專利名稱：：蟲草胞外多糖的高效生產(chǎn)及分離純化方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物發(fā)酵及分離純化領域，具體涉及蟲草菌絲體深層發(fā)酵高效生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)方法及胞外多糖快速分離純化的方法。
背景技術：
：多糖是動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中的重要組成部分。對多糖的研究，最早是在20世紀40年代，但多糖作為廣譜免疫促進劑引起人們極大的重視是在20世紀60年代。經(jīng)過40多年的不斷發(fā)展，人們對多糖這一類重要生命物質(zhì)產(chǎn)生了新的認識，而使這一學科成為目前生命科學中研究最活躍的領域之一。目前，針對蟲草多糖的研究主要集中在子實體或菌絲體(胞內(nèi))多糖，例如"王尊生，顧宇翔，周麗，袁勤生，俞永信，冬蟲夏草(Cordycepssinensis)菌絲體固體發(fā)酵粉化學成分的分析，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(3):331-336"、"孫月等，野生蛹蟲草與組培蛹蟲草子實體的成分測定與分析，遼寧師專學報，1999，1(1):86-87"、"Shih-JengHuangetal,NonvolatiletastecomponentsoffruitbodiesandmyceliaofCordycepsmilitaris(Cordycepsmilitaris的菌絲體和果肉的味覺非易失性組份)，LWT39(2006)577-583"、"溫魯?shù)?，蠶蟲草不同部位營養(yǎng)與活性成分分析，中國中藥雜志，2006，30(9):659-661"和"溫魯?shù)龋s花與有關蟲草活性成分檢測比較，江蘇中醫(yī)藥，2006，27(l):45-46"中所述。然而對胞外多糖的研究相對較少，尚處于實驗室階段，主要是利用發(fā)酵瓶、搖床等振蕩培養(yǎng)，所得多糖含量相對較低，例如"王飛、劉霞、陳明輝，響應面法優(yōu)化北蟲草產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基，安徽農(nóng)業(yè)科學，2007,35(8):2218-2224"、"陳宏偉、周冰斌、朱蘊蘭、劉全德，蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)多糖條件的優(yōu)化及多糖組分的研究，徐州工程學院學報，2005，20(1):78-83"和"趙明文、吳燕娜、李玉詳?shù)?，蛹蟲草產(chǎn)胞外多糖的液體優(yōu)化培養(yǎng)條件研究，中國食用菌，2000，19(4):30-32"中所述。由于高效生產(chǎn)蟲草胞外多糖的深層發(fā)酵培養(yǎng)條件及優(yōu)良的分離純化技術尚不完善，胞外多糖的理化性質(zhì)及其生物活性功能與胞內(nèi)多糖之間的差異研究目前還處于探索階段，導致胞外多糖尚未能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。而在子實體多糖的分離純化中，常用有機溶劑、化學試劑進行抽提、沉淀、脫脂、脫色等處理，例如"車振明等，人工蛹蟲草子實體多糖分離最佳工藝研究，食品研究與開發(fā)，2004，25(5):78-79"、"婁虹等，蛹蟲草大米培養(yǎng)基中活性多糖的提取及免疫調(diào)節(jié)功能研究，46，特產(chǎn)研究"、"潘中華等，家蠶蛹蟲草多糖的提取及純化工藝研究，中國蠶業(yè)，2002，23(4):20-21"、"肖建輝等，古尼擬青霉胞內(nèi)多糖的提取分離工藝及條件，山地農(nóng)業(yè)生物學，2003，22(2):140-145"、"李連德等，地生枝頂孢(ATOl)多糖提取工藝的研究，生物學雜志，1999，16(6):22"、"ShaoP.Lietal.ApolysaccharideisolatedfromCordycepssinensis,atraditionalChinesemedicine,protectsPC12cellsagainsthydrogenperoxide-inducedinjury(從Cordycepssinensis、中藥中分離的多糖保護PC12細胞免受過氧化氫引起的損傷).LifeSciences2003,73:2503-2513"和"RongminYuetal.Isolation,purificationandidentificationofpolysaccharidesfromculturedCordycepsmilitaris(得自培養(yǎng)的Cordycepsmilitaris的多糖的分離、純化和鑒定).Fitoterapia2004,75:662-666"中所述。不僅破壞了多糖的結構、使其生物活性遭到極大的破壞，同時提高了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本，造成了環(huán)境污染?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖的生物活性功能與其分子量、分子結構等具有直接相關性，因此若要充分發(fā)揮蟲草多糖的生物活性，必須在提高蟲草多糖產(chǎn)量的同時，改進分離純化技術，保證蟲草多糖的純度，同時維持其天然結構不被破壞。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種能夠產(chǎn)業(yè)化高效生產(chǎn)蟲草胞外多糖的蛹蟲草培養(yǎng)方法，還提供了一種利用膜透析技術快速分離純化具有生物活性的胞外多糖單一組分的方法，該方法不使用任何有機溶劑和化學試劑，充分保證了蟲草胞外多糖的化學結構不被破壞。本發(fā)明可以利用常用的蛹蟲草菌種，采用不同培養(yǎng)方式及新研制的培養(yǎng)基配方培養(yǎng)，控制適宜的溫度等培養(yǎng)條件，篩選得到了蟲草胞外多糖高產(chǎn)量的最優(yōu)化培養(yǎng)條件；同時研究出了一種能夠對產(chǎn)生的胞外多糖利用不同分子量的超濾膜截留分離，通過高效液相色譜技術檢測，獲得純度高、均一性好的活性多糖的方法。其中，蛹蟲草菌種為本領域常用菌種，可以是市場上能夠購買到的任意蛹蟲草菌種，例如本發(fā)明實施例中所用到的蛹蟲草菌種購買自山東省濟寧市梁山縣靈芝蟲草科技開發(fā)有限公司。本發(fā)明的一個目的是提供一種蛹蟲草菌種的蛹蟲草菌絲體深層發(fā)酵高效生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)方法，該方法包括靜置培養(yǎng)歩驟，具體操作是在培養(yǎng)基中接入蛹蟲草菌種，接種量5%-10%，在22-27℃條件下，靜置培養(yǎng)5-9天，其中所用的培養(yǎng)基包含(重量百分含量)酵母浸出粉0.5-1.5，紅糖1-3%，雄蠶蛾油3-5%，KN030.8-0.95%，MgS040.1-0.2°/和KH2PO40.1-0.2%。本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用膜透析技術快速分離純化具有生物活性的胞外多糖單一組分的方法，該方法不使用任何有機溶劑和化學試劑，充分保證蟲草胞外多糖的化學結構不被破壞，且純度達95%以上。該方法具體包括以下步驟(1)靜置培養(yǎng)菌種在培養(yǎng)基中接入蛹蟲草菌種，接種量5%-10%，在22-27'C條件下，培養(yǎng)5-9天，其中所用的培養(yǎng)基包含(重量百分含量)酵母浸出粉0.5-1.5，紅糖1-3%，雄蠶蛾油3-5%，KN030.8-0.95%，MgS040.1-0.2%和1012040.1-0.2%。(2)過濾培養(yǎng)液，并將濾液在10000-15000rmp/min離心收集上清夜，除去培養(yǎng)基中固態(tài)雜質(zhì)，并對上清夜再過濾一次并收集濾液；(3)將步驟(2)所得濾液利用0.20-0.4511111過濾膜過濾并收集濾液，該步驟除去了濾液中的懸浮顆粒雜質(zhì)；(4)對步驟(3)所得濾液用分子量為0.5萬道爾頓的超濾膜高壓過濾并收集濾液，該步驟除去濾液中色素、培養(yǎng)基中小分子量的糖、肽等雜質(zhì)；(5)用分子量截留值為l、5、IO萬道爾頓的不同超濾膜對歩驟(4)所得濾液分級高壓超濾濃縮，去除超濾液，得到分子量為l-5、5-10萬道爾頓的截留濃縮液；(6)對各組分截留濃縮液通過超低溫真空冷凍干燥即得分子量控制在一定范圍段的多糖粉；其中在步驟(4)后可以利用高效液相檢測步驟(4)所得濾液中蟲草胞外多糖的分布范圍。該方法不使用任何有機溶劑和化學試劑，以充分保證蟲草胞外多糖的化學結構不被破壞，且胞外多糖的純度達95%以上。對于終產(chǎn)物的檢測是通過HPLC檢測，檢測結果如圖。圖l蛹蟲草胞外粗多糖HPLC分布圖譜。圖2分子量分布于5-10萬道爾頓的蛹蟲草胞外多糖HPLC檢測圖譜。圖3分子量分布于1-5萬道爾頓的蛹蟲草胞外多糖HPLC檢測圖譜。具體實施方方式實施例l在5升的培養(yǎng)瓶中，接種蛹蟲草菌，接種量10%，培養(yǎng)基的量為3升，按培養(yǎng)基酵母浸出粉1.5%，紅糖2.5%，雄蠶蛾油5%，KNO30.95%，MgS040.2%,KH2P040.2%的配方，靜置培養(yǎng)8天。對所得培養(yǎng)液普通濾紙過濾，濾液12000rmp/min離心，得濾液用0.22um濾過膜過濾，濾液繼續(xù)用分子量為0.5萬道爾頓的超濾膜高壓過濾，后用分子量截留值為l、5、IO萬道爾頓的不同超濾膜對所得濾液分級高壓超濾濃縮，對所得截留濃縮液真空冷凍干燥即得分子量分布均一、純度≥95%的單一組分。實施例2在50升的發(fā)酵罐，接種蛹蟲草菌，接種量6%，發(fā)酵罐培養(yǎng)基的量為30升，按培養(yǎng)基酵母浸出粉0.8%，紅糖1.5%，雄蠶蛾油4%，KNO30.85%，MgSO40.1%，KH2P040.1%的配方，靜置培養(yǎng)6天。對所得培養(yǎng)液普通濾紙過濾，濾液12000rmp/min離心，得濾液用0.22um濾過膜過濾，濾液繼續(xù)用分子量為0.5萬道爾頓的超濾膜高壓過濾，后用分子量截留值為l、5、10萬道爾頓的不同超濾膜對所得濾液分級高壓超濾濃縮，對所得截留濃縮液真空冷凍干燥即得分子量分布均一、純度》95%的單一組分。實施例3在100升的發(fā)酵罐，接種蛹蟲草菌，接種量8%，發(fā)酵罐培養(yǎng)基的量為60升，按培養(yǎng)基酵母浸出粉1%，紅糖2.0%，雄蠶蛾油3%，KNO30.88%，MgSO40.15%，KH2P040.15%的配方，靜置培養(yǎng)7天。對所得培養(yǎng)液普通濾紙過濾，濾液12000rmp/min離心，得濾液用0.22ym濾過膜過濾，濾液繼續(xù)用分子量為0.5萬道爾頓的超濾膜高壓過濾，后用分子量截留值為l、5、IO萬道爾頓的不同超濾膜對所得濾液分級高壓超濾濃縮，對所得截留濃縮液真空冷凍干燥即得分子量分布均一、純度》95%的單一組分。本發(fā)明的有益效果。通過本發(fā)明方法獲得蟲草胞外多糖具有如下有益效果，如下表l-4:表l.相同條件下振蕩、靜置兩種培養(yǎng)方式對蛹蟲草胞外多糖的產(chǎn)量影響<table><row><column>蛹蟲草胞外多糖含量(g/L)</column></row><row><column>振蕩培養(yǎng)</column><column>靜置培養(yǎng)</column></row><row><column>1.9736</column><column>3.9956</column></row><table>表2.不同碳源對蛹蟲草多糖產(chǎn)量的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3.不同氮源對蛹蟲草胞外多糖產(chǎn)量的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4.不同蠶蛾油對蛹蟲草胞外多糖產(chǎn)量的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1-4表明了通過本發(fā)明的靜置培養(yǎng)菌種能夠提高胞外多糖的產(chǎn)量，在培養(yǎng)基成分中，紅糖、蠶蛹粉、KN03、酵母膏、雄蠶蛾油更適合于本發(fā)明的方法，能夠使得胞外多糖的含量提高。權利要求1、一種蛹蟲草菌絲體深層發(fā)酵高效生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括以下靜置培養(yǎng)蛹蟲草步驟在培養(yǎng)基中接入蛹蟲草菌種，接種量5％-10％，在22-27℃條件下，靜置培養(yǎng)5-9天，其中所用的培養(yǎng)基以重量百分含量計包含酵母浸出粉0.5-1.5，紅糖1-3％，雄蠶蛾油3-5％，KNO30.8-0.95％，MgSO40.1-0.2％和KH2PO40.1-0.2％。2、一種利用膜透析技術快速分離純化具有生物活性的胞外多糖單一組分的方法，該方法包括以下步驟(1)利用權利要求l所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)蛹蟲草菌種；(2)過濾培養(yǎng)液，并將濾液在10000-15000rmp/min離心收集上清夜，并對上清夜再過濾一次并收集濾液；(3)將步驟(2)所得濾液利用0.20-0.45ym過濾膜過濾并收集濾液；(4)對步驟(3)所得濾液用分子量為0.5萬道爾頓的超濾膜高壓過濾并收集濾液；(5)用分子量截留值為l、5、IO萬道爾頓的不同超濾膜對歩驟(4)所得濾液分級高壓超濾濃縮，去除超濾液，得到分子量為l-5、5-10萬道爾頓的截留濃縮液；(6)對各組分截留濃縮液通過超低溫真空冷凍干燥即得分子量控制在一定范圍段的多糖粉。3、根據(jù)權利要求2所述的方法，其中在再步驟(4)后利用高效液相檢測步驟(4)所得濾液中蟲草胞外多糖的分布范圍。全文摘要本發(fā)明主要目的在于提供一種能夠產(chǎn)業(yè)化高效生產(chǎn)蟲草胞外多糖的培養(yǎng)方法，同時利用膜透析技術快速分離純化具有生物活性的胞外多糖單一組分，且純度≥95％，該純化技術中不使用任何有機溶劑和化學試劑，以充分保證蟲草胞外多糖的化學結構不被破壞，從而保持其生物活性。文檔編號C12P19/00GK101200748SQ20071015684公開日2008年6月18日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權日2007年11月13日發(fā)明者李有貴,范雷法,計東風,石鐘申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院