下將合成的寡核^W1E自同濃度點(diǎn)^M;W±，敏紫夕卜3min使樣品與辭固結(jié)合，鵬4。C備用。雜交袋(內(nèi)含芯片一張)加300ul雜交液(注意^St到膜，將氣、艦走)然后將雜交翻封口豐旭寸好，在45。C斜牛下雜交30min。取PCR產(chǎn)物5-10ul，在10(TC7K浴中變性5min，立即冰浴5min。將，交^M^交箱中取出，將雜魏剪^f斗口，輕^f到出予賺交液，辦300ul雜交液與變性探針一起加到雜交袋中，趕走氣泡將雜^if好，放到雜交箱中，45'C雜^1夜。將雜，中的芯片取出，室溫下用2XSSC/0.1%SDS洗兩次，每次2min。然后用0.2XSSC/0.1%SDS，42。C下洗兩次，每次3min。TNT溶液洗5min。將芯片平方JtA干凈的塑料袋中，力口入10X封閉液20iU，TN180ul，混勻，37。C30min。塑料袋中的封閉液，然后加入新的10X封閉液20ul、TN180ul、P0D抗體0.3ul，輕輕混勻，37°C30min。將芯片從袋中取出，TNT漂洗3次，每次3min。將膜^A干凈塑料袋中，取DAB顯色液6P1，DAB繊液6u1、雙蒸7jC288y1，混勻后，立即加A^中，待顯fe^i通想^i^(一MM色10併中左右)，用1XPBS終lh&應(yīng)。4.結(jié)果判定rs2736098MS為A的個(gè)體為腫瘤易感人群。r~s2736098M為G的個(gè)體為腫瘤非易感人群。^S例2、易ii基因的應(yīng)用本研究以33例腫瘤患者為研究組，以33例非腫瘤患者為對(duì)照組。研^1且和對(duì)照組的^#均由夕卜周靜l/細(xì)血2-3ml，采用酚氯仿鵬取基因組DNA，-7(TC保存。病例-對(duì)照組研究結(jié)果顯示對(duì)照組(33人)和研究組(33人)中rs2736098位點(diǎn)基因型M、GG+AG分別為0、1.000和0.152、0.848(表2);TERT基因rs2736098堿基為A的個(gè)體腫瘤易感性高。_表2基因型分布與^^基因頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明由TERT基因iS突，異性判定腫瘤的易感人群的方法，可對(duì)*^測(cè)中瘤臨床癥狀的人群進(jìn)，f^種方法的篩査rs2736098MS為A的個(gè)體為腫瘤易感人群。對(duì)腫瘤易感人S^曰常生活中鵬量^>誘發(fā)因氣可斷劃中瘤的發(fā)病率。根據(jù)本發(fā)明，可根據(jù)患者的基因型決定€^^@的拋中瘤藥物或者采用如基因敲^#因工程方,行有針對(duì)性的基因治療。TERT基因的^S突變，可倉(cāng),蛋白質(zhì)^ii^功能異常。序列表〈110〉南開(kāi)大學(xué)〈120〉一種與腫瘤易感性相關(guān)的靴苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用〈130〉〈160〉1〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉850〈212〉DNA〈213〉Homosapiens〈220〉〈221〉1〈222〉(1)(850)〈400〉1cggacgggggtctgtgtcctcctcctcgggggccgccacagagccctggggcttctcccg60ggcacagacaccggctgctggggtgaccgcagctcgcagcgggcagtgcgtcttgaggag120caccccgtaggggcactgcgcgtggttcccaagcagctccagaaacaggggccgcatttg180ccagtagcgctggggcaggcggggcaacctgcggggagtccctggcatccagggcctgga240acccagaaagatggtctccacgagcctccgagcgccagtcaggctgggcctcagagagct300gagtaggaaggagggccgcagctgctccttgtcgcctgaggagtagaggaagtgcttggt360ctcggcgtacaccgggggacaaggcgtgtcccagggacgtggtggccgcgatgtggatgg420ggggcccgcgtggtgctggcggcccacggatgggtgggagtggcgcgtgcc卿gagcgc480accctccaaagaggtggcttcttcggcgggtctggcaggtgacaccacacagaaaccacg540gccactcggtccacgcgtcctgcccgggtgggcccaggacccctgcccaacgggcgtccg600ctccggctcaggggcagcgccacgcctgggcctcttgggcaacggcagacttcggctggc660actgcccccgcgcctcctcgcacccggggctggcaggcccagggggaccccggcctccct720gacgctatggttccaggcccgttcgcatcccagacgccttcggggtccactagcgtgtgg780cgggggccggggcctgagtggcagcgccgagctggtacagcggcggcccgcacacctggt840aggcgcagct850權(quán)利要求1、一種與腫瘤易感性相關(guān)的端粒酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)基因部分序列，其核苷酸序列如序列表所示，且第428位為A。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的與腫瘤易感性相關(guān)的TERT基因序列，辦征在于，所述的與腫瘤易感性相關(guān)的TERT基因上的對(duì)雜酸多態(tài)性位點(diǎn)，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，按常規(guī)方法獲得，該基因，列長(zhǎng)度為41878bp的TERT基因；該基因的一單核苷酸多態(tài)性是rs2736098，rs2736098位于2號(hào)外顯子；rs2736098,為G突變?yōu)锳;rs2736098的SNP序列為CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的與腫瘤易感性相關(guān)的TERT基因序列，其特征在于，獲得rs2736098SNP序列的具體步驟如下通過(guò)http://www.ncbi.nlm.gov/snp數(shù)據(jù)庫(kù)，在TERT基因上選擇單核苷酸多態(tài)性rs2736098;依據(jù)相應(yīng)的liS序列合成弓l物CGMGAAGCCACCTCTTTGGA和MGTGCTTGGTCTCGGCGTAC;PCR反應(yīng)體系25μl:25μl10XTaqBuffer，2μl2.5mMdNTP，1μl10mMPrimer,1μlTemplateDNA，0.2uTaq，用ddH20補(bǔ)足25W;PCR反應(yīng)件94°C8min;94°C40sec，57°C30sec，72°Clmin，35個(gè)循環(huán)；72°C10min;擴(kuò)增,為168bp，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠鵬檢測(cè)。4、一種權(quán)利要求1所述的與腫瘤易感性相關(guān)的TERT基因序列的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)提取受試者基因組DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性rs2736098的基因分型，其中rs2736098自為A的個(gè)體為腫瘤的易感人群。全文摘要本發(fā)明涉及一種與腫瘤易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用，屬生命科學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的易感基因通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，按常規(guī)方法獲得，該易感基因是序列長(zhǎng)度為41878bp的端粒酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)基因；所研究的單核苷酸多態(tài)性是rs2736098，rs2736098位于2號(hào)外顯子；rs2736098堿基為G突變?yōu)锳。該易感基因作為在判定腫瘤的易感人群的方法中的應(yīng)用。當(dāng)rs2736098堿基為A個(gè)體腫瘤易感性高、rs2736098堿基為G的個(gè)體為不易發(fā)腫瘤。本發(fā)明的TERT基因上的該SNP位點(diǎn)對(duì)研究腫瘤易感性及建立基因診斷方法，指導(dǎo)腫瘤預(yù)防、開(kāi)發(fā)新型治療腫瘤的藥物具有重要作用。文檔編號(hào)C12N15/54GK101200729SQ20071015011公開(kāi)日2008年6月18日申請(qǐng)日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日發(fā)明者虹倪,榮向,張朋軍,麗梁,影胡,英邢申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)