專利名稱：含sod基因的重組雙表達(dá)家蠶多角體桿狀病毒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程生產(chǎn)MnSOD的方法。具體地講，本發(fā)明涉及含有 SOD基因及多角體基因的重組雙表達(dá)家蠶桿狀病毒的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)能使人體內(nèi)自由基保持在"自穩(wěn)態(tài)"。超氧化物歧化酶清除超氧 化物自由基，防止對(duì)機(jī)體直接或間接的損傷作用；SOD使(V-成為細(xì)胞內(nèi)自由基的排污漕；調(diào)
節(jié)機(jī)體內(nèi)(V—的水平；調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)NO的水平；催化反應(yīng)產(chǎn)物貼2的作用(《自由基生物學(xué)的理
論與應(yīng)用》ppl78-180)。
現(xiàn)在市售SOD多數(shù)為從哺乳動(dòng)物牛、豬等的肝臟中提取，隨著瘋牛病、口啼疫、禽流感 等流行，安全性有很大問題。家蠶重組病毒穿梭載體表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac Bacnlovirus Expression System)是真核表達(dá)系統(tǒng)，該技術(shù)自1983年Smith等首創(chuàng)以來，已有千種外源 基因在該系統(tǒng)表達(dá)(《昆蟲病毒分子生物學(xué)》，1998， pP547-178)，由于有家蠶血淋巴本身的 大量蛋白的保護(hù)作用和一些未知機(jī)理的作用，家蠶表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工的方式與哺 乳動(dòng)物接近，能識(shí)別并正確地進(jìn)行信號(hào)肽切除及磷酸化、糖基化、?；茸饔茫磉_(dá)產(chǎn)物 具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性和功能均與天然蛋白相似。
目前構(gòu)建的重組桿狀病毒大多是多角體缺失型病毒，這種病毒因?yàn)闆]有多角體包埋的病 毒粒子，經(jīng)家蠶中腸強(qiáng)堿性破壞而失活，因此不能經(jīng)口添食感染，需逐個(gè)個(gè)體注射接種，并 引起宿主死亡，使得每批生產(chǎn)時(shí)都要接種病毒，操作繁瑣。注射接種就成為大規(guī)模、工業(yè)化 生產(chǎn)的瓶頸。
添食感染可采取重組病毒噴散到桑葉上的方法感染家蠶，結(jié)合現(xiàn)階段的養(yǎng)蠶技術(shù)，可實(shí) 現(xiàn)規(guī)?；凸I(yè)化接種，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省勞力和成本。

發(fā)明內(nèi)容
為此本發(fā)明的目的是采用家蠶桿狀病毒穿梭載體表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建含有SOD基因及多角 體基因的重組雙表達(dá)桿狀病毒，提供可以添食感染家蠶幼蟲的病毒粒子。以期通過家蠶表達(dá) 目的基因MnSOD，實(shí)現(xiàn)規(guī)模化和工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明含MnSOD基因的重組雙表達(dá)家蠶多角體桿狀病毒的構(gòu)建方法包括以下步驟 (1)以家蠶5齡第3天幼蟲以RNA抽提試劑盒提取總RNA，設(shè)計(jì)MnSOD引物，正反向引物5' 端分別引進(jìn)fcoRI和A>/7l酶切位點(diǎn)；
(2) 以總RNA為模板，在通用引物oligo-dTw和反向轉(zhuǎn)錄酶(Super script II reverse transcriptase)作用下合成單鏈cDNA;
(3) 以單鏈cDNA為模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，條件為94'C預(yù)變性5分 鐘，再以94"C1分鐘，55°C l分鐘，72°C 2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72'C延長(zhǎng)10分鐘；
(4) 合成的MnSOD基因經(jīng)乙醇沉淀和fcdU和yf/wl雙酶切，電泳并切膠回收將MnSOD基 因與pFastBacHTa以連接試劑盒連接并轉(zhuǎn)化XL-Blue細(xì)胞，挑斑在含每毫升100 U g氨芐青霉 素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)繁殖，提取重組供體質(zhì)粒pFastBacHTa/MnSOD;
(5) 以家蠶桿狀病毒DNA為模板，以多角體啟動(dòng)子5'端和多角體基因3'設(shè)計(jì)引物，通過 PCR方法合成家蠶部分多角體基因，并將其克隆到pFastBac Dual plasmid質(zhì)粒；
(6) 以Afco工和/T/wI限制性內(nèi)切酶分別酶切pFastBacHTa/MnSOD和含部分多角體基因的雙 表達(dá)質(zhì)粒，凝膠回收目的片段，將MnSOD基因插入雙表達(dá)質(zhì)粒的P10啟動(dòng)子下構(gòu)建成雙表達(dá) 載體Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD;
(7) 將Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD轉(zhuǎn)染到￡ coh DH10Bac/BmNPV, 37. 5。C培養(yǎng)24 48小時(shí)，從中挑選容易分離、獨(dú)立的白斑，在含有50ug/ml卡那霉素、7ug/ral慶大霉素、 10ug/ml四環(huán)素的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表 達(dá)病毒DNA;
(8) 將上述提取的DNA，在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體(Cellfectin)介導(dǎo)下導(dǎo)入轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞， 獲得重組病毒。
步驟(1)所述Mn-SOD引物的序列為
正向引物5' -atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3，，
反向引物5' -gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'。 步驟(5)所述合成家蠶部分多角體基因所用引物的序列如下 5' BM PH: GTCGACMGCTCTGTCCGT
Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
本發(fā)明提供了含有提取家蠶幼蟲總RNA，再經(jīng)RT-PCR獲得MnSOD基因的方法，經(jīng)測(cè)序證 明其核苷酸序列完全正確。
本發(fā)明提供了含MnSOD基因的重組家蠶桿狀病毒Bacmid。將MnSOD基因插入到Bacmid 中，獲得重組的含SOD基因的BmBacmid/MnSOD。
本發(fā)明提供了經(jīng)改造后的含多角體蛋白基因的雙克隆位點(diǎn)供體質(zhì)粒，重組病毒可經(jīng)口添 食感染家蠶。
本發(fā)明提供了 MnSOD基因在家蠶幼蟲中的表達(dá)產(chǎn)物。
綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下，通過構(gòu)建含有MnSOD基因及多角體基因的重組雙表達(dá)桿 狀病毒，添食感染家蠶幼蟲表達(dá)目的基因MnS0D;與哺乳動(dòng)物組織提取的MnS0D在臨床應(yīng)用 中有種種不足(例如排異，瘋中病等，交叉感染)相比，在家蠶幼蟲的MnS0D更具有實(shí)用價(jià) 值；家蠶是可以無菌大規(guī)模生產(chǎn)的昆蟲，可以低成本大規(guī)模的飼養(yǎng)。蠶體中有多種天然蛋白 質(zhì)保護(hù)劑，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物有保護(hù)作用，使基因表達(dá)產(chǎn)物十分穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步闡述。 實(shí)施例l、 Mn-SOD基因的合成
以家蠶N4蠶品種為材料，取5齡第3天幼蟲以RNA抽提試劑盒(TRIzol RNA extraction reagent kit)提取總RNA，經(jīng)電泳檢測(cè)。
設(shè)計(jì)MnS0D引物。正向引物5' -atc卿ttcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3'， 反向引物 5' -gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'.為便于克隆正反向引物5'端分別引進(jìn)5boRI 和命/ I酶切位點(diǎn)。
以總RNA為模板，在通用引物oligo-dT18和反向轉(zhuǎn)錄酶(Super script II reverse transcriptase)作用下合成單鏈cDNA，再以此為模板在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD 基因，PCR合成的條件為94'C預(yù)變性5分鐘，再以94'C1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 2分鐘， 共35個(gè)循環(huán)，最后72'C延長(zhǎng)10分鐘。
合成的MnS0D基因經(jīng)乙醇沉淀和fc凍I和f/wl雙酶切，電泳并切膠回收。將MnS0D基因與 pFastBacHTa以連接試劑盒連接并轉(zhuǎn)化XL-Blue細(xì)胞，挑斑在含每毫升100 u g氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)繁殖，提取重組供體質(zhì)粒pFastBacHTa/MnSOD; 實(shí)施例2、含SOD基因的家蠶雙表達(dá)重組載體構(gòu)建
以家蠶桿狀病毒DNA為模板，以5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGT (for the 5' BM promoter) and Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTMTACGCCGGACCAGTG (the 3' of the Polyhedrin coding sequense)為引物，通過PCR方法合成家蠶多角體基因，并將其克隆到 pFastBac Dual plasmid質(zhì)粒。
以/Ifcol和《w I限制性內(nèi)切酶分別酶切pFastBacHTa/MnSOD和含家蠶多角體基因的雙表 達(dá)質(zhì)粒，凝膠回收目的片段，將MnS0D基因插入雙表達(dá)載體的P10啟動(dòng)子下構(gòu)建成雙表達(dá)載 體Bm polyhedrin pFB dual/MnS0D。 實(shí)施例3、含MnSOD基因的家蠶雙表達(dá)重組病毒構(gòu)建
將Bm polyhedrin pFB dual/MnS0D轉(zhuǎn)染到￡ DH10Bac/BmNPV， 37. 5。C培養(yǎng)24
48小時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)板40小時(shí)平均產(chǎn)生菌斑264，白斑率4.5%，從中挑選容易分離、獨(dú)立的
白斑6個(gè)，在含有50u g/ral卡那霉素、7ng/ml慶大霉素、10ug/ml四環(huán)素的液體培養(yǎng)基上
培養(yǎng)過夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達(dá)病毒DNA;
實(shí)施例4、含Mn SOD基因及多角體基因的雙表達(dá)重組病毒添食感染家蠶表達(dá)目的蛋白MnSOD
的應(yīng)用實(shí)例
將上述提取出的含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達(dá)病毒DNA,在轉(zhuǎn)染試劑 Cellfectin (脂質(zhì)體)介導(dǎo)下導(dǎo)入轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞(BraN)，獲得雙表達(dá)重組病毒，避光保 存于-4'C備用。
將上述雙表達(dá)重組病毒DNA，與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin—起注射到5齡起蠶，DNA 1 u g力口 入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin 6u 1，混合均勻，放置30分，用微量注射器按每條5齡起蠶5 u 1 的劑量，在家蠶第三節(jié)間膜處注射進(jìn)家蠶體腔中。
在注射混合液96小時(shí)后，調(diào)査家蠶發(fā)病情況，收集發(fā)病家蠶，對(duì)發(fā)病家蠶的血淋巴、尸 體進(jìn)行400倍、600倍的顯微鏡檢査，確定是否NPV病毒病。
對(duì)收集到的發(fā)病家蠶，經(jīng)顯微鏡檢查，確定是家蠶桿狀病毒(NPV)病的家蠶，加水研碎， 涂抹桑葉，伺喂5齡起蠶二次，以后正常飼養(yǎng)。
添食后第2天開始收集家蠶NPV病毒病家蠶，取家蠶血淋巴進(jìn)行SDS-PAGE， WESTERN BLOTTING和SOD活性測(cè)定。
測(cè)定結(jié)果注射重組桿狀病毒DNA到家蠶，再將感染的家蠶磨碎液添食家蠶后96小時(shí)血 液中的MnSOD活性為125單位(U) /毫升血液(mL),比未感染重組病毒對(duì)照蠶(25 U/mL) 高5倍。 序列表
Mn-SOD引物的序列
正向引物5' -atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3，, 反向引物5' -gat鵬accg cCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3，。
合成家蠶部分多角體基因所用引物的序列
5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGT
Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
權(quán)利要求
1、含SOD基因的重組雙表達(dá)家蠶多角體桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于以下步驟(1)取家蠶5齡第3天幼蟲以RNA抽提試劑盒提取總RNA，設(shè)計(jì)MnSOD引物，正反向引物5’端分別引進(jìn)EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)；(2)以總RNA為模板，在通用引物oligo-dT18和反向轉(zhuǎn)錄酶(Super script II reversetranscriptase)作用下合成單鏈cDNA；(3)以單鏈cDNA為模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，條件為94℃預(yù)變性5分鐘，再以94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延長(zhǎng)10分鐘；(4)合成的MnSOD基因經(jīng)乙醇沉淀和EcoRI和KpnI雙酶切，電泳并切膠回收；將MnSOD基因與pFastBacHTa以連接試劑盒連接并轉(zhuǎn)化XL-Blue細(xì)胞，挑斑在含每毫升100μg氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)繁殖，提取重組供體質(zhì)粒pFastBacHTa/MnSOD；(5)以家蠶桿狀病毒DNA為模板，以多角體啟動(dòng)子5’端和多角體基因3’設(shè)計(jì)引物，通過PCR方法合成家蠶多角體基因，并將其克隆到pFastBac Dual plasmid質(zhì)粒；(6)以NcoI和KpnI限制性內(nèi)切酶分別酶切pFastBacHTa/MnSOD和含家蠶多角體基因的雙表達(dá)質(zhì)粒，凝膠回收目的片段，將MnSOD基因插入雙表達(dá)質(zhì)粒的P10啟動(dòng)子下構(gòu)建成雙表達(dá)載體Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；(7)將Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD轉(zhuǎn)染到E.coli DH10Bac/BmNPV，37.5℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，從中挑選獨(dú)立的白斑，在每毫升含有50μg卡那霉素、7μg慶大霉素和10μg四環(huán)素的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達(dá)病毒DNA；(8)將上述提取的DNA，在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體(Cellfectin)介導(dǎo)下導(dǎo)入轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，獲得重組病毒。
2、 如權(quán)利要求1所述含S0D基因的重組雙表達(dá)家蠶多角體桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于 所述MnSOD引物的序列為正向引物5' -atcgaattcA TGTTAATGTCACAAAGGATTG-3'， 反向引物5' -gatggtaccg cCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'。
3、 如權(quán)利要求1所述含S0D基因的重組雙表達(dá)家蠶多角體桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于 合成家蠶部分多角體基因所用引物的序列如下5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGTPolyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
全文摘要
含SOD基因的重組雙表達(dá)家蠶多角體桿狀病毒的構(gòu)建方法，包括提取家蠶總RNA，設(shè)計(jì)MnSOD引物，合成單鏈cDNA，合成MnSOD基因，將MnSOD基因與pFastBacHTa連接并轉(zhuǎn)化XL-Blue細(xì)胞，提取重組供體質(zhì)粒pFastBacHTa/MnSOD；以家蠶桿狀病毒DNA為模板，合成家蠶多角體基因，并將其克隆到pFastBac Dual plasmid質(zhì)粒；將MnSOD基因插入雙表達(dá)質(zhì)粒的P10啟動(dòng)子下構(gòu)建成雙表達(dá)載體Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；將其轉(zhuǎn)染后提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達(dá)病毒DNA；在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)下導(dǎo)入轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，獲得重組病毒。提供可以添食感染家蠶幼蟲的病毒粒子，通過家蠶表達(dá)目的基因MnSOD，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；凸I(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101182549SQ20071016449
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者岳萬福, 繆云根 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)