專利名稱：hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的提高青蒿素含量的方法，特別是一種 雙關鍵酶基因hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素 (artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合 物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯 喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的 方法就是青蒿素聯合療法(Artemisinin-based combination therapies, ACTs)。
另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發(fā)現青蒿素及其衍生物還具有 抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節(jié)的功能?？梢娗噍锼厥且环N極具潛力的天 然藥物。
目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素
的含量非常低(0.01%-1%)，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產受到了限制。由
于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具有可行性。有人嘗 試用組織培養(yǎng)和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低
于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多數研究在根中沒有檢測 到青蒿素。因此利用組織培養(yǎng)及細胞工程來生產青蒿素的可行性也不高。
經對現有技術文獻檢索發(fā)現，DahuaChen等在《PlantScience》(《植物 科學》，2000年155期179-185頁)發(fā)表了題為"Expression of a chimeric farnesyi diphosphate synthase gene in Artemisia annua L transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation"("通過農桿菌介 導轉化在青蒿植株中表達法尼基焦磷酸合酶基因")的論文，報道通過過量表達
法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase, FPS)，使轉基因青蒿中 青蒿素的含量提高了 2-3倍，但仍然只有1%左右。不過，代謝工程為提高青蒿 中青蒿素的含量提供了一條可行的方法。
現有技術中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,腦R)和法尼基焦磷酸合成酶 (farnesyl diphosphate synthase, FPS)是法尼基焦磷酸合成途徑中的關鍵酶， 而法尼基焦磷酸是青蒿素合成的前體。采用基因工程手段，用關鍵酶基因hmgr 和fps共轉化青蒿，將增加法尼基焦磷酸的合成速度，為青蒿素的生物合成提供 更多的前體，從而獲得青蒿素高產的青蒿植株，為規(guī)?；a青蒿素提供一條新 途徑。尚未發(fā)現與本發(fā)明主題所提及的hmgr和fps共轉化提高青蒿.中青蒿素含 量的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種hmgr和fps共轉化提 高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明涉及的關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉 化、分子檢測、青蒿素提取及含量測定用于本發(fā)明，建立了穩(wěn)定提高青蒿中青蒿 素含量的方法，為利用轉基因青蒿大規(guī)模生產青蒿素奠定堅實的基礎。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的:本發(fā)明從青蒿中克隆hmgr和fps基因， 構建含所述DNA分子的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將hmgr和fps基因 同時導入青蒿并再生出植株；PCR檢測外源目的基因hmgr和fps的整合情況， 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲 得青蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿植株。
本發(fā)明包括如下具體步驟
(1) 采用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因hmgr和fps;
(2) 把hmgr和fps基因可操作性地連接于表達調控序列，形成含hmgr和 fps基因的植物表達載體；
(3) 將含hmgr和fps基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌(為市場有公開 出售的生物材料，可以從多家公司如澳大利亞CAMBIA公司購得)，獲得用于轉化 青蒿的含hmgr和fps基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；
(4)利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的轉基因青 蒿植株；
(5)對獲得的轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青 蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿植株。
所述的經PCR檢測的轉基因青蒿植株是指，分別設計合成hmgr和fps基因 的檢測引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性植株即為轉基因青 蒿植株。
所述的HPLC-ELSD測定青蒿中青蒿素含量，方法如下色譜柱C-18反相硅 膠柱，流動相為甲醇水，甲醇:水的體積比為70:30，柱溫30°C ，流速1. 0 mL/min, 進樣量10叱，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度4(TC,放大系數(gain)為7，載氣 壓力5 bax。
本發(fā)明的hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程 方法，將關鍵酶基因hmgr和fps導入青蒿植株中，獲得了青蒿素含量顯著提高 的轉基因青蒿植株，共轉hmgr和fps基因青蒿中青蒿素的含量最高可達到23. 2 mg/g DW (即干重的2.32%)，是非轉化普通青蒿(IO mg/g DW，即干重的1%)的 2.32倍，該發(fā)明對于為青蒿素的規(guī)?；a提供高產、穩(wěn)定新藥源具有重要意 義。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提 下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不 限于下述的實施例。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 -
實施例1
青蒿hmgr和fps基因的克隆 1.青蒿基因組總RNA的提取
取少量青蒿(采用產于重慶酉陽青蒿素含量較高的青蒿品種)幼嫩葉片，
用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有1 mLTRIzol (TRIzol Reagents, GIBCO BRL， USA)的1.5mLEppendorf管中，充分振蕩后，于室溫下放置5min，加200 !^L氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2-3min后，于4。C、 12， 000g離心15 min; 將上清液(約600 PL)吸入干凈的1. 5 mL E卯endorf管中，加入等體積的異丙醇， 顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4。C、 12， 000g離心10 min;棄上清，加l mL'75。/。乙醇清洗，振蕩后，于4。C、 7， 500g離心5 min;室溫干燥15-20 min后 溶于適量(30-50 PL) RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量， 然后在分光光度計上測定RNA含量。
2.青蒿hmgr和fps基因的克隆 將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉錄酶XL (AMV)反轉錄獲得第一鏈cDNA， 根據所述青蒿hmgr基因的編碼序列(序列表中的序列1)和fps基因的編碼序 列(序列表中的序列2)，分別設計擴增出完整編碼框的上下游引物，并在上游 和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建 表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增后進行測序。DNA序列測 定由上海英駿生物技術服務有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結果表明， 所克隆的序列與GenBank中所報道的青蒿hmgr基因(序列表中的序列1)和fps 基因(序列表中的序列2)的編碼序列一致。
本實施例采用基因克隆方法從青蒿中獲得序列正確的青蒿素生物合成關鍵 酶基因hmgr和fps，為通過雙關鍵酶基因共轉化策略提高青蒿中青蒿素含量提 供了兩個重要關鍵酶基因。
實施例2
含hmgr和fps基因的植物雙元表達載體的構建 1.中間載體pMD18-T: :p35S-gfp*gus-nos的構建
選用pMD18-T和pCAMBIA1304為基本元件，構建中間載體 pMD18-T: :p35S-gfp*gus-nos。具體地，根據pCAMBIA1304上p35S-gfp*gus-nos 的序列設計一對引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點，以便 構建表達載體。以pCAMBIA1304質粒為模版，PCR擴增gfp*gus融合基因的表達 盒，連接到pMD18-T載體，轉化篩選，挑取單克隆測序確認無誤。2. 中間載體pMD18-T::p35S-hmgr-nos和pMD18-T::p35S-fps-nos的構建 以所述的pMD18-T: :p35S-gfp*gus-nos為基礎，用實施例1中hmgr和fps
基因分別替換其上的gfp*gus融合基因。具體地，Spel/BstEII雙酶切 pMD18-T: :hmgr, pMD18-T: :fps和pMD18-T: :p35S-gfp*gus_nos，回收hmgr， fps 和pMD18-T: :p35S-gfp*gus-nos大片段，hmgr和fps分別與大片段連接，轉化 大腸桿菌，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。
3. 植物雙元表達載體pCAMBIA2300:: gfp*gus的構建
以所述的pMD18-T: :p35S-gfp*gus-nos為基礎，將含有gfp*gus融合基因 的表達盒置于植物雙元表達載體pCAMBIA2300中，構建成植物雙元表達載體 pCAMBIA2300: :gfp*gus。具體操作如下用Smal和Pstl雙酶切pCAMBIA2300， 回收大片段，用Swal和Pstl雙酶切pMD18-T: :p35S-gfp*gus_nos，回收gfp*gus 的表達盒。將gfp*gus表達盒與pCAMBIA2300大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取 單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。
4. 植物雙元表達載體pCAMBIA2300:: gfp*gus-fps的構建
以所述的pMD18-T: :p35S-fps-nos為基礎，將含有fps基因的表達盒插入 植物雙元表達載體pCAMBIA2300::gfp*gus中，構建成植物雙元表達載體 pCAMBIA2300: :gfp*gus-fps 。具體操作如下用Smal和Pstl雙酶切 pCAMBIA2300: :gfp*gus ， 回收大片段，用Swal和Pstl雙酶切 pMD18-T::p35S-fps-nos，回收fps基因的表達盒。將fps基因的表達盒與 pCAMBIA2300::gfp*gUS大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，提取質粒做 PCR檢測和酶切驗證。
5. 植物雙元表達載體pCAMBIA2300:: gfp*gus-fps-hmgr的構建 以所述的pMD18-T: :p35S-hragr-nos為基礎，將含有hmgr基因的表達盒插
入植物雙元表達載體pC眉BIA2300:: gfp*gus_fps中，構建成植物雙元表達載體 pCAMBIA2300::gfp*gus-fps-hmgr 。具體操作如下用Smal和Pstl雙酶切 pCAMBIA2300: :gfp*gus-fps ， 回收大片段，用Swal和Pstl雙酶切 pMD18-T::p35S-hmgr-nos，回收hmgr基因的表達盒。將hmgr基因的表達盒與 PCAMBIA2300::gfp*gus-fps大片段連接，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，提取質
粒做PCR檢測和酶切驗證。
本實施例將青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因hmgr和fps可操作性地連接于 表達調控序列，形成含hmgr和fps基因的植物表達載體，該表達載體可用于通 過代謝工程策略來提高青蒿中青蒿素的含量。
實施例3
根癌農桿菌介導hmgr和fps基因遺傳轉化青蒿獲得轉基因青蒿植株
1. 含hmgr和fps基因雙元植物表達載體根癌農桿菌工程菌的獲得 將實施例2中含hmgr和fps基因的植物雙元表達載體轉入根癌農桿菌(如
EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌 株編號為Gambar 1)，并進行PCR驗證。結果表明，含hmgr和fps基因植物雙 元表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株。
2. 根癌農桿菌介導hmgr和fps基因轉化青蒿 2.1.外植體的預培養(yǎng)
青蒿種子用75%乙醇浸泡1 min，再用20% NaC10浸泡20 min，無菌水沖洗 3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS (Murashige and Skoog， 1962)固體培養(yǎng)基中，25°C、 16h/8h (light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無 菌苗。待苗長至5 cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。 2.2.農桿菌與外植體的共培養(yǎng)
將所述的葉片外植體，轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2 MS + AS 100 Wnol/L)中， 滴加含活化好的所述含hmgr和fps基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌工程菌 的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28'C暗培養(yǎng)3d。以滴加在不帶有目 的基因的根癌農桿菌的1/2 MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。
2.3.抗性再生植株的篩選 ，
將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0. 5 mg/L + NM 0.05 mg/L+ Kan 50 mg/L + Cb 500 mg/L)上于25。C、 16h/8h光照 培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生 長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Cb 125 mg/L)上培養(yǎng)至生根， 從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。
3.轉基因青蒿植株的PCR檢測
根據CaMV 35S的序列設計正向引物，根據hmgr和fps基因的序列分別設 計反向引物對目的基因進行檢測。結果表明，用CaMV 35S正向引物和hmgr反向 引物以及CaMV 35S正向引物和fps反向引物能分別擴增出988 bp和766 bp的 特異DNA片段。而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。
本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化青蒿的含 hmgr和fps基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的根癌農桿菌菌 株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的轉基因青蒿植株。
實施例4
利用HPLC-ELSD測定轉基因青蒿中青蒿素含量
1. HPLC-ELSD條件及系統適用性以及標準溶液的配制
HPLC:采用water alliance 2695系統，色譜柱為C-18反相硅膠柱 (SymmetryShieldTM C18， 5 pm, 250x4.6 mm, Waters),流動相為甲醇水，甲 醇水的體積比為70:30，柱溫3(TC，流速1.0mL/min，進樣量10 ^L，靈敏度 (AUFS=1. 0)，理論塔板數按青蒿素峰計算不低于2000。
ELSD:采用water alliance 2420系統，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40 °C，放大系數(gain)為7，載氣壓力5bar;
z 精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2. 0 mg用1 mL甲醇完全溶解，得到 2 mg/mL青蒿素標準品溶液，保存于-2(TC備用。 '
本發(fā)明中流動相為甲醇(methanol):水，比例為70%:30%時，青蒿素的保 留時間為5.1 min，峰型良好。理論塔板數按青蒿素計算不低于2000。
2. 標準曲線的制作
將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2 pl， 4 6 ial， 8 pl， 10 pl記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X， )ag)進行回歸分 析。通過研究，本發(fā)明中青蒿素在4-20嗎范圍內呈現良好的log-log線性關 系。青蒿素對照品的log-log線性回歸方程為Y=1.28e+000X+4.71e+000， R=0. 9795.46。
3. 樣品的制備和青蒿素含量的測定
青蒿素的提取過程基于VanNieuwerburghetal. (2006)中報道的方法取 少量新鮮的青蒿葉片(1-2 g鮮重)，于50 ml試管中將其浸沒在10 ml氯仿中 搖蕩l分鐘，將浸出液倒入新的試管中使氯仿揮發(fā)完全，取3ml無水乙醇充分 溶解提取物，用于HPLC檢測。同時，氯仿提取后的葉片收集放入60度烘箱進 行烘干，稱重(計算青蒿葉片的干重)；
采用HPLOELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 pl，根據峰面積代入 線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)， 從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。
在本發(fā)明中共轉hmgr和fps基因顯著提高了青蒿中青蒿素含量。共轉hmgr 和fpS基因青蒿中青蒿素的含量最高可達到23.2 mg/g DW，是非轉化普通青蒿 (10 mg/g DW)的2.32倍。
本實施例采用HPLC-ELSD法測定了轉基因青蒿中青蒿素含量，采用共轉化 hmgr和fps基因的代謝工程策略獲得了青蒿素高產的青蒿植株，為規(guī)?；a 青蒿素提供了一種理想方法。本發(fā)明涉及的序列表-〈110〉上海交通大學
〈120〉 hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方法 〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.4
〈210〉 1 〈211〉 1704 〈212〉 薩
〈213〉 青蒿(Artemisia annua) 〈400〉 1
atggatctcc gtcgtaaact accacccaaa ccaccgtcat caacaaccac caaacaaccg 60
ttacaccgct cacattcacc aacaccaatc ccaaaagcct cagacgcatt accattacca 120
ttatacctaa ccaacacctt cttcttcacc ttattcttct cagtcgctta ctatctcctt 180
cacagatggc gcgacaagat ccgttccggc acaccgttgc acgtcgtcac gttaactgaa 240
ttatccgcta ttgttttact cattgcttcc tttatttatt tgttaggttt ctttggtatt 300
gattttgtcc agtcgtttat ttcgcgcgaa aacgaacaat tgaat犯tga tgatcataat 360
gttgttagta ctaataatgt gttgtctgat ag犯ggcttg tttatgatta tggatttgat 420
gtcactggtg ataatgataa tgataatgat gatgatgtga ttgttaagag tgttgttagt 480
ggtgaggtga Bttcgtattc gttagaggcg actttsggtg attgttatag agcagctaag 540
3tscgt卿c gtgcggttga_ gaggattgta_ gggagggagg ttttagggtt agggtttgag 600
ggatttgatt acgagagtat tttagggcag tgttgtgaga tgcctatagg ttatgtgcag 660
gtgccggtgg gggtagcggg gcctttgttg ttg組ggcg gggagtttat ggtgcctatg 720
gcgactax:gg 33gggtgttt ggttgctagt acg犯tagag ggtgte3ggc gstatgtttg 780 tccggtgggg cgacggcgat tttgttgaaa gatgggatga ctagggcgcc tgttgttagg , tttgccactg cggagagggc ttcgcagctg aagttttatt tggaagatgg ggtgaatttt 900 gacacgttga gtgtcgtttt caataaatca agcagatttg ctaggctcca aaatattcaa 960
tgctcaattg ccggaaagaa tctatatatc agatttactt gcagcacggg tgatgcaatg 1020
ggaatgaaca tggtgtcaaa gggtgtccaa aatgtgttgg attttcttca aaatgatttc 1080
ccagacatgg atgtgattgg tatatctgga aatttctgtt cggataaaaa acccgctgca 1140
gttaattgga ttgaggggcg tggaaaatct gttgtgtgcg aggcagtaat cactgaagag 1200
gttgtgagaa aagtgcttaa aaccacagta cctgcacttg tagaacttaa catgcttaag l加O
aaccttactg gttctgctat tgctggttct cttggtggat ttaatgcaca tgctgcaaat 1320
atcgtatctg cagtctttat agccactggt caggatccgg cccaa犯cat tgagagctct 1380
cactgcataa ctatgatgga 3gctgtcaat aatggaaaag atctgcacgt atctgttacc 1440
atgccttcaa tagaggttgg cacagttggai ggagggacac肌ttagc3tc acaatcagca 1500
tgcttgaacc tacttggagt caagggtgcg tgcatagaat caccaggctc aaacgctcaa 1560 ttgctagcaa ggatagttgc tggttcggtg ttggctggtg aattgtcgtt gatgtctgcc
atatcagctg ggcagttggt taaaagccat atgaaataca acagatcaag cagagacatg 1680
tcagcaattg cgtcaaaggt gtga 1704
〈210〉 2 〈211〉 1032 〈212〉 DNA
〈213〉 青蒿(Artemisia annua) 〈400〉 2
atgagtagta ccgatctgaa atccaagttc ttaaaggtgt atgatacact taaatcagag 60
cttattaacg atcccgcctt cgaatttgac gatgattccc gtcaatggat tgaaaagatg 120
cttgactaca acgtacctgg aggaaagctg aaccggggat tatctgttgt cgacagttat 180
C3gctgctta aaggaggaga actgtctgat gacgagattt ttctttcatc tgcccttggt 240
tggtgtattg犯tggcttca agcatacttt cttgtgcttg atgatatcat ggacgagtct 300
catacacgca gagggcaacc ctgttggttt agattaccca aggttggtat gattgctgcg 360
aacgatggaa ttcttcttcg caaccatgtc ccaagaattc ttaagaaaca tttccgagga 420
aagccttact atgtggatct tgtggacctg ttcaacgagg ttg犯ttcca aacagcctct 480
ggtcagatga ttgatttgat cactacactt gttggageiga aagatctctc gaagtattca 540
ttgtctattc accgccgaat tgttcaatac aaaacagctt actactcatt ttaccttcca 600
gttgcctgtg cactccttat gtttgg3gag gatcttgaca agcacgttga agtgaagaac 660
gtgctcgttg aaatgggtec ctattttcaa gttcaggacg attatctaga ctgttttggt 720
gctcccgagg tgattggaaa gattgg犯ct gatattg犯g actttaagtg ctcctggtta 780
gttgtca肌g cattgg犯ct cgccaatgag gELacsaaEiga^犯gtcct3C3 tgagaactot 840
gggaaaaagg accccgcgtc tgttgctaaa gtgaaggaag tataccacac tctcaatctt 900
caggctgtat tcga^gatta cgaggccaca_ agttacaaga agctgatcac Ettcga/ttg犯 960
aatcacccaa gcaaagcagt ccaagcggtg ttgaaatcct tcttgggtaa aatttgcaag 1020
aggcEt3犯gt ag
103權利要求
1.一種hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，從青蒿中克隆hmgr和fps基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將hmgr和fps基因同時導入青蒿并再生出植株，PCR檢測外源目的基因hmgr和fps的整合情況，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。
2. 根據權利要求1所述的hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方 法，其特征是，包括如下具體步驟(1) 采用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因hmgr和fps;(2) 把hmgr和fps基因可操作性地連接于表達調控序列，形成含hmgr和 fps基因的植物表達載體；(3) 將含hmgr和fps基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化 青蒿的含hmgr和fps基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(4) 利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的轉基因青 蒿植株；(5) 對獲得的轉基因青蒿中青蒿素含量進行高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射 檢測器測定，獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。
3. 根據權利要求2所述的hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方 法，其特征是，所述的經PCR檢測的轉基因青蒿植株是指，分別設計合成hmgr 和fps基因的檢測引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性植株即 為轉基因青蒿植株。
4. 根據權利要求2所述的hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方 法，其特征是，所述的高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿植株中青蒿 素含量，.方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為甲醇:水，甲醇:水的體 積比為70:30，柱溫30。C，流速L0mL/min,進樣量10叱，蒸發(fā)光散射檢測器 漂移管溫度4(TC,放大系數為7，載氣壓力5bar。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術領域的hmgr和fps共轉化提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明從青蒿中克隆hmgr和fps基因，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將hmgr和fps基因同時導入青蒿并再生出植株，PCR檢測外源目的基因hmgr和fps的整合情況，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，最高達到非轉化對照植株的2.32倍。
文檔編號C12N15/82GK101182545SQ20071017042
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月15日 優(yōu)先權日2007年11月15日
發(fā)明者唐克軒, 凌 張, 景福遠, 王國豐 申請人:上海交通大學