專利名稱：奶牛胚胎性別鑒定的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)奶牛胚胎性別的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
自從1985年美國(guó)Cetus公司和加利福利亞大學(xué)聯(lián)合創(chuàng)建的聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction,簡(jiǎn)稱PCR)問世以來，這一在模板DNA、引物、 脫氧核糖核苷三磷酸以及DNA聚合酶存在下進(jìn)行的體外酶促擴(kuò)增DNA的技 術(shù)立即引起了廣泛的興趣和重視，在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用和發(fā)展，迅速進(jìn) 入分子生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、以及遺傳病和傳染性病原體的核酸檢測(cè)等各 個(gè)領(lǐng)域。目前，在核酸檢測(cè)領(lǐng)域傳統(tǒng)的"PCR+電泳"或"PCR+探針雜交"檢 測(cè)方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是該傳統(tǒng)方法由于實(shí)際應(yīng)用中易引起的非特異性擴(kuò) 增、實(shí)驗(yàn)中易受外源核酸的污染而造成結(jié)果假陽(yáng)性現(xiàn)象、同時(shí)操作比較繁冗， 使得該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用尤其是臨床檢測(cè)受到很大限制。
實(shí)時(shí)熒光PCR是1996年美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的新 技術(shù)，在核酸檢測(cè)中和傳統(tǒng)PCR電泳檢測(cè)方法比較具有許多優(yōu)點(diǎn)(1)其采 用的閉管檢測(cè)在臨床診斷中的優(yōu)勢(shì)尤其明顯，消除了傳統(tǒng)PCR電泳技術(shù)擴(kuò)增 產(chǎn)物的污染問題，提高了檢測(cè)準(zhǔn)備度；(2) PCR體系中增加了熒光探針，提高 了檢測(cè)的特異性和靈敏度；(3)定量范圍極寬，樣本無需做梯度稀釋，可以進(jìn) 行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)；(4)操作迅速，無需傳統(tǒng)PCR的后處理檢測(cè)步驟，自動(dòng) 化程度高。目前實(shí)時(shí)熒光PCR已在各種疾病病原體的基因檢測(cè)及基因遺傳突 變分析等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。
基于TaqMan水解熒光探針的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)利用了 Taq酶的5'外切酶活性，合成一個(gè)能與PCR產(chǎn)物雜交的探針，該探針的5'端標(biāo)記一個(gè)熒光分
子，3'端標(biāo)記另一個(gè)熒光分子。其中3'端熒光分子能夠吸收5'端熒光分子發(fā)出 的熒光，因此正常情況下該探針檢測(cè)不到的5'端熒光分子發(fā)出的熒光，只能檢 測(cè)到3'端熒光分子的熒光信號(hào)，但當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物(模板)時(shí)，該探針 與模板結(jié)合，激活Taq酶的5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針 上切割下來，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。 因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。
懷孕奶牛中胎牛性別以及待移植胚胎性別鑒定一直是動(dòng)物繁殖和良種培 育過程中需要關(guān)注的問題，蘊(yùn)含著巨大的經(jīng)濟(jì)利益。位于奶?；蚪MY染色體 上的特異性公牛性別決定基因(S7)的發(fā)現(xiàn)使得奶牛的性別控制和胚胎性別鑒 定技術(shù)發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)新的階段。最近10年來發(fā)展的利用wy基因和PCR技 術(shù)對(duì)奶牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定是一種有效的方法，其中有的己經(jīng)申請(qǐng)國(guó)內(nèi)專 利(申請(qǐng)?zhí)?00410014222.5)并制成檢測(cè)試劑盒。其主要操作步驟是從待檢 測(cè)胚胎取部分卵裂球用以提取DNA，再用so;基因的片段作引物，以所取的胚 胎細(xì)胞DNA為模板進(jìn)行PCR或巢式PCR擴(kuò)增，最后用矽特異探針對(duì)擴(kuò)增的 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。雄性胚胎顯示呈陽(yáng)性，雌性胚胎為陰性。也可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 電泳，根據(jù)^y擴(kuò)增條帶的有無判斷胚胎為雄、雌性。隨著這項(xiàng)技術(shù)的深入研 究和進(jìn)展，目前只需幾個(gè)卵裂球即可完成檢測(cè)的取樣，減少了對(duì)胚胎的傷害。 經(jīng)鑒定的胚胎，移植后產(chǎn)犢性別的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。
但是，上述性別鑒定技術(shù)及試劑盒存在的主要問題是對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作 人員技術(shù)水平要求較高，否則會(huì)有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)、降低檢測(cè)準(zhǔn)確率；其次， 試劑盒操作繁瑣，所需時(shí)間較長(zhǎng)；最后，試劑盒只能對(duì)待移植的胚胎細(xì)胞進(jìn)行 鑒定，不能應(yīng)用于懷孕奶牛中的胎牛性別鑒定。由于上述存在的局限性，目前尚不適于作為成熟技術(shù)推廣使用。有鑒于此，本發(fā)明提供了一種更方便、更準(zhǔn) 確的方法和試劑盒用于奶牛胚胎和胎牛性別鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行奶牛胚胎性別鑒定 的方法和試劑盒，以及所需的引物和探針，從而可以方便快速準(zhǔn)確地對(duì)懷孕奶 牛中的胎牛性別、移植胚胎性別進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容如下
1. 實(shí)時(shí)熒光PCR引物探針的設(shè)計(jì)與合成
通過對(duì)GenBank中奶牛w少基因序列査詢，用美國(guó)Invitrogen公司Vector NTI軟件對(duì)各種來源的奶牛w少基因序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其序列高度保守并 具有很好的同源性，按照TaqMan熒光PCR設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)了一對(duì)奶牛特異 性引物擴(kuò)增"基因上的182 bp的區(qū)域，并用特異性TaqMan水解探針法實(shí)時(shí) 檢測(cè)。引物和探針堿基序列如下
上游弓I物為5 ， ACg CCT TCA TTg TgT ggT 3'
下游引物為5， Cgg gTA TTT gTC TCg gTg TA 3 ，
探針為5 ， FAM-CTA gTA gTC TCT gTg CCT CCT CAA-TAMRA 3'，其中探 針5'端標(biāo)記FAM (6-羧基熒光素)，3'端標(biāo)記TAMRA (四甲基-6-羧基羅丹明)。
上述引物探針由商業(yè)序列合成公司(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 等)合成后用無菌雙蒸水溶解至濃度為25)imol/L， 一2(TC保存。
2. 試劑盒主要成分
含有上述引物和探針的熒光PCR試劑盒(20 Test),其主要成分如下
(1) 核酸濃縮液1.5mlX10管，主要成分為13%PEG8000、 1.6 mol/LNaCl。
(2) 核酸提取液1.5 mix 1管，主要成分為50 mmol/LNaOH、 5 mMEDTA、1% Triton X-100 、 1 % NP-40 。
(3) PCR反應(yīng)緩沖液0.5 ml,主要成分有20 mmol/1 Tris-HCl pH8.3(25°C)、 100 mmol/L KC1, 70 mmol/L MgCl2、 0.04Q/o(W/V)明膠、0.4 mM脫氧核糖核 苷三磷酸dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、0.4 nmol/L引物、0.2 pmol/L探針。
(4) Taq酶50pl，含Taq DNA聚合酶50 U，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶) 12 U。
(5) 陰性對(duì)照300 ^1，為無菌雙蒸水。
(6) 陽(yáng)性對(duì)照300 ^1，為公牛全血白細(xì)胞中提取的DNA溶液，采用上海生工 全血DNA提取試劑盒進(jìn)行。
3.樣本的處理和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)
上述試劑盒在性別鑒定過程中的使用步驟為
(1) 樣本處理
取懷孕12周以上奶牛血漿750 |il，加入相同體積核酸濃縮液，旋渦振蕩 混勻，8000r/min離心6min棄上清，加入50 |il核酸提取液，旋渦振蕩混勻后 IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模板檢測(cè)。
如果是胚胎移植性別鑒定，可取1 2個(gè)細(xì)胞直接加入25 (il核酸提取液， 旋渦振蕩混勻后IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模
(2) 擴(kuò)增檢測(cè)
按照待檢測(cè)樣品數(shù)n+3，取PCR反應(yīng)緩沖液15X (n+3)、Taq酶2X (n+3) 組分，混勻后每個(gè)擴(kuò)增管分裝17 pl，分別加入試劑盒陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及上述處理好的n個(gè)樣品模板各13pl。每個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增管體積為30 ^，將上述 擴(kuò)增管放到實(shí)時(shí)熒光PCR儀器上按照50。C 2min、 94°C 2 min后94°C 5 sec、 60°C 30sec循環(huán)40次的程序運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)束后陰性對(duì)照為陰性、陽(yáng)性對(duì)照為 陽(yáng)性，樣本擴(kuò)增為陽(yáng)性者為雄性，否則為雌性。 4.有益效果
本發(fā)明利用所設(shè)計(jì)的特異性引物探針，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件研制 成實(shí)時(shí)熒光PCR奶牛性別鑒定試劑盒，和目前現(xiàn)有的奶牛胚胎性別鑒定技術(shù) 專利比較，其主要特點(diǎn)如下
(1) 采用基于TaqMan水解探針的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，和傳統(tǒng)PCR方法比 較其靈敏度更高，并且操作簡(jiǎn)便快速；
(2) 采用奶牛性別決定基因特異性引物和探針，避免人和其它動(dòng)物來源核酸 污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性；
(3) 試劑盒閉管檢測(cè)，以及擴(kuò)增體系中的dUTP—UNG酶系統(tǒng)更進(jìn)一步避 免了因擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的結(jié)果假陽(yáng)性。
本發(fā)明試劑盒根據(jù)不同的樣本采用不同的處理方法，通過對(duì)熒光PCR擴(kuò) 增信號(hào)的分析來判斷奶牛Y染色體特異性片段的存在，試劑盒操作簡(jiǎn)便快速(1 小時(shí)以內(nèi))，同時(shí)擴(kuò)增體系中的dUTP—UNG酶(脫氧尿嘧啶核苷酸一尿嘧瞎 DNA糖基化酶)系統(tǒng)更進(jìn)一步避免了因擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的結(jié)果假陽(yáng)性，準(zhǔn) 確率達(dá)到100%，可以廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和科研實(shí)踐中懷孕奶牛中胎牛性別、移 植胚胎性別以及科研中奶牛基因的快速鑒定，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中對(duì)加快品種 改良速度、有效降低生產(chǎn)成本、提高牧場(chǎng)和養(yǎng)殖者的收益和經(jīng)營(yíng)效益將發(fā)揮重 要的作用。本發(fā)明中所涉及的主要試劑說明
TaqDNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs (dATP、 dUTP、 dCTP、 dGTP)均為上海宏誼公司生產(chǎn)，全血DNA提取試劑盒以及其它化學(xué) 試劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
具體實(shí)施例方式
下面詳細(xì)介紹本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例 僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明 講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過技術(shù)常識(shí)對(duì)本發(fā)明作各種技術(shù)性改 動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例l:懷孕奶牛中胎牛性別的鑒定
(1) 樣品處理
用真空采血管(含EDTA抗凝劑)采集10頭懷孕12周以上奶牛的全血， 于10000 r/min離心6 min后分別吸取血漿750 pl，置于1.5 ml離心管中，10 個(gè)樣本共10管，往管中分別加入相同體積核酸濃縮液，旋渦振蕩混勻，8000 r/min離心6 min棄上清，加入50核酸提取液，旋渦振蕩混勻后IO(TC保持 10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模板檢測(cè)。
(2) 擴(kuò)增檢測(cè)
按照待檢測(cè)樣品數(shù)10+3，取PCR反應(yīng)緩沖液15X (10+3)、 Taq酶2X (10+3)組分，混勻后每個(gè)擴(kuò)增管分裝17 ^d，分別加入試劑盒陰性對(duì)照、陽(yáng) 性對(duì)照以及上述處理好的IO個(gè)樣品模板各13 pl。每個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增管體積為30 ^， 將上述擴(kuò)增管放到ROTORGENE實(shí)時(shí)熒光PCR儀器(澳大利亞Corbett Research公司)上按照50°C 2 min、 94°C 2 min后94°C 5 sec、 60°C 30 sec循環(huán)40次的程序運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)束后按照儀器軟件自動(dòng)設(shè)定閾值，陰性對(duì)照為陰 性、陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，而10個(gè)樣本中3個(gè)擴(kuò)增陽(yáng)性、7個(gè)陰性，表明10頭奶
牛中3頭孕雄胎牛、7頭孕雌胎牛。最后經(jīng)和分娩結(jié)果比較，胎牛的性別和熒 光PCR鑒定結(jié)果全部符合。
實(shí)施例2:奶牛胚胎移植中胚胎性別的鑒定
(1) 樣本處理
取5個(gè)處于桑葚胚期的奶牛胚胎，應(yīng)用顯微操作技術(shù)各吸取1 2個(gè)胚胎 細(xì)胞，直接加入25 pl核酸提取液，旋渦振蕩混勻后IO(TC保持10 min， 8000r/min 離心6min取上清作為PCR模板檢測(cè)。
(2) 擴(kuò)增檢測(cè)
按照待檢測(cè)樣品數(shù)5+3，取PCR反應(yīng)緩沖液15X (5+3)、Taq酶2X (5+3) 組分，混勻后每個(gè)擴(kuò)增管分裝17 pl，分別加入試劑盒陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以 及上述處理好的n個(gè)樣品模板各13 ^。每個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增管體積為30 W，將上述 擴(kuò)增管放到ABI 7000實(shí)時(shí)熒光PCR儀器(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上按照50 °C 2min、 94°C 2min后93。C 15 sec、 60°C 45 sec循環(huán)40次的程序運(yùn)行。運(yùn) 行結(jié)束后按照儀器軟件自動(dòng)設(shè)置基線和閾值，陰性對(duì)照為陰性、陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng) 性，而5個(gè)胚胎樣本中2個(gè)擴(kuò)增為陽(yáng)性、3個(gè)陰性，表明2個(gè)胚胎為雄性奶牛 胚胎、3個(gè)為雌性奶牛胚胎。將這5個(gè)奶牛胚胎移植到受體母牛中，妊娠分娩 后胎牛的性別和熒光PCR鑒定結(jié)果完全相符。
10核苷酸序列表 SEQUENCE LISTING
〈110〉上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司 上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司 吳大治，夏懿
〈120〉奶牛胚胎性別鑒定的方法和試劑盒
<130〉 bovine sexing
〈藩 CN
〈141〉 2007-11-11
〈160〉 3
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 18
〈212〉 DNA
<213〉 Bos taurus
〈220〉
〈221〉 Sry PRM1 <222〉 (1)..(18)
〈400〉 1
acgccttcat tgtgtggt 18
<210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA
<213〉 Bos taurus
<220〉
<221〉 Sry P脂2 <222> (l)..咖
〈400> 2
cgggtatttg tctcggtgta 20
11〈210> 3
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Bos taurus
〈220〉
〈221〉 Sry Probe
〈222〉 (1)..(26)
〈223〉 n=FAM,y:TAMRA
〈220〉
〈221〉 misc_feature
〈222> (1).. (1)
〈223> n is a, c, g, or t
<400〉 3
nctagtagtc tctgtgcctc ctcaay 2權(quán)利要求
1. 一種實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)奶牛性別決定基因(sry)上182bp區(qū)域的方法，堿基序列如下上游引物為5’ACg CCT TCA TTg TgT ggT 3’下游引物為5’Cgg gTA TTT gTC TCg gTg TA 3’探針為5’FAM-CTA gTA gTC TCT gTg CCT CCT CAA-TAMRA 3’(5’標(biāo)記FAM，3’標(biāo)記TAMRA)。
2. —種濃縮并提取血漿或血清中游離DNA的方法和溶液，濃縮液的主要成分 為聚乙二醇8000和NaCl，其濃度分別為10 15%和1.5 2.0 mol/L。
3. 如權(quán)利要求1和2所述方法和引物探針建立的試劑盒，其組分為核酸濃縮 液、核酸提取液、PCR反應(yīng)緩沖液、Taq酶、空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。
4. 如權(quán)利要求l所述試劑盒在奶牛胚胎性病鑒定中的應(yīng)用，包括以下步驟(1) 樣品處理取懷孕12周以上奶牛血漿750 ^il，加入相同體積核酸濃縮液，旋渦振蕩 混勻，8000r/min離心6min棄上清，加入50 核酸提取液，旋渦振蕩混勻后 IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模板檢測(cè)。如果是胚胎移植性別鑒定，可取1 2個(gè)細(xì)胞直接加入25 pl核酸提取液， 旋渦振蕩混勻后IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模 板檢測(cè)。(2) 擴(kuò)增檢測(cè)按照待檢測(cè)樣品數(shù)n+3，取PCR反應(yīng)緩沖液15 X (n+3)、Taq酶2X (n+3 ) 組分，混勻后每個(gè)擴(kuò)增管分裝17 pl，分別加入試劑盒陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以 及上述處理好的n個(gè)樣品模板各13 ^。每個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增管體積為30 W，將上述 擴(kuò)增管放到實(shí)時(shí)熒光PCR儀器上按照50。C 2min、 94°C 2min后94。C 5 sec、60°C 30sec循環(huán)40次的程序運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)束后陰性對(duì)照為陰性、陽(yáng)性對(duì)照為 陽(yáng)性，樣本擴(kuò)增為陽(yáng)性者為雄性，否則為雌性。
全文摘要
本發(fā)明為一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行奶牛胚胎性別鑒定的方法和試劑盒，它采用一對(duì)奶牛特異性引物擴(kuò)增性別決定基因(sry)上的182bp區(qū)域，并用特異性TaqMan水解探針法實(shí)時(shí)檢測(cè)。試劑盒組分包括核酸濃縮液、核酸提取液、PCR反應(yīng)緩沖液、Taq酶、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。試劑盒的使用包括樣本處理和擴(kuò)增檢測(cè)兩個(gè)步驟，本發(fā)明通過檢測(cè)模板中sry基因片段的存在來判斷樣品個(gè)體的性別，試劑盒操作簡(jiǎn)便快速(1小時(shí)以內(nèi))，并可避免因自身擴(kuò)增產(chǎn)物、人以及其它動(dòng)物來源核酸污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性，準(zhǔn)確率達(dá)到100％，可廣泛應(yīng)用于懷孕奶牛胎牛性別鑒定、奶牛胚胎移植性別鑒定以及科研奶牛sry基因檢測(cè)中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101451161SQ20071017124
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者吳大治, 懿 夏 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司