專利名稱：：Fq15糞腸球菌以及采用該菌種生產(chǎn)促生長(zhǎng)飼料添加劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種飼料(飼料、飲水)添加劑，尤其是一種可替代飼用抗生素、促進(jìn)畜禽高效增重、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低的促生長(zhǎng)詞料添加劑的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)調(diào)整，規(guī)?；?、集團(tuán)化養(yǎng)殖已成為發(fā)展趨勢(shì)，養(yǎng)殖戶為了追求經(jīng)濟(jì)效益最大化，在詞料中添加飼用抗生素、激素及益生菌制劑等，以達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物增重和快速生長(zhǎng)的目的。在整個(gè)養(yǎng)殖期添加促生長(zhǎng)詞用抗生素等藥物，可抑制和殺滅畜禽腸道微生物的生長(zhǎng)、繁殖。一方面，減弱了腸道微生物對(duì)腸壁上皮細(xì)胞的有效刺激，抑制了腸絨毛的發(fā)育，使腸絨毛出現(xiàn)退化，腸壁變薄，提高了腸道內(nèi)養(yǎng)分的透過(guò)率，從而提高動(dòng)物的增長(zhǎng)速度；同時(shí)也增加了腸道病原微生物的通過(guò)性，增加了疾病感染機(jī)會(huì)。另一方面，減少了對(duì)腸壁免疫細(xì)胞的刺激，使M細(xì)胞對(duì)抗原的攝取能力下降，巨噬細(xì)胞酶分泌能力及抗原信息傳遞能力減弱，抑制了機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。因此，在飼料中添加抗生素促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)與動(dòng)物機(jī)體的防病及免疫功能形成了矛盾。添加促生長(zhǎng)飼用抗生素等藥物還可使致病菌的耐藥性越來(lái)越普遍、耐藥譜越來(lái)越廣，由此引起動(dòng)物疫病越來(lái)越難以控制，形成惡性循環(huán)，不但影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，還會(huì)造成畜禽類產(chǎn)品中殘留抗生素和激素的嚴(yán)重超標(biāo)，直接影響到人類的身體健康。在詞料中添加益生菌等微生態(tài)飼料添加劑，一方面，能分泌和產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如B族維生素1、2、6、12，葉酸、泛酸、VH和多種氨基酸及菌體蛋白等)，平衡飼料營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，有利于提高飼料利用率。另一方面，能分泌和產(chǎn)生脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，補(bǔ)充腸道消化酶的不足，同時(shí)，還能產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶及葡聚糖酶等消化道沒(méi)有的酶類，促進(jìn)腸道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。更重要的是微生態(tài)飼料添加劑能增加和促進(jìn)腸道有益微生物的生長(zhǎng)、繁殖，對(duì)腸壁上皮細(xì)胞形成有效刺激，促進(jìn)腸絨毛的發(fā)育，使腸壁皺褶增多、陷窩加深，從而增加了動(dòng)物腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效吸收面積，提高了機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力；益生菌還能產(chǎn)生促生長(zhǎng)因子，提高了細(xì)胞堿性磷酸酶(AKP)等活性水平，促進(jìn)細(xì)胞RNA、DNA及蛋白質(zhì)合成水平，促進(jìn)了動(dòng)物生長(zhǎng)和增重。由于腸壁結(jié)構(gòu)和益生菌群完善，減少了病原微生物的通透性，降低了疾病感染機(jī)會(huì)。專利號(hào)為200410068185.6的發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了"一種飼料級(jí)微生物添加劑及其制備與應(yīng)用"，是由噬酸乳桿菌、糞腸球菌、丁酸梭菌構(gòu)成的益生菌部分與由丁酸、乙酸、丙酸構(gòu)成的營(yíng)養(yǎng)液部分混合而成。其原料組分種類較多，生產(chǎn)過(guò)程中需要對(duì)各種組分嚴(yán)格配比，存在著生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高的問(wèn)題；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明增重效果并不理想小規(guī)模試驗(yàn)30天平均增重18.5克，42天平均增重42.5克；大規(guī)模試驗(yàn)42天平均增重10克。因此，盡管微生態(tài)飼料添加劑也具有一定的增重效果，但遠(yuǎn)不如抗生素增重效果顯著，為此，目前養(yǎng)殖戶大多還是以對(duì)人體有害的抗生素作為動(dòng)物增重的首選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的微生態(tài)飼料添加劑增重效果差的技術(shù)問(wèn)題，提供一種可替代飼用抗生素、促進(jìn)畜禽高效增重、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低的促生長(zhǎng)飼料添加劑的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種FQ15糞腸球菌CGMCC2196，屬于腸球菌屬、糞腸球菌種，菌株代碼FQ15，拉丁文學(xué)名f/z^racocc^s/aecah's，己在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，菌種保藏代號(hào)CGMCC2196，菌種保藏日期2007-10-16。FQ15糞腸球菌株的分離培養(yǎng)方法將健康雞致死、解剖后，分別用無(wú)菌方法取小腸黏膜和腸內(nèi)容物或新鮮糞便各lg，加入裝有9mL滅菌生理鹽水的小瓶中，混勻后進(jìn)行倍比稀釋，取1(T、10—5、10—6稀釋度的混懸液100uL，分別滴加到3個(gè)MRS固體培養(yǎng)基上，用玻璃棒涂抹均勻，然后于37-C厭氧和需氧培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)及是否有溶鈣環(huán)。挑選有溶鈣環(huán)的乳酸菌菌落接種到MRS瓊脂斜面上進(jìn)行純培養(yǎng)。FQ15糞腸球菌株的具體特性3.1菌落形態(tài)與菌體形態(tài)利用MRS培養(yǎng)基，從11份健康雞腸道和糞便樣本中共分離、純化得到16株能產(chǎn)生乳酸的分離物。FQ15糞腸球菌分離菌株在MRS培養(yǎng)基上37。C生長(zhǎng)良好，菌落成圓形，直徑大小0.82.0mm，較光滑，乳白色或灰白色，菌落周圍有輕微的溶鈣環(huán)。革蘭氏染色鏡鑒，菌體呈球形，直徑為0.50.8mm，成單或雙存在、無(wú)芽孢、革蘭氏染色呈陽(yáng)性。3.2生理生化鑒定經(jīng)過(guò)常規(guī)生化和系統(tǒng)生化鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表所示。表-lFQ15菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>根據(jù)表中結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征并與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照，參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》以及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步判定為腸球菌，糞腸球菌種，菌株命名為FQ15。一種以FQ15糞腸球菌為菌種生產(chǎn)促生長(zhǎng)飼料添加劑的方法，按如下步驟進(jìn)行a.用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在3045'C有氧或兼性條件下培養(yǎng)FQ15糞腸球菌424小時(shí)，成為一級(jí)種子；b.將步驟a所獲得的一級(jí)種子液接種在種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在3045"C有氧或兼性條件下培養(yǎng)424小時(shí)，成為二級(jí)種子；c.將步驟b所獲得的二級(jí)種子液接種在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用改良的MRS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在3045i:有氧或兼性條件下，采用定時(shí)或連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵方式培養(yǎng)8~36小時(shí)；c.將c步驟所獲得的發(fā)酵液分裝或?qū)步驟所獲得的發(fā)酵液分離，在菌泥中加入1~25%的干燥保護(hù)劑，采用208(TC制粒、凍干或噴霧干燥。所述c步驟中的改良MRS培養(yǎng)基是在每升MRS培養(yǎng)基中加有大豆蛋白胨530g，葡萄糖110g，酵母粉110g，乙酸鈉l-10g，檸檬酸二胺0.18g，Tween800.15g，磷酸氫二鉀0.1~5g，硫酸鎂0.05~lg，硫酸錳0.001~0.2g，碳酸韓l~30g，純凈水1升，調(diào)節(jié)pH值5.58.0。本發(fā)明采用一株功能性益生菌一FQ15糞腸球菌(CGMCC2196)，該菌株能夠很好的在家禽腸道內(nèi)定植，以該菌種生產(chǎn)的詞料添加劑在動(dòng)物體內(nèi)繁殖過(guò)程中能產(chǎn)生多種氨基酸、維生素、蛋白酶以及淀粉酶(此類物質(zhì)均為家禽體內(nèi)必需物質(zhì))等，對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)起到平衡作用，促進(jìn)了動(dòng)物機(jī)體對(duì)飼料的消化，提高了飼料的利用率，從而使動(dòng)物發(fā)揮最佳的生長(zhǎng)潛能，達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的，其增重效果甚至超過(guò)了詞用抗生素增重的效果。不僅如此，通過(guò)使用本發(fā)明的功能性益生菌產(chǎn)品后，能使家禽機(jī)體腸道菌群恢復(fù)平衡，減少了因腸道菌群紊亂而導(dǎo)致的細(xì)菌疾病，可減少或取代抗生素的使用，避免抗生素對(duì)動(dòng)物及人體所帶來(lái)的副作用。據(jù)有可替代飼用抗生素、促進(jìn)畜禽高效增重、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。圖1是本發(fā)明的FQ15糞腸球菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落。圖2是本發(fā)明的FQ15糞腸球菌株經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢細(xì)菌形態(tài)。圖3是本發(fā)明試驗(yàn)組十二指腸發(fā)育狀況示意圖。圖4是對(duì)照組十二指腸發(fā)育狀況示意圖。圖5是本發(fā)明試驗(yàn)組糞便形成情況示意圖。圖6是對(duì)照組糞便形成情況示意圖。菌種保藏日期2007-10-16。保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。菌種保藏代號(hào)CGMCC2196。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:一種FQ15糞腸球菌CGMCC2196，屬于腸球菌屬、糞腸球菌種，菌株代碼FQ15，拉丁文學(xué)名^^arococcws/aeca72's，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏。FQ15糞腸球菌株的分離培養(yǎng)方法將健康雞致死、解剖后，分別用無(wú)菌方法取小腸黏膜和腸內(nèi)容物或新鮮糞便各lg，加入裝有9mL滅菌生理鹽水的小瓶中，混勻后進(jìn)行倍比稀釋，取10—1、10—5、10—6稀釋度的混懸液100!iL,分別滴加到3個(gè)MRS固體培養(yǎng)基上，用玻璃棒涂抹均勻，然后于37"C厭氧和需氧培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)及是否有溶鈣環(huán)。挑選有溶鈣環(huán)的乳酸菌菌落接種到MRS瓊脂斜面上進(jìn)行純培養(yǎng)，4"C冰箱保存。所述的FQ15糞腸球菌菌株是從動(dòng)物腸道中分離的兼性菌，無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢的革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌；在MRS瓊脂培養(yǎng)基上能形成圓形、隆起、不透明乳白色的中小菌落；能分解葡萄糖和乳糖產(chǎn)生乳酸、乙酸和細(xì)菌素，分泌淀粉酶和蛋白酶等。能在含有0.1-1.4%的膽鹽和0.1-1.0%的苯酚條件的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；能在pH1.5和pH3.5的環(huán)境中生長(zhǎng)；同時(shí)，具有良好的腸道吸附、定值特性，該菌株對(duì)機(jī)體不產(chǎn)生免疫刺激或產(chǎn)生抗體能力低；在干燥后，細(xì)菌存活率在2589%。FQ15糞腸球菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落、FQ15糞腸球菌株經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢細(xì)菌形態(tài)見(jiàn)圖1、圖2。以FQ15糞腸球菌為菌種生產(chǎn)促生長(zhǎng)飼料添加劑的方法，按如下步驟進(jìn)行a.用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在3045'C有氧或兼性條件下培養(yǎng)FQ15糞腸球菌424小時(shí)，成為一級(jí)種子；b.將步驟a所獲得的一級(jí)種子液接種在種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在3045'C有氧或兼性條件下培養(yǎng)424小時(shí)，成為二級(jí)種子；c.將步驟b所獲得的二級(jí)種子液接種在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用改良的MRS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在3045'C有氧或兼性條件下，采用定時(shí)或連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵方式培養(yǎng)8~36小時(shí)；c.將c步驟所獲得的發(fā)酵液分裝或?qū)步驟所獲得的發(fā)酵液分離，在所獲得的菌泥中加入1~25%的干燥保護(hù)劑，采用2080'C制粒、凍干或噴霧干燥。干燥保護(hù)劑可用現(xiàn)有技術(shù)中的任何一種，如中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?00510047203.7的發(fā)明專利申請(qǐng)"藥用水溶性微膠囊及生產(chǎn)方法"中所公開(kāi)的活性保護(hù)劑，即取海澡糖的濃度為1~3%，PH值為6.87.2，離子濃度為0.2mol/L的PBS溶液作為為活性藥劑保護(hù)液。實(shí)施例2:所用菌種同實(shí)施例1。與實(shí)施例1所不同的是其中c步驟中的改良MRS培養(yǎng)基是在每升MRS培養(yǎng)基中加有大豆蛋白胨530g，葡萄糖l10g，酵母粉l10g，乙酸鈉l10g，擰檬酸二胺0.18g，Tween800.15g，磷酸氫二鉀0.15g，硫酸鎂0.05~lg，硫酸錳0.001~0.2g，碳酸鈣l30g，純凈水1升，調(diào)節(jié)pH值5.58.0。本發(fā)明實(shí)施例試驗(yàn)結(jié)果如下1.FQ15糞腸球菌菌株對(duì)小白鼠增重試驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物采用1月齡的KM鼠，60只，體重20—23g;試驗(yàn)菌株FQ15糞腸球菌菌株；試驗(yàn)分組按照l(shuí):l的公母比例隨機(jī)分成3組，試驗(yàn)?zāi)康陌凑詹煌奶砑恿縼?lái)研究FQ15糞腸球菌菌株對(duì)小白鼠的增重影響。試驗(yàn)組對(duì)照組FQ15糞腸球菌組飼喂量0l億1000萬(wàn)試驗(yàn)數(shù)20只20只20只組別試驗(yàn)前初重試驗(yàn)后末重平均日增重增重提高率對(duì)照22.23g28.86g0.44g糞l億21.00g30.61g0.64g45.45%腸球0.1億22.3430.390.54g22.73%菌結(jié)論通過(guò)上述試驗(yàn)，試驗(yàn)組(l億)增重率比對(duì)照組提高了45.45%，且比0.1億組提高了1倍，因此，本發(fā)明對(duì)KM小白鼠具有明顯的增重效果。2.本發(fā)明實(shí)施例肉雞小規(guī)模試驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物肉雞(AA雞)1070羽；試驗(yàn)期限試驗(yàn)從l日齡開(kāi)始，試驗(yàn)期為30天；飼喂劑量每天飼喂l億/羽活菌數(shù)，通過(guò)飼料或飲水添加。結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)論通過(guò)上述試驗(yàn)，試驗(yàn)組增重率比對(duì)照組提高了20.73%，料肉比降低了25.68%,死亡降低了44.4%。因此，本發(fā)明實(shí)施例對(duì)AA肉雞具有明顯的增重和降低死亡的功能。3.本發(fā)明實(shí)施例大規(guī)模試驗(yàn)肉雞養(yǎng)殖中試試驗(yàn)時(shí)間試驗(yàn)期2006.4.26_2006.6.5試驗(yàn)動(dòng)物3日齡肉用仔雞(AA雞)，14000羽試驗(yàn)分組隨機(jī)分成2組，每組7000羽，自由采食和飲水試驗(yàn)組每日詞喂0.5—l億/羽活菌，養(yǎng)殖期內(nèi)添加在詞料、飲水中。對(duì)照組正常飲水，水、料中均不含任何微生態(tài)制劑。觀察項(xiàng)目體重測(cè)定分別于進(jìn)雛時(shí)和出欄時(shí)進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算每羽凈增體重。耗料量每天記錄各組肉雞耗料量，分別統(tǒng)計(jì)各組耗料總量。料肉比根據(jù)耗料量和凈增重量，計(jì)算各組肉雞的料肉比。料肉比=耗料總量(kg)/增重總量(kg)消化道觀察在出欄前一天，剖檢試驗(yàn)組和對(duì)照組的健康雞，觀察腸壁發(fā)育情況，其結(jié)果如圖3、4所示，結(jié)果表明，試驗(yàn)組腸壁增厚，腸絨毛發(fā)育良好。對(duì)飼養(yǎng)期的糞便形成進(jìn)行觀察記錄正常與不正常糞便的天數(shù)。結(jié)果如圖5、6所示，從糞便形成情況來(lái)看，試驗(yàn)組糞便干燥、成型。試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)論a.通過(guò)試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行比較，增重效果差異極顯著(P<0.01)。b.通過(guò)試驗(yàn)該菌株能促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)，使雞群整齊度與均勻度有很大改善，出欄平均重量提高了9.0%以上，試驗(yàn)組雞群可提前3—5天出欄。權(quán)利要求1.一種FQ15糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)CGMCC2196。2.—種以FQ15糞腸球菌為菌種生產(chǎn)促生長(zhǎng)飼料添加劑的方法，按如下步驟進(jìn)行-a.用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在3045'C有氧或兼性條件下培養(yǎng)FQ15糞腸球菌424小時(shí)，成為一級(jí)種子；b.將步驟a所獲得的一級(jí)種子液接種在種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在3045"C有氧或兼性條件下培養(yǎng)424小時(shí)，成為二級(jí)種子；c.將步驟b所獲得的二級(jí)種子液接種在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用改良的MRS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在3045。C有氧或兼性條件下，采用定時(shí)或連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵方式培養(yǎng)8~36小時(shí)；d.將c步驟所獲得的發(fā)酵液分裝或?qū)步驟所獲得的發(fā)酵液分離，在菌泥中加入125%的干燥保護(hù)劑，采用208(TC制粒、凍干或噴霧干燥。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促生長(zhǎng)飼料添加劑的生產(chǎn)方法，其特征在于所述c步驟中的改良MRS培養(yǎng)基是在每升MRS培養(yǎng)基中加有大豆蛋白胨5~30g，葡萄糖l~10g，酵母粉l~10g，乙酸鈉l~10g，檸檬酸二胺0.1~8g，Tween800.1~5g,磷酸氫二鉀0.1~5g，硫酸鎂0.05~lg，硫酸錳0.001~0.2g，碳酸鈣l~30g，純凈水1升，調(diào)節(jié)pH值5.5-8.0。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種FQ15糞腸球菌及以此菌種生產(chǎn)促生長(zhǎng)飼料添加劑的方法用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在30～45℃有氧或兼性條件下培養(yǎng)FQ15糞腸球菌4～24小時(shí)，成為一級(jí)種子；將一級(jí)種子液接種在種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用MRS培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，在30～45℃有氧或兼性條件下培養(yǎng)4～24小時(shí)，成為二級(jí)種子；將二級(jí)種子液接種在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用改良的MRS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在30～45℃有氧或兼性條件下，采用定時(shí)或連續(xù)補(bǔ)料分批發(fā)酵方式培養(yǎng)8～36小時(shí)；將所獲得的發(fā)酵液分裝或?qū)步驟所獲得的發(fā)酵液分離，在菌泥中加入1～25％的干燥保護(hù)劑，采用20～80℃制粒、凍干或噴霧干燥?？商娲曈每股?、促進(jìn)畜禽高效增重、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N1/20GK101220342SQ20071015825公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2007年11月14日優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日發(fā)明者莊國(guó)宏申請(qǐng)人:大連三儀動(dòng)物藥品有限公司