專利名稱：：高致病性豬藍(lán)耳病病毒重組質(zhì)粒和遺傳工程疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種病毒的重組質(zhì)粒和遺傳工程疫苗，更具體地說，涉及一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒重組質(zhì)粒和遺傳工程疫苗。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineR印roductiveandRespiratorySyndrome,PRRS),又稱藍(lán)耳病，是一種由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)引起的高度接觸性傳染病。PRRSV基因組為大小約15kb、不分節(jié)段的單股正鏈RNA。由于RNA病毒易于發(fā)生遺傳及抗原突變，近年來在世界各地出現(xiàn)了致病力增強(qiáng)的PRRSV變異株，另外，因為PRRSV靶細(xì)胞為免疫系統(tǒng)重要成員之一的肺泡巨噬細(xì)胞，感染豬大多呈現(xiàn)免疫抑制而致繼發(fā)感染和混合感染。為了更深入的了解PRRSV的生物學(xué)特性和不斷變化的現(xiàn)狀，最有效的方法之一就是利用反向遺傳操作系統(tǒng)對其基因組結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性進(jìn)行相應(yīng)的研究，從而獲取其結(jié)構(gòu)與基因的直接證據(jù)。早在1998年Meulenberg就成功構(gòu)建起歐洲株LV(LelystadVirus)的重組質(zhì)粒，而后世界各國的科學(xué)家也紛紛構(gòu)建起不同病毒株的重組質(zhì)粒，而且試驗證據(jù)也在不斷證明，拯救出來的病毒一般都具有與野毒株相類似的生物學(xué)特性，但是這些野毒株和構(gòu)建的重組質(zhì)粒大多屬于經(jīng)典PRRSV株，感染率和致死率均不高，不能有效區(qū)分強(qiáng)毒株與弱毒株對動物體致病力的差異。2006年5月以來，中國爆發(fā)了高致病性PRRSV引發(fā)的所謂"豬高熱綜合征"，該病以傳播迅猛、高致死率為特征，死亡率竟然高達(dá)80%-100%。尤其令人吃驚的是，高致病性PRRSV與典型株不同，表現(xiàn)于不僅僅感染仔豬死亡率可達(dá)100%，而且77日齡成年感染豬死亡率也高達(dá)57%。因此，很有必要構(gòu)建出高致病性病毒重組質(zhì)粒株，以便于對高致病性的PRRSV的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，同時，開發(fā)新型高效的藍(lán)耳病疫苗也成為當(dāng)務(wù)之急。但是，由于PRRSV基因組很長，是大小約15kb、不分節(jié)段的單鏈正股RNA，編碼至少9個開放閱讀框(ORF)，而且這些閱讀框兩兩之間具有重疊區(qū)域，因此閱讀框中的一個堿基的變化就有可能會影響整個基因組的結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致整個全長質(zhì)粒不具備感染性；此外，因為RNA病毒自身的特點，其基因組并不穩(wěn)定，因此，利用傳統(tǒng)的方法，很難從cDNA直接獲得全長重組質(zhì)粒，從而成為開發(fā)新型高效的藍(lán)耳病疫苗的工作的瓶頸。PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成外觀圓形有囊膜的病毒顆粒，其中，0RF5、0RF6和0RF7所編碼的產(chǎn)物為病毒蛋白必需蛋白，而其他糖蛋白GP2、GP3、GP4等在病毒顆粒組裝乃至激發(fā)機(jī)體內(nèi)免疫過程中的作用還存在爭議。GP5被認(rèn)為是病毒的細(xì)胞結(jié)合蛋白，同時也是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，核衣殼蛋白N是免疫原性最強(qiáng)的蛋白，因此，針對這些在病毒感染過程中與激發(fā)機(jī)體免疫極其相關(guān)的這些蛋白，開發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征疫苗成為可能。另一方面，不同病毒株間遺傳及抗原差異很大，如何提高疫苗毒株的交叉保護(hù)性以及研制針對目前優(yōu)勢流行株的高效疫苗是亟待解決的問題。利用反向遺傳操作技術(shù)可以構(gòu)建不同毒株間的嵌合病毒，使其具備多種病毒的免疫學(xué)特性；另外，這種嵌合疫苗是在基因水平上按照理想設(shè)計改造病原體，即將兩種或多種相似的病原體的基因組或片段用基因工程的方法以不同形式連接或置換，從而可以得到減毒活疫苗。因此，利用嵌合疫苗開發(fā)新型高效的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗具有可行性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種高致病性豬藍(lán)耳病病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種高致病性藍(lán)耳病的遺傳工程活疫苗。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種高致病性藍(lán)耳病的遺傳工程活疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明的從病毒cDNA獲得高致病性藍(lán)耳病病毒的重組質(zhì)粒的方法，為根據(jù)藍(lán)耳病病毒相對保守區(qū)的序列設(shè)計多對引物對，利用高致病性豬藍(lán)耳病病毒cDNA為模板，分段擴(kuò)增藍(lán)耳病病毒基因序列，然后將擴(kuò)增出的序列依次連接到合適的載體，從而獲得了一種高致病性藍(lán)耳病病毒重組質(zhì)粒。本發(fā)明的高致病性藍(lán)耳病的遺傳工程活疫苗，是編碼結(jié)構(gòu)蛋白的序列和3'UTR基因被所述重組質(zhì)粒的相應(yīng)的編碼結(jié)構(gòu)蛋白的序列以及3'UTR基因所替代的弱毒疫苗株。本發(fā)明的高致病性藍(lán)耳病的遺傳工程活疫苗的構(gòu)建方法包括以下步驟首先擴(kuò)增出重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)蛋白基因；然后將擴(kuò)增出的結(jié)構(gòu)蛋白基因和弱毒疫苗株進(jìn)行酶切，最后將酶切后的結(jié)構(gòu)蛋白基因和弱毒疫苗株進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化T0P10，然后通過篩選獲得遺傳工程活疫苗，從而提供了相應(yīng)的構(gòu)建方法。使用本發(fā)明的重組質(zhì)粒構(gòu)建方法，可以將基于發(fā)病豬場獲得的血清中分離出來的病毒構(gòu)建成全長感染性cDNA質(zhì)粒pJX143，該病毒及其拯救出來的病毒具有和野生親本毒相似的生物學(xué)特性和動物宿主的感染力和致死率。而且后續(xù)的試驗證實，該重組質(zhì)粒確實是引起這次"豬無名高熱"的主要致病病原。同時，基于上述重組質(zhì)粒，構(gòu)建的一株疫苗株pSX12對豬體具有較好安全性，免疫后可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生機(jī)體免疫，并提供豬體免疫保護(hù)作用，對"豬高致病性藍(lán)耳病"的免疫保護(hù)率高達(dá)100%，安全有效。圖1是不同PRRS-F/PRRS-R引物對擴(kuò)增PRRSV全基因組序列PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果，其中，泳道l為由引物SF1392和SR6589獲得的長度約為5kb的PCR片段，泳道2為由引物SF4344和SR9033獲得的長度約為5kb的PCR片段，泳道3為由引物SF7682和SR13334獲得的長度約為5.5kb的PCR片段，泳道4為引物STL和SR2573獲得的長度約為2.5kb的PCR片段，泳道5為由引物SF11422和Qst獲得的長度約為2.5kb的PCR片段。圖2是PRRSV基因組全長cDNA質(zhì)粒構(gòu)建策略示意圖。圖3是全基因組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖4是用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后出現(xiàn)的細(xì)胞病變結(jié)果。圖5是拯救病毒的N蛋白免疫熒光照片，其中，A是被拯救病毒vJX143的N蛋白免疫熒光照片；B是被拯救病毒vJX143-M的N蛋白免疫熒光照片；C為陰性對照。圖6是對照弱毒株、拯救病毒株與野毒株病毒滴度比較結(jié)果。圖7是拯救病毒株、野毒株和陰性對照對豬的體溫影響的結(jié)果。圖8是嵌合質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖9是嵌合病毒構(gòu)建過程中結(jié)構(gòu)蛋白擴(kuò)增的電泳結(jié)果。圖10是Smal酶切嵌合質(zhì)粒pSX12、p5NX12和p56N12的電泳結(jié)果，其中，泳道1是Smal酶切的pSX12，泳道2是Smal酶切的p5NX12，泳道3是Smal酶切的p56N12，泳道4是Smal酶切的陽性對照pAPRRS。圖11是試驗及對照組豬在PRRSVSX12株病毒接種及PRRSVJX143株病毒攻毒后每天體溫變化。圖12是在vSX12株病毒接種后第0，3，5，7，10，14，21，28天抗體變化圖。具體實施例方式在本發(fā)明中，所述豬藍(lán)耳病病毒或豬繁殖與呼吸綜合征病毒株指的是，豬繁殖與呼吸綜合征病毒vJX143株。在本發(fā)明中，所述重組質(zhì)粒指的是，利用反向遺傳操作技術(shù)，由上述野毒株獲得的cDNA質(zhì)粒pJX143。在本發(fā)明中，所述嵌合病毒指的是，利用基因嵌合技術(shù)獲得的全長重組質(zhì)粒pSX12、p5NX12和p56N12。在本發(fā)明中，所述的反向遺傳操作指的是相對于經(jīng)典遺傳學(xué)而言的，是在獲得高致病性藍(lán)耳病基因組全部序列(JX143)的基礎(chǔ)上，通過對病毒基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點突變、基因插入/缺失、基因置換等，再按組成順序構(gòu)建全長病毒基因組，讓其裝配出具有生物活性的病毒粒子，研究高致病性藍(lán)耳病基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以及這些修飾可能對病毒的表型、性狀有何種影響等方面的內(nèi)容。在本發(fā)明中，所述北美株和歐洲株代表株指的分別是，北美株經(jīng)典毒株VR2332(Genbankaccession抑Q217415)和歐洲株經(jīng)典毒株LV(Genbankaccession棚96262)。在本發(fā)明中，所述弱病毒株pAPRRS指的是，參考文獻(xiàn)孫志，王金勇，張建武，秦愛健，袁世山，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒3'UTR的反向遺傳操作.微生物學(xué)報[J]，2007，47(5):774-778.的方法，利用系列傳代獲得的一株弱毒株的感染性克隆。以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件進(jìn)行。在本發(fā)明的實施例中，使用的病毒和細(xì)胞Marc-145細(xì)胞(美國細(xì)胞保藏中心ATCC，保存號為CRL-2378.1);高致病性的PRRSV病毒vJX143株(中國普通微生物保藏管理中心保存號為CGMCCNo.1964)，利用其感染正常豬仔710天后取血清待用。在本發(fā)明的實施例中，使用的質(zhì)粒與菌株:pBlueScript1ISK(+)載體購自Invitrogen公司，pBS-T載體、T0P10感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGENE公司。在本發(fā)明的實施例中，使用的其他試劑QIAampViralRNAMiniKit購自QIAGENE公司，DNA膠回收試劑盒和QuantReverseTranscriptase購自TIANGENE公司，rTaqDNA聚合酶，dNTP和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，Opti-MEM購自Invitrogen公司。在本發(fā)明的實施例中，Marc-145單層細(xì)胞采用以下方法制備Marc-145細(xì)胞在含有6%FBS的DMEM培養(yǎng)基的六孔板中貼壁長滿單層后，棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍后加入維持液(2%FBS的DMEM)培養(yǎng)基，37°C5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在本發(fā)明的實施例中，細(xì)胞回歸試驗過程如下利用試驗豬體內(nèi)各組織臟器的病料研磨勻漿上清感染單層Marc-145細(xì)胞，然后進(jìn)行傳代，以觀察是否可以出現(xiàn)細(xì)胞病變，如出現(xiàn)，則證明豬體內(nèi)各組織臟器中含有具有生物活性的病毒粒子。實施例l、高致病性藍(lán)耳病病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank登錄號為EF488048的高致病性藍(lán)耳病病毒基因JX143的堿基序列，設(shè)計出5對引物，分別作為PCR擴(kuò)增的引物；然后將從使用PRRSV病毒vJX143株感染的豬仔的血清中提取高致病性病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄合成為野毒株cDNA，以其作為PCR的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得野毒株cDNA的5條特異性片段l-5，并將第5條特異性片段進(jìn)行突變，獲得特異性片段5';然后將特異性片段l一5或特異性片段l一4+5'依次插入到pBlueScriptIISK(+)載體中，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pJX143和pJX143-M，過程如圖3所示，然后分別通過細(xì)胞實驗和動物體實驗，驗證了獲得的重組質(zhì)粒具有高致病性，具體過程如下1.1、引物設(shè)計根據(jù)GenBank登錄號為EF488048的JX143堿基序列，設(shè)計在PRRSV基因組中的相對保守區(qū)引物，分別命名為STL，SF1392,SR2573,SF4344,SR6589,SF7682，SR9033，SF11422，SR13334和Qst，其中，STL和SR2573，SF1392和SR6589,SF4344和SR9033,SF7682和SR13334，SF11422和Qst分別構(gòu)成相應(yīng)的引物對，其序列分別如下所示-ACATGCATGCTAATACGACTCACTATAGGTATGACGTATAGGTGTTGGC-3'-GCCGCGCTTTGCCCGTTCGT-3'-CTGCCCAGGCCATCATGTCCGAAGTC-3'-GCCCCGTCGGTCTCAGTCTTGCCATTTTT-3'-ACCGAGGCTGTAAAAGGCAAGTGACC-3'-CTTTCCGTTGAGCAGGCCCTTGGTATGA-3'-GGCGGCAAACCAGCGGACAA-3'-TTTATAAGGCCACTGCCACC-3'STL:5，SF1392:5，SR2573:5,SF4344:5，SR6589:5，SF7682:5，SR9033:5，SF11422:5，SR13334:5，Qst:5，1.2、高致病性病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.2.1、血清樣品中病毒RNA的提取使用vJX143株感染仔豬，然后取發(fā)病豬的血清樣品140u1，參照QIAampViralRNAMiniKit中病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清的方法，提取病毒的RNA。1.2.2、高致病性病毒cDNA的合成取上述獲得的病毒RNA12.5"1，加入dNTP(2.5mM)4u1，lOXBuffer2ul，Qst反轉(zhuǎn)錄弓l物(10mM)0.5yl，QuantReverseTranscriptase(購自Invitrogen公司)1wl,混合均勻后置37t:水浴1小時，獲得高致病性病毒cDNA。1.2.3、高致病性病毒cDNA片段的PCR擴(kuò)增以上述合成的cDNA為模板，每次以一對實施例1.1中相應(yīng)的上下游引物對作為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系如下cDNA模板lul，上下游引物對(10uM)各lul,lOXBuffer2ul，2.5mMdNTP2ul，rTaqDNA聚合酶5units,加水至20u1。PCR反應(yīng)完成后，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖l所示，根據(jù)圖l的結(jié)果，分別獲得了大小為2.5Kb、2.5Kb、5.1Kb、5.3Kb、5.2Kb的目的條帶。然后參照說明書，使用膠回收試劑盒回收目的片段，獲得5條特異性片段，然后對上述5條特異性片段測序，其序列分別如SEQIDNO:1-5所示。1.2.4、特異性片斷的克隆將上步獲得的各特異性片斷，參照pBS-TMiniKit(TIANGEN公司)中片段連接的方法，分別克隆到pBS-T載體中，通過藍(lán)白斑篩選及其瓊脂糖凝膠電泳，獲得重組質(zhì)粒，分別命名為pBS-INKpBS-IN2、pBS-IN3、pBS-IN4、pBS-IN5。獲得的5個重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證，克隆進(jìn)去的5條特異性片段正確。1.2.5、病毒全長cDNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用生物醫(yī)學(xué)軟件DNASTAR(http:〃enfu11.com/china/Profession/{E37D28C4-9991-4AA1-B76A-016A046CD62D}.htm)，對pBS-INl、pBS-IN2、pBS_IN3、pBS-IN4、pBS-IN5中目的片段的重疊區(qū)域進(jìn)行分析后，選取合適的酶切位點(分別為SphI、Mfel、AflII、Agel、AscI和NotI)進(jìn)行酶切，如圖2所示，使用Sphl和Mfel雙酶切pBS-IN1，Mfel和AflII雙酶切pBS-IN2，AflII和Agel雙酶切pBS-IN3，Agel和Ascl雙酶切pBS-IN4，Ascl和Notl雙酶切pBS-IN5，然后將上述酶切后的片段按照pBS-INlpBS-IN5的順序依次插入到經(jīng)相同酶切的pBlueScriptIISK(+)載體中，構(gòu)建成為全長重組質(zhì)粒。獲得的全長重組質(zhì)粒用BamHI鑒定，出現(xiàn)了預(yù)期大小的片斷，然后將該片段測序，結(jié)果顯示序列如SEQIDNO:6所示，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時，還將pBS-IN5上的特異性片段(即SEQIDN0:5)上對應(yīng)全長的第14680位的堿基A突變?yōu)镚，獲得pBS-IN5-M片段，然后采用上述相同的方法，將pBS-IN5-M替代pBS-IN5片段插入到pBlueScriptIISK(+)載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBLJX-5-M。1.3、病毒RNA的制備1.3.1、質(zhì)粒的NotI線性化于37°C，用NotI分別對質(zhì)粒pBLJX-5和pBLJX_5-M進(jìn)行線性化酶切(反應(yīng)體系為突變質(zhì)粒30pL，2pL，ddH2013pL，10xNEBBuffer25pL)，酶切過夜。參考說明書的方法，用QIAquickPCRPurificationKit純化酶切產(chǎn)物，分別獲得純化的線性化質(zhì)粒。1.3.2、體外轉(zhuǎn)錄參考說明書的方法，使用T7mMESSAGEHighYieldCa卯edRNATranscriptionKit(購自Ambion公司)體外轉(zhuǎn)錄純化后的線性化質(zhì)粒，并采用RNA電泳鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果，獲得了vJX143和VJX143-MRNA。1.4、高致病性藍(lán)耳病病毒重組質(zhì)粒的檢測1.4.1、RNA的轉(zhuǎn)染接種Marc-145細(xì)胞(羅猴腎細(xì)胞系，購自美國ATCC)于六孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為80-90%時，向每孔中分別加入2ii1vJX143和vJX143-MRNA和2u1DMRIE-C轉(zhuǎn)染i式劑，在lml的Opti-MEM中振蕩混勻，然后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法，轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，并且逐日觀察細(xì)胞病變。待出現(xiàn)如圖4所示的細(xì)胞病變(CPE)后，收取上清并傳代，上清收取及傳代過程具體如下Marc-145細(xì)胞在含有6%FBS的DMEM培養(yǎng)基的六孔板中貼壁長滿單層后，棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，吸取轉(zhuǎn)染過后五天的上清液，將其與維持液(含2%FBS的DMEM)按照1:10的比例接種上清液200^1，置37'C繼續(xù)培養(yǎng)并采用上述方法繼續(xù)傳代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取試劑盒中的操作方法提取上清病毒RNA，獲得病毒vJX143和vJX143-M。根據(jù)上述結(jié)果，獲得的重組質(zhì)粒pJX143和pJX143-M具有感染性，能夠從單一的基因組序列成功轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘牟《玖Ｗ硬⒕哂邢鄳?yīng)的病毒感染性。1.4.2、間接免疫熒光檢測按照實施例1.4.1中的RNA轉(zhuǎn)染步驟，分別以純化后1000倍稀釋的病毒vJX143和vJX143-M，感染單層Marc-145細(xì)胞，然后于感染36h后棄去培養(yǎng)基，用冰甲醇固定lOmin，1XBSA室溫封閉30rain，PRRSV核衣殼蛋白的特異性單抗(1:800稀釋)室溫孵育2h，再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠的二抗室溫孵育lh，PBS洗五遍后，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)圖5的結(jié)果pJX143和pJX143-M于轉(zhuǎn)染后第5天出現(xiàn)了明顯的CPE，以無限稀釋法傳代純化嵌合病毒vJX143和vJX143-M，并且以間接免疫熒光分別檢測感染嵌合病毒vJX143或vJX143-M36h后的Marc-145細(xì)胞，出現(xiàn)了特異性熒光。同時，利用RT-PCR技術(shù)檢測原代(P)和子代(P5)病毒，結(jié)果顯示，分子標(biāo)記依然穩(wěn)定存在。上述結(jié)果說明利用反向遺傳操作系統(tǒng)獲得了和野毒具有相似生長特性的全長重組質(zhì)粒，而且同時說明在0RF5下游插入的遺傳標(biāo)記并不影響整個病毒的生長，是可行的。1.4.3、病毒細(xì)胞半數(shù)感染量(TCIDs。)測定參照Pizzi，M.，5"柳joZi/7《ra77'3"o"oft力e/"i/Yy/erce/te/7^-/7W./7t,0^er歷i/e^6/^eyeec/-M/e/7C力^e/re/s,鵬t力odHumBiol，1950.22(3):p151-90.中的方法，用96孔組織培養(yǎng)板方法進(jìn)行感染性滴度的測定。將上述感染細(xì)胞后收取的病毒上清用維持液(2%FBS的DMEM)作10倍系列稀釋后，將l(T連續(xù)稀釋的病毒接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的MARC-145單層細(xì)胞，每稀釋度接種4L，每孔0.20ml，再設(shè)2孔對照(即用維持液代替病毒液)，置37"C5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察感染細(xì)胞，記錄出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)，當(dāng)停止出現(xiàn)細(xì)胞病變后，停止觀察，并按Reed-Muench法計算TCID50，1.4.4、病毒多步生長曲線的繪制分別以低劑量(0.1MOI)病毒(野毒、vJX143和vJX143-M)感染MARC-145細(xì)胞，分別在感染后不同的時間段(6h、12h、24h、36h、48h、72h、84h、96h、108h、120h)收取細(xì)胞上清，并進(jìn)行病毒滴度的測定，收取的每個時間點病毒用TCIDs。計算滴度，并根據(jù)不同時間點病毒的滴度，繪制病毒多步生長曲線，結(jié)果如圖6所示，根據(jù)該圖，在感染10h后病毒形成第一個復(fù)制高峰期，隨后在第50h出現(xiàn)第二個復(fù)制高峰期;野毒株vJX143與嵌合病毒vJX143及vJX143-M之間的差異不顯著。結(jié)果說明利用反向遺傳操作技術(shù)，獲得的全長重組質(zhì)粒質(zhì)粒拯救出來的病毒和野生毒株在病毒的復(fù)制，增值，各個時間的病毒滴度等及其平臺期，指數(shù)增長期，平臺期等生長曲線方面具有相似的生物活性。1.4.5、動物回歸試驗將12頭35日齡PRRSV血清陰性豬分成4組，每組三頭，以鼻腔接種分別接種野毒(A組)、嵌合病毒vJX143(B組)和vJX143-M(C組)及生理鹽水(D組)，每頭接種lml(TCID5I)lOVml)，同時肌肉注射lml，隔離詞喂，每天測量體溫并進(jìn)行臨床癥狀的觀察，結(jié)果如圖7所示。攻毒25天后，撲殺試驗豬，采取肺、腎臟、脾、腸、淋巴結(jié)及血清，利用RT-PCR及細(xì)胞回歸試驗檢測上述各組織器官中的病毒組分，實驗結(jié)果如下A組和B組試驗豬在攻毒5天后體溫升高，攻毒豬均見消痩,腹式呼吸，食欲不振，精神沉郁,有部分豬發(fā)現(xiàn)水樣稀糞，并伴有咳嗽癥狀，死亡豬尤其可見消瘦，腹式呼吸。A組豬分別在第13天和第16天死亡，B組豬分別在第14和15天死亡。對死亡豬剖檢可見肺部癥狀明顯，淋巴結(jié)出血明顯，部分豬腎臟有出血點，少數(shù)豬伴有整個消化道廣泛性出血、水腫，腸內(nèi)容物為紅色，含有大量氣泡和粘液。C組豬體溫、精神狀況均正常，剖檢未見上述變化。具體體溫變化如圖7所示。上述實驗結(jié)果，說明拯救出來的病毒與野毒具有相似的生物學(xué)特性，而且在動物試驗中也證實，這次豬高熱綜合癥的病原確實是由vJX143為代表的病毒。在實施例1中，通過分子操作技術(shù)獲得了正在中國大面積爆發(fā)的"豬高熱綜合征"的主要病原-高致病性PRRSV的全長序列，而且在此基礎(chǔ)之上成功構(gòu)建了高致病性全長重組質(zhì)粒pJX143，并證實拯救出來的病毒與原毒具有相類似的生物學(xué)特性，更重要的是在動物回歸試驗中，該重組質(zhì)粒pJX143呈現(xiàn)出與親本毒相似的高致死率。此外，加入了遺傳標(biāo)記MluI的全長質(zhì)粒具有相似的特征，而且在傳代之后依然能夠穩(wěn)定存在，可以成為鑒定野毒與拯救病毒可靠的遺傳標(biāo)記，從而證實該株P(guān)RRSV是引起"豬高熱綜合征"的主要病原，而且也是中國這次大面積暴發(fā)的代表株；同時，根據(jù)反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建的該重組質(zhì)粒可以為后續(xù)試驗及其應(yīng)用提供有效的操作平臺。實施例2、藍(lán)耳病嵌合病毒構(gòu)建及檢測2.1、引物設(shè)計根據(jù)pJX143株的序列，設(shè)計引物SPEF，NDE5F，Qst，SRS0E6,SFS0E7，SF12670,SR14365,SF14413和SR15497,其序列及序列說明如表1所示表l、克隆以及測序所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2、結(jié)構(gòu)蛋白嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建以pJX143重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)蛋白為對象，通過PCR擴(kuò)增出pJX143的結(jié)構(gòu)蛋白基因GP4-GP5-M-N和GP5-M-N，然后分別使用Spel/Xhol和Ndel/Xhol進(jìn)行雙酶切，再與經(jīng)過相應(yīng)的內(nèi)切酶切過的弱病毒株pAPRRS的大片段通過T4DNA連接酶連接，經(jīng)測序鑒定后篩選出陽性克隆，獲得pSX12和p5NX12，構(gòu)建策略如圖8所示，具體構(gòu)建步驟如下2.2.1、擴(kuò)增結(jié)構(gòu)蛋白GP4—GP5—M—N基因以pJX143作為模板，弓l物SPEF和Qst分別作為上游引物和下游引物，PCR擴(kuò)增結(jié)構(gòu)蛋白GP4—GP5—M—N基因，具體如下PCR反應(yīng)體系為:pJX143模板lu1，上下游引物對(IOuM)各1ii1，10XpfuBuffer5iil，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50lU。PCR反應(yīng)參數(shù)為95。C預(yù)變性2min，94。C變性45s，62。C退火45s，72。C延伸2min30s，共進(jìn)行35個循環(huán)，然后72'C延伸10min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖9所示，根據(jù)檢測結(jié)果，獲得的目的片段大小為2.4kb。2.2.2、擴(kuò)增結(jié)構(gòu)蛋白GP5—M—N基因以pJX143作為模板，引物NDE5F和Qst分別作為上游引物和下游引物，PCR擴(kuò)增結(jié)構(gòu)蛋白GP5—M—N基因，具體如下PCR反應(yīng)體系為'pJX143模板lul，上下游引物對(IOuM)各lul，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2yl，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50iil。PCR反應(yīng)參數(shù)為95。C預(yù)變性2min，94。C變性45s，52。C退火45s，72。C延伸2min，進(jìn)行6個循環(huán)，再95。C預(yù)變性加in，94。C變性45s，62。C退火45s，72。C延伸2min，進(jìn)行25個循環(huán)，再72'C延伸10min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖9所示，根據(jù)檢測結(jié)果，獲得的目的片段大小為1.6kb。2.2.3、擴(kuò)增結(jié)構(gòu)蛋白基因的酶切利用小量膠回收試劑盒分別純化實施例2.3.1和2.3.2中獲得的PCR產(chǎn)物，然后分別以SpeI/XhoI雙酶切GP4—GP5—M—N基因的PCR產(chǎn)物，以NdeI/XhoI雙酶切GP5—M一N基因PCR產(chǎn)物，將獲得的酶切產(chǎn)物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，獲得大小分別為2.4kb的GP4—GP5—M—N基因片段和1.6kb的GP5—M—N基因片段。2.2.4、載體pAPRRS、p5NDE的雙酶切分別以SpeI/XhoI雙酶切pAPRRS，以NdeI/XhoI雙酶切p5NDE。再將酶切產(chǎn)物分別以1%瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒純化，分別獲得大小分別為16kb的pAPRRS雙酶切片段和17kb的p5NDE雙酶切片段。2.2.5、嵌合質(zhì)粒的連接和鑒定將回收的PCR雙酶切產(chǎn)物和相應(yīng)的質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物，以T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化T0P10，篩選大小合適的陽性質(zhì)粒，測序鑒定。具體步驟如下將PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的載體片段以摩爾比3:1的比例，以T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化TOPIO，挑取獨立的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，1%凝膠電泳，挑取大小為18kb的質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果分別如SEQIDNO:7和8所示。將GP4—GP5—M—N嵌合的全長質(zhì)粒(即SEQIDNO:7對應(yīng)的質(zhì)粒)命名為pSX12,GP5一M—N嵌合的全長質(zhì)粒(即SEQIDNO:8對應(yīng)的質(zhì)粒)命名為p5NX12。2.3、GP5—M的嵌合質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定參考KarinLHeckmanetal.GenesplicingandmutagenesisbyPCR-drivenoverlapextension.NATUREPROTOCOLS.2007VOL.2NO.4,通過S0EPCR法，把p5NX12的N蛋白以及3'UTR基因置換成弱毒疫苗株全長重組質(zhì)粒pAPRRS的相應(yīng)部分，從而獲得GP5—M的嵌合質(zhì)粒，具體步驟如下在M蛋白和N蛋白基因重疊區(qū)域設(shè)計S0EPCR內(nèi)引物(即SRS0E6和SFS0E7)，外引物采用SPEF和Qst。以p5NX12為模板，SPEF和SRS0E6為上下游引物，采用S0EPCR擴(kuò)增，其中PCR反應(yīng)體系為:p5NX12模板U1，上下游引物對(10pM)各1"1，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50ul。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95°C預(yù)變性2min，94。C變性45s，62。C退火45s,72。C延伸2min，共進(jìn)行35個循環(huán)，然后72'C延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖9所示，然后用膠回收試劑盒回收，獲得大小為1.9kb目的片段。然后，以pAPRRS為模板，SFS0E7和Qst為上下游引物，PCR擴(kuò)增，其中PCR反應(yīng)體系為:pAPRRS模板lii1，上下游引物對(IOuM)各1"1，lOXpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50ul。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性2min，94。C變性45s，68。C退火延伸2min，共進(jìn)行35個循環(huán)，然后72T:延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖9所示，然后用膠回收試劑盒回收，獲得大小為0.5kb目的片段。最后，以上述兩個PCR產(chǎn)物為模板，SPEF和Qst為上下游引物，PCR擴(kuò)增，其中PCR反應(yīng)體系為模板各lul，上下游引物對(10nM)各lul，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul,PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50iU。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性2min，94。C變性45s，62。C退火45s，72'C延伸2min45s，共進(jìn)行35個循環(huán)，然后72。C延伸10min。將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖9所示，然后用膠回收試劑盒回收，獲得大小約為2.5kb目的片段。將回收獲得的PCR產(chǎn)物和pAPRRS經(jīng)SpeI/XhoI雙酶切后連接，通過1%凝膠電泳篩選，將獲得的大小約為18kb的質(zhì)粒，命名為p56N12并進(jìn)行測序，結(jié)果如SEQIDN0:9所示，根據(jù)該結(jié)果，p56N12構(gòu)建成功。pSX12，p5NX12，p56N12以SmaI酶切鑒定，結(jié)果如圖10所示，根據(jù)該結(jié)果，這三個嵌合質(zhì)粒的Smal酶切圖譜與預(yù)期的一致，沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)缺失。根據(jù)上述實驗結(jié)果，通過反向遺傳操作，以pJX143株重組質(zhì)粒pAPRRS質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建了把JX143株GP4—GP5—M—N基因置換入pAPRRS而得到三個嵌合質(zhì)粒的pSX12、p5NX12和p56N12。經(jīng)Smal酶切鑒定，與pAPRRS比較，無缺失；經(jīng)測序分析顯示質(zhì)粒SX12的序列為SEQIDNO:7，質(zhì)粒5NX12的序列為SEQIDNO:8，質(zhì)粒56N12的序列為SEQIDNO:9，根據(jù)該結(jié)果成功獲得了3個變異株結(jié)構(gòu)蛋白嵌合的嵌合質(zhì)粒。2.5、嵌合質(zhì)粒的拯救2.5.1、嵌合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞將MARC-145細(xì)胞傳代至六孔板上，使每孔細(xì)胞數(shù)達(dá)到2乂105個，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%80%左右時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pSX12，p5NX12，p56N12按Roche公司FUGeneHD轉(zhuǎn)染試劑的方法轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，然后置37'C，5%002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞病變達(dá)80%時，收集細(xì)胞上清。2.5.2、轉(zhuǎn)染上清的傳代與RNA的提取MARC-145細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的六孔板中貼壁長滿單層后，棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，將細(xì)胞病變上清與維持液(2%FBS的DMEM)按照1:10的比例接種上清液200yL，置37。C繼續(xù)培養(yǎng)。傳代5次以后，待產(chǎn)生80%CPE后，吸取病毒上清，按照QIAgen公司ViralRNAminiKit說明書的方法，提取病毒RNA。2.5.3、RT-PCR鑒定將提取的3個嵌合病毒上清RNA模板，按AMV(購自Takara公司)和rTaq(購自Takara公司)說明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，獲得病毒cDNA序列，其中，cDNA第一鏈合成引物是Qst,PCR引物是SX12以SF12670、SR14365為上下游引物、5NX12以SF14413、SR15497為上下游引物、56N12分別以SF12670、SR14365和SF14413、SR15497為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測序鑒定，根據(jù)測序結(jié)果，3個嵌合病毒構(gòu)建成功。將嵌合病毒在MARC-145細(xì)胞上連續(xù)傳代5次后，取細(xì)胞上清用于抽提病毒基因組，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒與弱毒重組質(zhì)粒的嵌合交叉區(qū)域。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)可見并測序，采用DNAstar軟件與親本重組質(zhì)粒pAPRRS序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示3個嵌合病毒變異株序列都能穩(wěn)定存在。根據(jù)實施例2，本發(fā)明在高致病性藍(lán)耳病重組質(zhì)粒和經(jīng)典弱毒藍(lán)耳病重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)之上，將高致病藍(lán)耳病病毒的GP4—GP5—M—N，GP5—M，GP5—M-N基因分別替換到經(jīng)典弱毒藍(lán)耳病重組質(zhì)粒中，從而構(gòu)建出3個嵌合質(zhì)粒，經(jīng)病毒拯救，獲得了活病毒，經(jīng)RT-PCR鑒定，嵌合病毒能夠穩(wěn)定的傳代而不發(fā)生缺失，因此，上述3個嵌合病毒，可作為新型藍(lán)耳病疫苗。從上述三個嵌合病毒中，任取一個進(jìn)行動物實驗，以驗證其對藍(lán)耳病具有免疫作用，在本發(fā)明的實施例3中，使用的是pSX12。實施例3、藍(lán)耳病嵌合病毒免疫保護(hù)性試驗3.1試驗豬的選擇及分組選取29日齡健康仔豬10頭，經(jīng)采集血清進(jìn)行PRRSV抗體及抗原檢測，確定為PRRSV抗體陰性和抗原陰性，稱重后隨機(jī)將其分為2組，5頭/組，隔離飼養(yǎng)。3.2藍(lán)耳病嵌合病毒接種選取TCIDs。為IO"的PRRSVSX12株病毒的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)物，用滅菌PBS液做IOO倍稀釋后，頸部肌肉接種一組5頭試驗仔豬，104°TCID5。/ml，2ml/頭；另一組5頭豬頸部肌肉接種滅菌PBS液作為對照，2ml/頭。3.3藍(lán)耳病嵌合病毒免疫后的攻毒試驗組仔豬在PRRSVSX12株病毒接種后28天，接種PRRSVvJX143株病毒用滅菌PBS液做10倍稀釋的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)物，10"TCID5。/ml，頸部肌肉接種3ml/頭。對照組5頭豬也做同樣劑量和途徑的接種。3.4試驗豬的體溫測定試驗及對照組豬在PRRSVSX12株病毒接種后至用PRRSVvJX143株病毒攻毒14天后，每天進(jìn)行體溫測定，測定結(jié)果如圖11所示。根據(jù)測定結(jié)果，試驗組在接種PRRSVSX12株病毒后未出現(xiàn)可觀察到的體溫反應(yīng);PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接種組出現(xiàn)一過性體溫升高，而對照組則出現(xiàn)明顯的體溫升高，并且比SX12株病毒接種組的高體溫水平持續(xù)更長的時間。3.5試驗豬血清抗體的測定在PRRSVSX12株病毒接種后第0，3，5，7，10，14，21，28天對SX12株病毒接種組采集血清，并利用IDEXXPRRSV抗體檢測試劑盒(購自美國HerdChekIDEXX)進(jìn)行抗體檢測，同時對未免疫組定期采集血清,并進(jìn)行抗體檢測作為對照，結(jié)果如圖12所示，根據(jù)該結(jié)果，試驗組在接種PRRSVSX12株病毒后第10天抗體開始產(chǎn)生，14天達(dá)到陽性值(ELISAS/P》0.4)，攻毒后抗體繼續(xù)升高并達(dá)到峰值，到剖殺時(免疫后52天)，抗體一直維持在高水平(ELISAS/P》3)，說明PRRSVSX12株有良好的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在PRRSVvJX143株病毒接種后第0，2，4，6，8，10，14天對SX12株病毒接種組和未免疫攻毒組采集血清并利用IDEXXPRRSV抗體檢測試劑盒進(jìn)行抗體檢測，結(jié)果如圖12所示，根據(jù)該結(jié)果，PRRSVvJX143株攻毒后，可有效刺激機(jī)體的免疫記憶細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生更高水平的抗體。3.6試驗豬攻毒后的癥狀觀察試驗及對照組豬在PRRSVSX12株病毒接種后至用PRRSVvJX143株病毒攻毒后21天，每天進(jìn)行癥狀觀察。根據(jù)觀測結(jié)果，試驗組在接種PRRSVSX12株病毒后未出現(xiàn)可觀察到的癥狀反應(yīng)；PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接種組5頭中有兩頭出現(xiàn)輕微的呼吸癥狀和咳嗽，未出現(xiàn)典型的腹式呼吸；而對照組5頭豬則出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸癥狀和咳嗽，呈現(xiàn)典型的腹式呼吸；并有一頭豬在攻毒后14天死亡。3.7試驗豬的各組織器官的病理學(xué)觀察在PRRSVvJX143株病毒攻毒后21天，剖殺試驗組和對照組的仔豬，其中對照組5頭豬均出現(xiàn)肺臟水腫，部分豬出現(xiàn)有壞死；其中2頭豬出現(xiàn)心、肺粘連和腹膜炎；全部豬腹股溝淋巴結(jié)和扁桃體淋巴結(jié)出現(xiàn)不同程度的出血；部分豬肝臟出現(xiàn)有黃白色的壞死灶；部分豬脾臟出現(xiàn)邊緣性梗死；腎臟很少見到出血點，部分豬腦有出血，但未見腸道等消化系統(tǒng)的病變。而試驗組仔豬，除2頭仔豬出現(xiàn)輕微的肺部水腫外，未見到其他組織器官眼觀病理變化。同時，觀察其肺部病變，根據(jù)HalburPG，PaulPS，F(xiàn)reyML，etal，ComparisonofthepathogenicityoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.VetPathol，1995，32:648-660.的方法，對肺部的肺炎病變進(jìn)行評估，結(jié)果如表2所示。表2、PRRSVSX12株肺臟的病理學(xué)評價<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注表中數(shù)據(jù)為肺炎病變部位占整個肺臟比例百分比的平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差；其中，"ND"指沒有評價，a為SX12株免疫攻毒后5頭豬的肺臟的病理學(xué)評價，b為未免疫組攻毒后14天死亡豬的肺臟的病理學(xué)評價，c為未免疫組攻毒后21天剖殺其余4頭豬的肺臟的病理學(xué)評價。根據(jù)表2的評價結(jié)果，PRRSVSX12株免疫組肺部病變得分為12.00±8.37，遠(yuǎn)低于未免疫對照組的肺部病變得分(55.00±12.91)，說明PRRSVSX12株對成活豬保護(hù)性也很高，肺部病變輕微，說明該毒株對強(qiáng)毒的攻擊有良好的保護(hù)作用。在實施例3中，對構(gòu)建的藍(lán)耳病嵌合病毒SX12株對29日齡仔豬進(jìn)行了免疫保護(hù)性試驗，其中SX12株病毒接種組在接種SX12后，未出現(xiàn)明顯的體溫反應(yīng)和呼吸癥狀，說明該PRRSVSX12對豬致病力很低，PRRSV抗體在SX12株免疫后10天開始上升，14天達(dá)到并超過陽性水平(ELISAS/P〉0.4)，說明該PRRSVSX12對豬有良好的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在攻毒PRRSVvJX143株后，SX12株病毒接種組出現(xiàn)一過性體溫升高，出現(xiàn)輕微的呼吸癥狀，剖檢各組織臟器未出現(xiàn)明顯的病理變化；而未免疫攻毒組則持續(xù)更長時間的體溫升高，出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸癥狀和咳嗽，呈現(xiàn)典型的腹式呼吸；剖檢可見典型的肺部病理變化，其他組織臟器部分可見典型的損傷，說明PRRSVSX12株免疫后可抗擊強(qiáng)毒PRRSVvJX143株的攻擊，具有明顯的保護(hù)作用。綜上所述，基于發(fā)病豬場獲得的血清中分離出來的病毒構(gòu)建的全長感染性cDNA質(zhì)粒pJX143及其拯救出來的病毒具有和野生親本毒相似的生物學(xué)特性和動物宿主的感染力和致死率。而且后續(xù)的試驗證實，該重組質(zhì)粒確實是引起這次"豬無名高熱"的主要指病病原。基于上述重組質(zhì)粒，構(gòu)建了數(shù)株疫苗候選株(pSX12，p5NX12，p56N12)，其中的一株疫苗株pSX12對豬體具有較好安全性，免疫后可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生機(jī)體免疫，并提供豬體免疫保護(hù)作用，對"豬高致病性藍(lán)耳病"的免疫保護(hù)率高達(dá)100%，安全有效。序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所〈120〉高致病性豬藍(lán)耳病病毒重組質(zhì)粒和遺傳工程疫苗〈130〉P5071073〈160〉9〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉2600<212>DNA〈213〉藍(lán)耳病病毒〈400〉1atgacgtataggtgttggctctatgccacggcatttgtattgtcaggagctgtgaccatt60ggcacagcccaaaacttgctgcacgggaacaccctcctgtgacagccctcttcaggggga120ttaggggtctgtccctaacaccttgcttccggagttgcactgttttacggtctctccacc180cctttataccatgtctgggatacttgatcggtgcacgtgtacccccaatgctggggtgttt240gtggcggagggccaggtctactgcacacgatgtctcagtgcacggtctctccttcctctg300aatctccaagttcctgagcttggggtgttgggttttttttataggcccgaagagccactc360cggtggacgttgccacgtgctttccccactgtcgagtgctcccccgccggggcctgttgg420ttttctgcgatttttccgattgcscgaatgactagtg犯aacctgaactttc犯c犯aga480atggtgcgggtcgcagctgaaatctacagacccggccaactcacccctacagttctaaag540actctacaagtttalgaacggggttgtcgctggtaccccattgtcgggcccgtccctggg600gtgggcgtttaicgccaactccctgaatgtgagtgacaaacctttcccgggagcaactcat660gtgttaaccaacttgccgctcccgcagaggcccaaacctgaggacttttgcccttttgag720tgtgctatggctgacgtctatgacattggtcgtggcgctgtcatgtatgtggccggagga780aaggtctcttgggcccctcgtggtgggaatgaagtgaaatttgaacctgttcccaaggag840ttgaagttggttgcgaaccgactccacacctccttcccgccccatcacgtagtggacatg900tccgagtttaccttcatgacccctgggagtggtgtctccatgcgggttgagtaccaatac960ggctgcctccctgctgacactgtccctgaaggaaactgctggtggcgcttgtttgactcg1020ctcccaccggaagttcagtacaaagaaattcgccatgctaaccaatttggctatcaaacc1080aagcatggtgtccctggcaagtacctacagcggaggctgc犯gttaatggtcttcgggca1140gtgaccgacacacatggacctatcgtcatacagtacttctctgttaaggagagttggatc1200cgccacctgaagttggtggaagaacccagcctccccgggtttgaggatctcctcagaatc1260agggttgagcccaatacgtcaccactggctagaaaggatgagaagattttccggtttggc1320agtcataagtggtacggtgccggaaagagagcaaggaaaacacgctctggtgcgactact1380atggtcgctcatcacgcttcgtccgctcatgaaacccggcaggccacgaagcacgagggt1440gccggcgctaacaaggccgagcatctcaagcgctactctccgcctgccgaagggaactgt1500ggttggcactgcatttccgccatcgccaaccggatggtgaattccaactttgagaccacc1560cttcctgaaagggtaaggccttcagatgactgggccactgacgaggatcttgtgaacacc1620atccaaatcctcaggctccctgcggccttggacaggaacggcgcttgcggtagcgccaag1680tacgtgcttaaactggagggtgagcattggactg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