專利名稱：：一種16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白l1基因的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物工程領域，具體地說，涉及一種人乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白基因，更具體地說，涉及一種16型人乳頭狀瘤病毒(HPV16)主要衣殼蛋白L1基因。
背景技術：
：全球每年有約50萬婦女患宮頸癌(KoutskyLA.etal.EpidemiolRev1988:10:122-163)，其中約27萬因?qū)m頸癌死亡(80%以上在發(fā)展中國家)，宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌。1977年Laverty(LavertyCR.etal.ActaCytol.1977;21:114-117)在電鏡觀察到宮頸癌組織中存在HPV顆粒，1981年，ZurHausen(HzurHausen.etal.GynecolOncol.1981:12:sl24-128)提出HPV可能與宮頸癌發(fā)病有關的假設。此后，這一觀點被越來越多的實驗所證實。宮頸癌發(fā)病與人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染有直接關系，采用靈敏的檢測方法，可以從幾乎100%的宮頸癌患者病變組織中檢測到高危HPV-DNA。雖然，目前已經(jīng)確定的HPV型超過100種，但宮頸癌患者中，約5060。/。是由HPV-16感染引起，HPV-18約占14%，HPV-45占約8%,HPV31占約5%，其余型占23%(WalboomersJM.etal.JPathol1999;189:12-19)。而一個正常婦女一生中宮頸至少感染一種HPV的終生累計概率約為40。/。，因此，開發(fā)一種價格適宜、保護性良好的宮頸癌疫苗，特別是針對HPV-16的疫苗，對于降低婦女宮頸癌發(fā)病和死亡率意義重大。乳頭狀瘤病毒是一種DNA病毒,有兩個后期基因病毒基因組的開放讀碼框架(ORF)，用于編碼病毒衣殼蛋白，分布被命名為L1和L2。其中，Ll蛋白是較大的衣殼蛋白，分子量為55-60kDa，L2蛋白是較小的衣殼蛋白，在病毒殼粒中大多數(shù)L2蛋白在Ll蛋白內(nèi)部，而且Ll的ORF在不同乳頭狀瘤病毒之間是高度保守的，而L2蛋白在不同乳頭狀瘤病毒之間幾乎不保守，因此，在開發(fā)宮頸癌疫苗時，針對衣殼蛋白L1開發(fā)具有更好的針對性。同時，根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，Ll基因是一個好的免疫預防靶。在細菌中表達的L1蛋白或使用疫苗載體的Ll蛋白用于免疫，可保護動物不受病毒感染。在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達乳頭狀瘤病毒Ll基因或使用疫苗載體導致組裝成病毒樣顆粒(VLPs)，該病毒樣顆粒己經(jīng)用于誘導與保護免受病毒侵襲有關的高效價病毒中和抗體應答，因此，開發(fā)針對衣殼蛋白Ll的宮頸癌疫苗是可實現(xiàn)的。3已經(jīng)鑒定Ll和L2基因是好的免疫預防靶。對于棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)系統(tǒng)的研究表明(KirnbauerR.etal.J.Virol.1993;67:6929-6936)，用細菌中表達的Ll和L2蛋白或使用疫苗載體的免疫方法保護動物不受病毒感染。在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達乳頭狀瘤病毒Ll基因中或使用疫苗載體導致組裝成病毒樣顆粒(VLP)，該病毒樣顆粒己經(jīng)用于誘導與保護免受病毒侵襲有關的高效價病毒中和抗體應答。在16型HPV后，HPV18是宮頸癌中發(fā)現(xiàn)的第二種最流行的HPV類型。在從世界各地收集的宮頸癌活檢的5-20%(IkenbergH.etal.Obstet.Gynecol.19卯;76:432-438)中檢測到HPV18,由于HPV18也與更具侵略性生長的癌有關并且在在較溫和的癌前病變(即CINI-II)中很少發(fā)現(xiàn)，開發(fā)抗HPV18感染的疫苗變得尤其必要。最早關于HPV衣殼蛋白裝配成病毒樣顆粒的研究是用痘苗病毒表達系統(tǒng)表達HPV16的LI和L2蛋白(ZhouJeta.，Virology1991Nov;185(1):251.257)。Rose等用桿狀病毒表達系統(tǒng)單獨表達HPVLl蛋白時自動裝配成病毒樣顆粒(VLP)(RoseRCetal.，Jvirol1993，67(4):1936-1944)，WO9420137(RoseRCetal.)專利公開了桿狀病毒表達系統(tǒng)制備Ll蛋白及VLP。Hofmann在釀酒酵母中表達了HPV6aLl和Ll+L2并觀察到了自組裝成的VLP(HofmannKJ，etal.，virology.1995,209(2):506-518.),W09531532(HofinannKJ,etal.)公開了由酵母表達系統(tǒng)制備重組VLP(Ll,Ll+L2)的方法。US5888516(kathrinU.Jansen，etal.)也在釀酒酵母中表達了HPV16L1和Ll+L2并觀察到了自組裝成的VLP.目前，有多家國外公司的HPV疫苗進入臨床實驗階段，其中包括DNA疫苗以及治療性宮頸癌疫苗。其中Merck公司為基于HPVL1病毒樣顆粒的HPV16+18+6+11四價疫苗(商品名Gardasil)已獲FDA批準在美國上市。GlaxoSmithKline公司HPV16+18雙價疫苗(商品名為Cervarix)上市也己進入最后"沖刺"階段。目前尚無利用畢赤酵母表達系統(tǒng)用于表達HPV16L1和18L1用于制備宮頸癌疫苗的報道，本發(fā)明首次應用畢赤酵母系統(tǒng)制備16L1和18L1，并證明能在細胞內(nèi)形成VLP，經(jīng)過發(fā)酵純化，純化的樣品能使小鼠產(chǎn)生較高滴度的抗體，并通過病毒中和模型證明其具備中和活性。以上試驗結(jié)果說明，通過畢赤酵母病毒顆粒技術平臺制備的HPV16L1和18L1能用于生產(chǎn)預防宮頸癌的疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于，提供一種優(yōu)化的16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因，以用于開發(fā)宮頸癌疫苗。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種表達16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因的畢赤酵母表達載體。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種表達16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因的畢赤酵母表達菌株。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種表達16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因的畢赤酵母表達菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第一個目的通過以下方法實現(xiàn)首先，對天然的HPV16L1基因進行改造，對其所有的氨基酸全部采用使用頻率最高的密碼子，設計出一個全新的HPVDNA序列；然后，為了避免翻譯出來的mRNA的GC比例過高，mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響，避開一些常用的酶切位點，對最優(yōu)的密碼子頻率進行修正，例如將天冬酰胺(Asn)最高頻率密碼子AAC修正為AAT;賴氨酸(Lys)最高頻率密碼子AAG修正為AAA;天冬氨酸(Asp)最高頻率密碼子GAT修正為GAC;苯丙氨酸(Phe)最高頻率密碼子TTT修正為TTC;酪氨酸(Tyr)最高頻率密碼子TAC修正為TAT，甘氨酸(Gly)最高頻率密碼子GGT修正為GGA，設計出兩個全新的HPVDNA序列，并合成經(jīng)過修正的全新的HPVDNA序列。本發(fā)明的第二個目的通過以下方法實現(xiàn)將合成的L1基因與畢赤酵母表達載體連接，從而構(gòu)建HPV16L1基因的畢赤酵母表達載體。本發(fā)明的第三個目的通過以下方法實現(xiàn)將獲得的上述畢赤酵母表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌，從而構(gòu)建HPV16L1畢赤酵母表達菌株。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，本發(fā)明提供的HPV16L1蛋白為胞內(nèi)表達蛋白。本發(fā)明提供的16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因是一種優(yōu)化過的LI基因，具有以下優(yōu)點經(jīng)過優(yōu)化的基因更適合在酵母宿主中高效率表達目標蛋白，而且能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求；同時，由于采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，因此成本低，產(chǎn)量高，且產(chǎn)品性質(zhì)更加均一穩(wěn)定。圖1是pPICZ-16Ll載體構(gòu)建示意圖。圖2是HPV16U基因PCR擴增圖。圖3是pPICZ-16Ll載體鑒定圖，其中，泳道1為經(jīng)BstBI+Kpnl雙酶切的pPICZaB;泳道2為BstBI+Kpnl雙酶切的pPICZ-16Ll。圖4是HPV16Ll表達Western-Blot鑒定結(jié)果圖。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoiyPress,1989)中所述的條件進行。本發(fā)明的實施例中DNA延伸和PCR擴增，均釆用購自Stratagene公司的熱啟動Pfo酶。本發(fā)明的實施例中，使用的pUC18質(zhì)粒購自捷瑞公司，pPICZaB質(zhì)粒購自Invi加gen公司。本發(fā)明的實施例中，使用的HPV16L1的VLPs的兔多抗由上海普欣生物技術有限公司制備，MAB885鼠單抗購自CHEMICON公司，HRP標記的羊抗小鼠IgG購自北京鼎國公司。本發(fā)明的實施例中，使用的BALB/c小鼠購自購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司。本發(fā)明的實施例中，純化步驟中使用的清洗緩沖液配方為100mMPBpH7.0,0.15MNaCl;破菌緩沖液200mMMOPS，pH7.0，0.4MNaCl，0.05%Tween-80;實施例l、HPV16的密碼子優(yōu)化的L1基因的設計與合成1.1、HPV16的密碼子優(yōu)化的LI基因的設計本發(fā)明涉及經(jīng)過畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的編碼16型人乳頭狀瘤病毒(HPV16)主要衣殼蛋白LI的DNA分子，通過密碼子最優(yōu)化和對最優(yōu)密碼子頻率進行一定修正獲得三段DNA序列，其序列分別如SEQIDNO:l、2和3所示，具體如下首先，對天然的HPV16L1基因進行改造，對其所有的氨基酸全部采用使用頻率最高的密碼子，設計出一個全新的HPVDNA序列，即SEQIDNO:l。然后，為了避免翻譯出來的mRNA的GC比例過高，mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響，并避開一些常用的酶切位點，對最優(yōu)的密碼子頻率進行一定的修正，例如將天冬酰胺(Asn)最高頻率密碼子AAC修正為AAT，賴氨酸(Lys)最高頻率密碼子AAG修正為AAA,天冬氨酸(Asp)最高頻率密碼子GAT修正為GAC,苯丙氨酸(Phe)最高頻率密碼子TTT修正為TTC，酪氨酸(Tyr)最高頻率密碼子TAC修正為TAT，甘氨酸(Gly)最高頻率密碼子GGT修正為GGA，從而，又設計出兩個全新的HPVDNA序列，其中SEQIDNO:2是SEQIDNO:l序列中修正天冬酰胺(Asn)，賴氨酸(Lys),天冬氨酸(Asp)這三個密碼子所得的DNA序列；SEQIDNO:3是SEQIDNO:l序列中修正苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，甘氨酸(Gly)這三個密碼子所得的DNA序列。1.2、HPV16的密碼子優(yōu)化的L1基因的合成合成如序列SEQIDNO.'l所示的HPV16的密碼子優(yōu)化的Ll基因，其所需的引物組共有引物32個，分別為引物161,162,163.164，165,166,167,168，169.1610,1611.1612，1613,1614.1615,1616，1617,1618.1619,1620,621'1622,1623，1624，1625,1626，1627，1628,1629,1630,1631,1632，上述引物序列分別如SEQIDNO:4-35所示，其中每4條用下劃線相連的引物間形成一個互補群，可通過PCR構(gòu)建寡聚體片段，并進而構(gòu)建密碼子優(yōu)化的HPV16的L1基因。具體構(gòu)建方法如下1.2.1、寡聚體片段構(gòu)建將引物互補對161，162，163和164的在5rC退火延伸IO個循環(huán)，獲得PCR擴增用模板，接著，用相應的兩側(cè)引物161和164進行PCR擴增，將獲得的PCR產(chǎn)物釆用瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收約為200bp的目標片段(片段A)。同時，采用上述相同的方法，分別使用引物互補群165，166，167和168;169，1610，1611和1612;1613，1614，1615和1616;1617，1618，1619和1620;1621，1622，1623和1624:1625，1626，1627和1628;1629，1630，1631和1632，制備獲得相應的寡聚體片段B，C，D，E，F(xiàn)，G和H。1.2.2、全長的密碼子優(yōu)化的HPV16L1基因構(gòu)建分別將4個形成互補寡聚群的寡聚體(片段A，片段B,片段C和片段D;片段E，片段F,片段G和片段H)在5rC退火延伸IO個循環(huán)，獲得PCR擴增用模板，而后用相應的兩側(cè)引物(前一片段用引物161和1616，后一片段用引物1617和1632)進行PCR擴增，將獲得的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，膠回收目標片段，獲得2個大小約為750bp的DNA片段，分別命名為片段I，片段J。再將上步獲得的片段I和片段J在5rC退火延伸IO個循環(huán)，獲得PCR擴增用模板，然后用引物al和a2作為引物，進行PCR擴增，引物al和a2序列如下所示al:5，-ATAGAATTCATGTCTTTGTGGTTGCCATC-3，；a2:5，-ATAGGTACCCTATTACAACTTTCTCTTCTTT陽3'。將獲得的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，膠回收目標片段，獲得大小約為1.5kbp的片段，并將該片段測序，該片段的序列測序結(jié)果如SEQIDNO:1所示，根據(jù)測序結(jié)果顯示該片段即是全長的密碼子優(yōu)化的HPV16L1基因。獲得的HPV16L1基因兩端以EcoRI和Kpnl酶切位點裝入pUC18質(zhì)粒(捷瑞公司)中，命名為pUC-16Ll，并經(jīng)測序驗證為正確。按照類似的方法獲得SEQIDNO:2和3所示的HPV16的密碼子優(yōu)化的Ll基因。為驗證優(yōu)化序列的可行性，下面以實施例1制備獲得的HPV16L1基因優(yōu)化序列中的一個(SEQIDNO:l)為例，構(gòu)建表達質(zhì)粒并驗證其表達。實施例2、HPV16L1基因的表達載體構(gòu)建將SEQIDNO:l的優(yōu)化序列克隆到畢赤酵母表達載體中，構(gòu)建方法如圖1所示，具體步驟如下2.1、合成擴增HPV16L1所需的正向引物和反向引物，序列如下所示正向引物5，-ACTAATTATTCGAAACGATGTCTTTGTGG-3，；反向引物5，-AGCGGTACCCTATTACAACTTTCTCTTCTTTC-3，。其中，正向引物包括一個BstBI限制性內(nèi)切酶位點；反向引物包括位于終止密碼子側(cè)翼的Kpnl限制性內(nèi)切酶位點，所述酶切位點分別如引物序列中的下劃線所示。2.2、用上述引物對為引物，以實施例1獲得的pUC-16Ll為模板，進行PCR擴增，將擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，證明獲得了全長密碼子優(yōu)化的HPV16Ll基因；將擴增獲得的PCR片段，經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶BstBI和KpnI雙酶切消化，再與BstBI/Kpnl雙酶切消化的pPICZaB(Invitrogen公司)連接。再用連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株ToplO(捷瑞公司)的感受態(tài)細胞，鋪板于含25pg/ml零霉素的LB瓊脂上。由于pPICZaB載體上攜帶有零霉素抗性基因，因此轉(zhuǎn)化細胞能夠在含零霉素的LB培養(yǎng)基上生長。分離已轉(zhuǎn)化細胞的單菌落，制備質(zhì)粒DNA，并經(jīng)限制性圖譜(結(jié)果如圖3所示)和核苷酸序列分析檢測HPV16L1基因和載體序列，鑒別出包含HPV16L1基因的正確構(gòu)建體，命名為pPICZ-16Ll，由于構(gòu)建的質(zhì)粒的分泌信號(a-factorsignal)已經(jīng)被切去，因此，表達的HPV16L1蛋白應該是胞內(nèi)表達蛋白。實施例3、HPV16L1畢赤酵母表達菌株的構(gòu)建和表達3.1、HPV16L1畢赤酵母表達菌株的構(gòu)建用SacI限制性內(nèi)切酶單酶切pPICZ-16Ll質(zhì)粒使其線性化，對空質(zhì)粒pPICZaB進行同樣的酶切作為陰性對照。酶切反應液加入無水乙醇，獲得DNA沉淀，用少量雙蒸水溶解線性化的pPICZ-16Ll片段，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌X-33(Invitrogen公司)，電轉(zhuǎn)化條件為8DNA片段5微克，電壓1500伏，電阻25歐姆，電擊時間為5毫秒。電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪板于含200ng/ml零霉素(Zeocin)的YPDS瓊脂上，由于pPICZaB載體上攜帶有零霉素抗性基因，因此轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠在含零霉素的YPDS瓊脂上生長。分離已轉(zhuǎn)化細胞的單菌落，即為HPV16L1的畢赤酵母表達菌株。3.2、HPV16L1畢赤酵母表達菌株的表達將獲得的HPV16L1畢赤酵母表達菌株接種至含1000pg/ml、1500嗎/ml零霉素抗性平板上。高濃度抗性平板上獲得的克隆，分別用4mlYPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，24hr后換成BMMY培養(yǎng)基誘導基因表達，表達48hr后離心收獲菌體。取一部分菌體破菌處理，破菌上清用West-Blotting鑒定，結(jié)果如圖4所示，根據(jù)該圖結(jié)果，破菌上清中有HPV16L1蛋白表達。雖然在本發(fā)明的實施例2和3中，使用的是SEQIDN0:1序列進行克隆和表達，但對于本領域的技術人員來說，使用SEQIDNO:2和3序列進行克隆和表達，以獲得相似的結(jié)果是顯而易見的，因此，屬于本發(fā)明的保護范圍；而且，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，對于本領域的技術人員來說，構(gòu)建相似的序列并利用該構(gòu)建的序列，使用畢赤酵母進行克隆和表達以獲得相似甚至更優(yōu)的結(jié)果，也是顯而易見的，因此，也屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例4、HPV16L1蛋白檢測以純化的HPV16L1的VLPs做標準蛋白濃度曲線，以誘導前菌體做陰性對照，采用ELISA夾心法檢測HPV16L1基因在畢赤酵母中發(fā)酵表達量，具體步驟如下用包被液2000倍稀釋HPV16Ll的VLPs的兔多抗，向酶標板的凹孔中各加入O.lmL稀釋后的兔多抗，于4'C過夜后，移去包被液，并用0.3mLPBST洗滌凹孑L，然后用0.3mL封閉液于37'C保溫2小時，進行封閉。用稀釋液以對倍稀釋的方式，將純化的HPV16Ll的VLPs從濃度2pg/mL梯度稀釋到0.0625ng/mL，同時將獲得的發(fā)酵菌體的破菌上清稀釋200倍，然后分別向凹孔中加入O.lmL梯度稀釋后的不同濃度的HPV16Ll的VLPs溶液或稀釋后的破菌上清，于37'C保溫1小時后，移去抗原液，并用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；然后用稀釋緩沖液將MAB885鼠單抗(購自CHEMICON公司)1000倍稀釋后加入到凹孔中，每孔各0.1mL，37-C保溫l小時后，移去單抗溶液后，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；再向凹孔中加入用稀釋緩沖液5000倍稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG各0.1mL，在37。C保溫0.5小時后，移去酶標液，并用0.3mL洗滌液洗滌凹孔后，向凹孔中各加入0.1mLDAB顯色液，室溫下作用20分鐘后，向每個凹孔中加入0.05mL2MH2S04終止液以終止反應，并用酶標比色儀測定OD45o值。利用梯度稀釋的HPV16L1的VLPs的OD45o的檢測結(jié)果，制作標準蛋白濃度曲線，再通過標準蛋白濃度曲線換算獲得HPV16Ll蛋白的發(fā)酵表達量，結(jié)果如表l所示，其中用已測定濃度的純化目的蛋白原液稀釋一系列濃度，例如2[tg/mL，1pg/mL，0.5昭/mL，0.25ng/mL,0.125pg/mL,作為標準濃度，通過ELISA檢測，用濃度做縱坐標，對應OD450檢測值做橫坐標，建立標準線性回歸方程。發(fā)酵破菌液上清稀釋一系列倍數(shù)，例如50，100，200，400倍。測出的OD450值通過標準線性回歸方程求得對應濃度(單位為^g/mL)，再乘以稀釋倍數(shù)即為發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(單位為[xg/mL)。由于破菌液是由菌泥濕重破菌緩沖液=1:5配制的，所以發(fā)酵菌泥的目的蛋白表達量(單位為pg/g菌泥)為5X發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(單位為pg/mL)。再乘以發(fā)酵液菌體密度(單位為g菌泥/L發(fā)酵液)，則為發(fā)酵目的蛋白表達量濃度(單位為^g/L發(fā)酵液)。發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(tig/mL)二稀釋倍數(shù)X標準目的蛋白濃度(嗎/mL)XOD45Q(發(fā)酵破菌液上清)/OD45q(標準目的蛋白濃度)；發(fā)酵目的蛋白表達量濃度(pg/L發(fā)酵液)-5X發(fā)酵破菌液上清目的蛋白濃度(ng/mL)X發(fā)酵液菌體密度(g菌泥/L發(fā)酵液)。表l、VLPs發(fā)酵表達結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表1的結(jié)果可見，本發(fā)明的HPV16L1蛋白基因的爐序列，不僅能夠在畢赤酵母中表達HPV16L1蛋白，而且表達量較高，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。實施例5、HPV16L1蛋白純化將實施例3中制備的菌體破菌離心后，取破菌上清經(jīng)過層析方法純化，得到自組裝成病毒樣顆粒的L1蛋白，具體步驟如下-將表達HPV16L1VLP的畢赤酵母細胞，按l:3加入清洗緩沖液混合，充分混勻，于8000rpm，離心5min，收集細胞，重復以上操作二遍。將清洗后的細胞按l:5加入破菌緩沖液混合，充分混勻后，高壓破碎以上細胞懸液，并重復操作，使90%的細胞破碎。將高壓破碎的破菌液，于9000rpm，30min，l(TC離心分離，收集離心上清。將經(jīng)過離心澄清的破菌上清通過POROS50HS(AppliedBiosystems公司)層析柱進行初純，洗脫方式為100。/o緩沖液A(0.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0,0.05%Tween-80)至1(K)o/o的緩沖液B(1.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0,0.05%Tween-80)的線性梯度洗脫，收集洗脫組分，并采用SDS-PAGE，Western-blot檢測。將含有HPV16L1蛋白的洗脫組分合并后，使用CHT(BIO-RADTypeII)層析柱精純，洗脫方式為100%緩沖液A(20mMPB，0.6畫aCl，50mMMOPSpH76.5,0.05°/。Tween-80)至100。/o的緩沖液B(200mMPB，0.6MNaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的線性梯度洗脫。收集洗脫組分，并采用SDS-PAGE，Western-blot檢測，將含有HPV16L1VLP的組分合并，即為最后的純化樣品。采用毛細管電泳純度方法檢測Ll蛋白純度，結(jié)果顯示純化的病毒樣顆粒純度大于90%。實施例6、HPV16L1疫苗制備參考《中華人民共和國藥典》(2005年版)中的方法，將實施例5中純化獲得的Ll蛋白，吸附鋁佐劑，制備獲得具有免疫原性的HPV16L1疫苗。實施例7、HPV16L1基因表達產(chǎn)物免疫原性的測定選取68周齡的SPF級BALB/c小鼠，分為4組，每組6只小鼠。第1組小鼠用O.lmL含有鋁佐劑的緩沖液(0.32M氯化鈉,0.35mM硼酸鈉，0.01%吐溫-80,O.OIM組氨酸，pH6.5)進行免疫(作為陰性對照組)，其它3組分別用O.lmL濃度為5pg/mL、0.5pg/mL、0.05pg/mL的吸附鋁佐劑的VLP(作為檢測組)，分別于第0、7、21天皮下注射免疫，共免疫三次，第三次免疫后兩周采血。將采集得到的血液于37t放置2h后，4000g離心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20。C存放，并檢測鼠血清的轉(zhuǎn)陽率和滴度，具體方法如下7.1、血清轉(zhuǎn)陽率的檢測用包被液稀釋純化的畢赤酵母表達的HPV16L1至lpg/mL，向酶標板每個凹孔中各加0.1mL，4'C過夜。移去包被液，用0.3mLPBST洗滌凹孔。用0.3mL封閉液(5%脫脂奶粉+PBST)于37"C保溫2小時。每凹孔加入用稀釋緩沖液(2。/。脫脂奶粉+PBST)以l:400稀釋的被檢血清(免疫過HPV16L1和鋁佐劑的鼠血清和只免疫鋁佐劑的鼠血清)各O.lmL，于37。C保溫l小時后移去血清液，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔。然后向每凹孔加入用稀釋緩沖液以l:5000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG各O.lmL，37'C保溫0.5小時后移去酶標液，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔；然后向凹孔中加入O.lmLDAB顯色液，室溫避光作用20分鐘后加2MH2S040.05mL終止液終止反應，并用酶標比色儀測定OD450值，OD45。值如表2所示。表2、OD45Q讀數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>Cutoff值為陰性對照被檢血清(免疫鋁佐劑的鼠血清)抗體的OD45o值的平均值加上3倍標準差，OD45o值大于Cutoff值的小鼠判定為陽性，OD柳值小于Cutoff值的小鼠判定為陰性。三個檢測組的轉(zhuǎn)陽率結(jié)果如表3所示。表3、轉(zhuǎn)陽率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>7.2、血清滴度的測定用包被液稀釋純化的HPV16Ll至lpg/mL，取0.1mL加于酶標板的各凹孔中，4'C過夜；移去包被液，用0.3mLPBST洗滌上述凹孔，再用0.3mL封閉液(5X脫脂奶粉+PBST)于37°C,保溫封閉2小時。將被檢血清(免疫過HPV16Ll的鼠血清)用稀釋緩沖液(2%脫脂奶粉+PBST)采用對倍稀釋方式，從l:500稀釋度一直稀釋到1:32000，陰性對照被檢血清(免疫鋁佐劑的鼠血清)以l:10000稀釋，每個凹孔分別加入0.1mL稀釋后血清(被檢血清或陰性對照血清)，37。C保溫l小時。移去血清液，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔。每個凹孔加入用稀釋緩沖液以l:5000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgGO.lmL，37C保溫0.5小時。移去酶標液后，用0.3mL洗滌液洗滌凹孔，并向凹孔中加入O.lmLDAB顯色液，于室溫作用20分鐘后，加入2MH2SO40.05mL終止液終止反應。用酶標比色儀測定00450值。采用終點滴度法計算血清的滴度值，其結(jié)果如表4所示。表4、滴度測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明提供的16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白Ll基因是一種優(yōu)化過的Ll基因，具有以下優(yōu)點經(jīng)過優(yōu)化的基因更適合在酵母宿主中高效率表達目標蛋白，而且能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求；同時，本發(fā)明提供的16型人乳頭狀瘤病毒疫苗，能夠自組裝形成VLPs結(jié)構(gòu)，純化的VLPs吸附佐劑后，通過血清轉(zhuǎn)陽率和血清滴度的測定，說明該疫苗能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強的免疫原性，而且由于采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，因此該方法具有以下優(yōu)點成本低，產(chǎn)量高，產(chǎn)品性質(zhì)更加均一穩(wěn)定。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>gttgacactggttttggtgctatggactttactactttgcaagctaataaatctgaagtt660ccattggacatttgtacttctatttgtaaatacccagactacattaaaatggtttctgaa720ccateicggtgactctttgtttttttacttgagaagagaacaaatgtttgttagacatttg780tttaatagagctggtgctgttggtg犯aatgttccagacgacttgtacatta^aggttct840ggttctactgctaatttggcttcttctaattactttccaactccatctggttctatggtt900eicttctgacgctca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多種天冬酰胺最高頻率密碼子AAC修正為AAT;賴氨酸最高頻率密碼子AAG修正為AAA;天冬氨酸最高頻率密碼子GAT修正為GAC;苯丙氨酸最高頻率密碼子TTT修正為TTC;酪氨酸最高頻率密碼子TAC修正為TAT;甘氨酸最高頻率密碼子GGT修正為GGAo3、如權(quán)利要求1或2所述的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQIDNO:l、2或3所示。4、一種畢赤酵母表達載體，其特征在于，所述表達載體具有權(quán)利要求1一3中任一項所述基因的序列。5、如權(quán)利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述畢赤酵母表達載體為pPICZaB。6、一種表達權(quán)利要求l一3中任一項所述基因編碼的HPV16L1蛋白畢赤酵母表達菌株。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特祉在于，所述HPV16L1S閃農(nóng)達的HPV16L1蛋A為胞內(nèi)農(nóng)達。8、如權(quán)利要求6所述的表達菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟A、設計并合成密碼子優(yōu)化的HPV16的L1基因；B、構(gòu)建HPV16L1基因的畢赤酵母表達載體；C、構(gòu)建HPV16L1畢赤酵母表達菌株。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述表達載體具有權(quán)利要求1一3中任一項所述基因序列。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述畢赤酵母表達載體為pPICZaB。11、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述表達菌株的構(gòu)建包括將構(gòu)建好的畢赤酵母表達載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母表達菌株的步驟。全文摘要本發(fā)明提供了一種16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因以及表達該基因的畢赤酵母表達菌株。本發(fā)明提供的L1蛋白的基因序列為畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化，并對最優(yōu)的密碼子頻率進行一定的修正的表達L1蛋白的基因序列。本發(fā)明提供的16型人乳頭狀瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因是一種優(yōu)化過的L1基因，具有以下優(yōu)點經(jīng)過優(yōu)化的基因更適合在酵母宿主中高效率表達目標蛋白，而且能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求；同時，由于采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，因此成本低，產(chǎn)量高，且產(chǎn)品性質(zhì)更加均一穩(wěn)定。文檔編號C12N15/34GK101440371SQ20071017093公開日2009年5月27日申請日期2007年11月23日優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日發(fā)明者克吳,張千里,張高峽,瓊沈,袁靖宇,雷建強,健魏申請人:上?；萆锕こ逃邢薰?