專利名稱：：調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的蛋白編碼序列，特別是一種調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列。
背景技術(shù)：
：水稻是人類最主要的糧食作物之一，世界上約有一半的人口以稻米為主要糧食。中國稻作面積約占全世界的23%，稻谷產(chǎn)量占全世界的37%左右。中國的水稻播種面積占全國糧食作物播種面積的30%，而總產(chǎn)量卻占糧食作物產(chǎn)量的42%以上，單位面積產(chǎn)量比整個糧食作物平均高出45.17%,其中一個重要的原因就是水稻雄性不育與雜種優(yōu)勢的廣泛應(yīng)用發(fā)揮了舉足輕重的作用。水稻雜種優(yōu)勢現(xiàn)象由Jones(1926)提出。20世紀(jì)50年代以來，國內(nèi)外相繼開展秈粳稻雜交育種研究，印度、日本、美國、國際水稻研究所(IRRI)等的一些科學(xué)家開展了水稻雜種優(yōu)勢利用研究，但未能應(yīng)用于生產(chǎn)。楊守仁等(1959，1962)的研究結(jié)果表明，秈粳稻雜交后代結(jié)實率可通過選擇提高到正常水平。1970年，李必湖在海南島崖縣找到野生稻(O.rufipogon)雄性不育株(簡稱野敗)，為培育雜交水稻打開了突破口。隨后開展了以袁隆平為攻關(guān)主將的全國協(xié)作研究，于1973年實現(xiàn)三系配套，并相繼選配出強優(yōu)勢秈型雜交水稻組合及攻克制種技術(shù)關(guān)，1976年雜交水稻開始大面積推廣。雜交水稻的育成是水稻育種史上的一次重大突破，它打破了水稻等自花授粉作物沒有雜種優(yōu)勢的傳統(tǒng)觀念，大大豐富了作物遺傳育種的理論和實踐，特別是這一重大成果的應(yīng)用，給我國的水稻生產(chǎn)帶來了一次飛躍，使水稻單產(chǎn)在矮稈良種的基礎(chǔ)上提高20%左右，取得了巨大的社會、經(jīng)濟效益。而水稻雄性不育系資源的發(fā)掘及應(yīng)用是有效利用雜種優(yōu)勢的前提和基礎(chǔ)。目前在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的水稻雄性不育系包括受核基因控制的溫光敏核不育株系，以及受核質(zhì)基因共同控制的一系列細胞質(zhì)雄性不育株系(cytoplasmic腿lesterility,簡稱CMS)。世界人口增長與土地資源的有限性破使科學(xué)家們尋找新的提高水稻產(chǎn)量、質(zhì)量的方法，兩系法雜交水稻就是一種有效的方法。二系法利用水稻雜種優(yōu)勢是我國首創(chuàng)，大面積應(yīng)用于上世紀(jì)九十年代，利用了光溫敏不育系水稻為基本材料培育。這種水稻在夏季，長日照、高溫下，表現(xiàn)為雄性不育，可以用來生產(chǎn)雜交種子；在秋季、短日照、低溫下又變成了正常的水稻，可以繁殖自身種子。這種雜交水稻因為只有不育系(母本)、和恢復(fù)系(父本)、而不需要保持系(中間體)，所以稱兩系法雜交水稻。因為二系稻比三系稻的具有質(zhì)量更好，品質(zhì)更優(yōu)，產(chǎn)量更高的特點。然而光溫敏不育系的育性變化受光溫條件特別是溫度條件的影響，不育系不育光溫臨界值低，制種安全而繁種較困難，因而不育系的安全制種與良種繁種是一對矛盾。因此，水稻光溫敏核不育新種質(zhì)，特別是高溫可育，低溫不育的新型突變體的選育是實現(xiàn)二系法的關(guān)鍵，相應(yīng)調(diào)控蛋白序列的克隆具有廣闊的應(yīng)用前景。而目前至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列，并可以利用該蛋白產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，用來生產(chǎn)雜交種子，開展輪回選擇和創(chuàng)造基因庫，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:本發(fā)明所提供的一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有水稻0sMS4蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列。所述的序列具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。所述的序列具有SEQIDNO.l中從核苷酸第l-798位的核苷酸序列。本發(fā)明所分離出的調(diào)控水稻溫光敏核不育的蛋白質(zhì)活性的多肽，它包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO.2序列的多肽。在本發(fā)明還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，它是真核細胞。在實例中該宿主細胞是水稻。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語"調(diào)控水稻溫光敏核不育的蛋白(或多肽)編碼序列"指編碼具有調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第1-798位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.1序列的編碼框第1-798位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.1中第1-798位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.1所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第1-798位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO.1中從核苷酸第1-798位的核苷酸序列的同源性至少70%,較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的調(diào)控水稻溫光敏核不育的相同功能的蛋白的SEQIDNO.2中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地I-IO個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白或多肽"指具有調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白活性的SEQIDNO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白相關(guān)相同功能的、SEQIDN0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與水稻溫光敏不育發(fā)育相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用水稻溫光敏不育相關(guān)多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，"調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO.2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。發(fā)明還包括調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然調(diào)控水稻溫光敏核不育相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的水稻溫光敏不育相關(guān)多肽時，可以將調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成調(diào)控水稻溫光敏核不育相關(guān)蛋白表達載體。如本發(fā)明所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細胞"為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、水稻細胞和其它植物細胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析調(diào)控水稻溫光敏核不育基因產(chǎn)物的表達，即分析調(diào)控水稻溫光敏核不育的RNA轉(zhuǎn)錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。此外，本發(fā)明所述的的DNA分子是一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。該分子可用作探針，通常具有調(diào)控水稻溫光敏核不育基因的核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼調(diào)控水稻溫光敏核不育相關(guān)的核酸分子。此外，根據(jù)本發(fā)明的調(diào)控水稻溫光敏核不育基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選調(diào)控水稻溫光敏核不育相關(guān)同源基因或同源蛋白。本發(fā)明的調(diào)控水稻溫光敏核不育相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。本發(fā)明是利用Y射線對粳稻9522品系進行處理，種植后在F2代挑選花藥發(fā)育異常的突變體，挑選分離比為3:1的隱性單基因突變體為研究對象。獲得一新的水稻隱性雄性不育突變體osms4。通過遺傳定位方法，首先將突變基因座位定位在水稻第l染色體InDel標(biāo)記0S104和0S106之間。進一步精細定位，在0S104和0S106之間發(fā)展了8對有多態(tài)性InDel分子標(biāo)記，將該基因座位定位在ZH134和ZH138之間，物理距離為23kb。對在這一范圍內(nèi)TIGR(http:〃www.tigr.org)，預(yù)測分析有2個基因，核酸測序結(jié)果表明，其中一個MYB基因的第一個外顯子在突變體中發(fā)生了一個核苷酸的缺失和一個G到A的顛換，該MYB基因的突變造成了植株的雄性不育。已知的文獻報道表明，MYB家族在植物中是一個很大的轉(zhuǎn)錄因子家族，它們在植物生長的許多方面，如參與對植物激素的應(yīng)答，控制植物細胞的形態(tài)和模式建成，參與調(diào)節(jié)植物苯丙垸類次生代謝途徑等等。除此之外，MYB基因家族成員也參與了植物雄性發(fā)育的過程，例如AtMYB32，AtMYB103，AtMYB26，OsGAMYB，HvGAMYB等，這些基因的突變都將導(dǎo)致雄性不育，本研究發(fā)現(xiàn)的MYB基因是新發(fā)現(xiàn)的在水稻中參與植物雄性發(fā)育過程的基因。將這個基因命名為0sMS4(0ryzasativaLMaleSterile4)基因。通過對花藥不育突變體osms4花器官發(fā)育各時期進行組織切片、掃描電鏡、染色體觀察，發(fā)現(xiàn)該基因的突變會導(dǎo)致水稻小孢子發(fā)育停滯在雙核早期；通過啟動子加分子標(biāo)記GUS分析表明0sMS4基因在花藥、穎殼、心皮以及根等的維管束中特異表達；半定量RT-PCR也表明0sMS4基因在花、根中特異性表達，在莖、葉中均不表達；生理生化實驗分析表明突變體成熟花粉粒內(nèi)無淀粉積累；互補實驗顯示0sMS4基因可以恢復(fù)突變體的表型。說明該基因功能確實是影響到水稻的花粉發(fā)育，這種影響可能是通過調(diào)節(jié)花藥組織中淀粉及其衍生物的運輸來實現(xiàn)。本發(fā)明在發(fā)掘和利用水稻溫光敏核不育方面具有明顯的作用，可以產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，用來生產(chǎn)雜交種子，開展輪回選擇和創(chuàng)造基因庫，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。圖losms4突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察示意圖其中A左邊BDF為野生型9522，A右邊CEG為osms4突變體。圖2osms4突變體育性與溫光環(huán)境的關(guān)系示意圖。圖30sMS4座位定位示意圖。圖40sMS4基因組序列示意圖其中箭頭表示突變位點。圖5osms4突變體恢復(fù)表型及野生型9522RNAi的示意圖其中A為9522，B為osms4，C為osms4互補轉(zhuǎn)基因植株，D為反義轉(zhuǎn)基因植株。圖6osms4突變體和野生型9522花藥組織切片示意圖其中AB為野生型9522，CD為突變體osms4。圖7osms4突變體和野生型9522糖運輸差異示意圖。具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:osms4突變體植株的獲得和形態(tài)學(xué)的觀察該突變體是本實驗室用6°CoY射線誘變粳稻9522種子，處理劑量為280Gy。對誘變的F2代中一雄性不育突變體三代回交，獲得隱性單基因調(diào)控的穩(wěn)定遺傳的突變體osms4。所有植物材料種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地。osms4突變體與粳稻9522回交，F(xiàn)l代全部為可育，自交F2代中出現(xiàn)分離，其中正常植株為189，突變株為55，正常植株與突變植株比例接近3:l(x2二0.79口口>(°°5口3.84)，表明該雄性不育突變體表型由一個單核基因突變造成。對osms4突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察。如圖1，野生型和突變型osms4的表型對比顯示osms4突變型(右)比野生型(左)矮(A)，野生型(B，D)顯示為黃色花藥，突變型osms4(CE)顯示白色花藥。突變型osms4(G)的柱頭比野生型(F)大。實施例2:osms4突變體育性與溫光環(huán)境關(guān)系的研究一、大田實驗通過2005至2007年連續(xù)三年對osms4的育性轉(zhuǎn)換規(guī)律觀察(上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，發(fā)現(xiàn)三年的不育期、可育期時間基本一致2005年，從8月20號見穗起到8月26號植株沒有結(jié)實，表現(xiàn)為不育，8月27號一9月5號花粉?？捎矢?，其中8月27-9月l號未套袋，結(jié)實率近100%，9月2號_9月5號套袋結(jié)實率最高達到60%，9月6號以后套袋沒有結(jié)實。2006年，從8月20號見穗起到8月30號套袋不結(jié)實。8月3卜9月2號見穗花粉?？捎矢撸状Y(jié)實，9月3號以后套袋沒有結(jié)實。2007年，從8月20號見穗起，至IJ8月28號套袋不結(jié)實，表現(xiàn)不育，8月29—9月l號花粉?？捎矢?，套袋結(jié)實，表現(xiàn)可育，9月2號以后套袋沒有結(jié)實，表現(xiàn)為不育。圖2為2005至2007年8月1號一8月31號每天平均溫度，從中可以看到從可育期(8月31號前后)向前12-20天平均溫度高，其中向前12天左右以及20天左右3年中平均溫度都高于30度?？梢妎sms4突變體為新型反溫光敏核不育材料，即高溫短日照可育。2004至2006年連續(xù)三年在海南種植，12月份播種，次年3月份見穗，都表現(xiàn)為不育。二、控溫條件下的育性表現(xiàn)2007年在國家雜交水稻工程技術(shù)研究中心進行了育性轉(zhuǎn)換溫度鑒定試驗。初步結(jié)果表明osms4突變體可育條件為溫度為27—37攝氏度，平均30.5度，光照12小時。以上數(shù)據(jù)表明，osms4突變體在高溫，短日照的情況下育性發(fā)生轉(zhuǎn)變，可以自交結(jié)實，是一種具有具大應(yīng)用潛力的新型的可用于二系雜交水稻育種的材料。實施例3:0sMS4基因的定位和克隆(1)定位群體。將osms4與秈稻品系龍?zhí)馗雜交，自交獲得F2代，選擇其中為雄性不育植株為定位群體。(2)水稻認A提取。采用改進的CTAB法。簡單步驟如下取葉片O.1-0.2克(約半片)放到小研缽中，加入適量的液氮,立刻研磨至粉狀，裝入2ml離心管，加入700ul10(TC預(yù)熱的1.5xCTAB溶液于離心管中，小心混勻后放入56'C水浴，20分鐘后取出離心管，加入等體積氯仿/異戊醇，猛烈混勻，離心(13000rpm)10分鐘，取上清于新管中，加入900ul無水乙醇混勻后一20。C放半小時以上。將析出的DNA離心，14000rpm(IO分鐘)。去掉上清，將沉淀用lml70。/。乙醇清洗一次，離心干燥，溶于200ul1/10TE或水中，4。C冰箱保存。(3)InDel分子標(biāo)記分析。InDel分子標(biāo)記設(shè)計是根據(jù)比較粳稻日本晴秈稻9311兩品系的已公布的核苷酸序列，對差異的部分設(shè)計引物，驗證2個親本粳稻9522和秈稻龍?zhí)馗之間的多態(tài)性，PCR擴增程序為10ul體系中，lul模板，lul10pmol/ulPrimerl，lul10pmol/ulPrimer2，lul10XBuffer(Mg2+)，lul2mMdNTP，0.lulTaq，3.9ul水。通過6。/。的PAGE膠電泳，銀染方法檢測。(4)群體分離分析(bulkedsegregantanalysis)初定位方法。用132對標(biāo)記進行擴增反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)l號染色體上的標(biāo)記ZH104與0sMS4座位相聯(lián)鎖.選取附近的標(biāo)記ZH106,在F2代分離群體進行進一步驗證，都與0sMS4有連鎖關(guān)系，并且初步將0sMS4定在ZH104和ZH106之間。為進一步定位0sMS4座位，擴大F2代群體到3000株，從中得到用于定為突變體750株.在ZH104和ZH106之間發(fā)展了8個InDel標(biāo)記(表l)，最終將0sMS4座位定位在ZH134和ZH138之間(圖3).通過在網(wǎng)上(http:〃www.tigr.org)下載的粳稻日本晴第2號染色體拼接的序列，分析ZH134和ZH138兩標(biāo)記別位于克隆AP00837上，物理距離為23kb(圖3)。用分子標(biāo)記對定位群體中的雄性不育單株進行基因型分析，利用M鄰DrawV2.l構(gòu)建目標(biāo)基因區(qū)域的分子標(biāo)記的連鎖圖譜。表l如下表lInDel分子標(biāo)記及其核酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(5)0sMS4基因的克隆。對23kb范圍內(nèi)的預(yù)測的MYB家族的基因測序，測序結(jié)果表明，突變體中在這個基因的第一個外顯子上發(fā)生了一個核苷酸的缺失和一個G到A的顛換，從而造成突變(圖4)。最終從克隆AK107461上(由RiceGenomeResourceCenter(RGRC)提供)分離到0sMS4基因全長cDNA(詳見:0sMS4基因的全長cDNA序列)。PCR引物:0sMS4—lF:5，-ATGGCTCACGAGATGATGGGTGGC-3，;0sMS4-lR:5，-TCATGTCGCGCCGACGCCGAGG-3，。PCR反應(yīng)程序94。C5min;l次；94。C30sec，55°C30sec;72°C30sec;34次，72°C5min，l次。實施例4:0sMS4基因的功能分析為了進一步驗證這個基因的功能，構(gòu)建了基因互補的載體，并轉(zhuǎn)化突變體植株，觀察突變體表型是否能夠被恢復(fù)。所用引物為MYBF:5'-AGATCTGCTATGCACCTAGACGAGTGTTGTC-3，；MYBR:5'-GAATTCGTGACCACTGAGCAAGGAGTAGCTC-3'，以粳稻9522的基因組DNA為模板擴增一個4318bp的片斷，其中包括0sMS4基因全長、啟動子和終止子。將這個片斷直接用PmaCI和BamHI雙酶切后回收片斷，連入相同酶切的pCAMBIA1301載體，測序驗證正確，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，使用遺傳手段轉(zhuǎn)化到osms4突變體中，以觀察是否會引起植株恢復(fù)野生型性狀。圖5顯示osms4突變體恢復(fù)表型花藥變成黃色，進一步用RNAi的方法將野生型中0sMS4基因沉默，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)突變體的表型，花藥變成白色。可見所克隆的0sMS4基因是引起osms4突變體表型的基因。通過對花藥不育突變體osms4花器官發(fā)育各時期進行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)0sMS4基因的突變會導(dǎo)致水稻在小孢子不能發(fā)育成正常的成花粉粒，沒有淀粉積累(圖6)。說明0sMS4基因是調(diào)控水稻雄性不育的基因，對花藥組織中淀粉及其衍生物運輸?shù)恼{(diào)節(jié)是其可能的調(diào)控途徑。實施例5:osms4突變體糖運輸異常示意圖將突變體與野生型花序浸泡在含有C-14標(biāo)記蔗糖的水溶液中12小時左右，然后分別測定花藥與穎殼分離中同位素的含量。結(jié)果表明從小孢子時期到成熟期，突變體花藥、穎殼檢測到的同位素含量都小于野生型。這說明突變體中糖的運輸出現(xiàn)異常(見圖7)?？傊景l(fā)明通過一新的水稻隱性雄性不育突變體osms4，通過遺傳定位方法,分離到一個新的調(diào)控水稻溫光敏核不育蛋白及其基因序列，該蛋白在調(diào)控水稻溫光敏核不育方面具有明顯的作用，可以利用該基因通過遺傳工程的手段產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，用來生產(chǎn)雜交種子，開展新型二系雜交水稻、輪回選擇和創(chuàng)造基因庫，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用潛力。本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下:(1)SEQIDNO.1的信息〈110>上海交通大學(xué)<120〉調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列<130〉無〈160〉1〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉798〈212〉DNA<213>水稻(0ryzasativa)〈400〉1atggctcacg卿tgatgggtggcttcttcggccatccgccgccgccgcctgcgacggcg60gcggtgggtgaggagg鄉(xiāng)acg鄉(xiāng)tggtggagg卿cggaggagggtggccatggcgga120ggagttcagggg卿ctttgCgCg鄉(xiāng)gg3cactggcggcCggCgg鄉(xiāng)3cgccaagctc180aaggacctcgtcgcgcagtacggcccccagtcatcgccgagaagctcgac240ggc,tcaggg卿agctgcaggctgaggtggttcaaccagctggacccg3ggattaac300cgg兆ggcgttcacggaggagg3gg3ggagcggctcatggcggcgcaccgggCgt3CggC360咖aagtgggcgctcatcgcccgcctcttccccggccgcaccgacaacgccgtcaagaac420cactggcacgtcctcatggcgcgccgccaccgcgagcagtccggcgccttccgccgccgc480aagccttcctcctcctccgcctcccccgcccccgcccccgcgccgccgccgccgccgcag540cccgtcgtcgcgctccaccaCC3CC3CC3Ccggtactcgccgggtacagc600ggcgccgccg3gtCCg3CgElgtcggcctccacctgcaccaccgacctctccctcagctcc660ggcagcgccgcggccgccgccgccgccgccgcggcggcgsacatcccctgctgcttctac720c兆cgcggcggcgcccaagcC3CC3CCg3Ctccccttcttcgacttcctc780ggcgtcggcgcgacatga798(2)SEQIDNO.2的信息<110>上海交通大學(xué)〈120〉調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列〈130〉無<160>1〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉265<212〉PRT〈213〉水稻(0ryzasativa)〈400〉1MAHEMMGGFFGHPPPPPATAAVGEEEDEVVKDLVAQYGPQ,LIAEKLDGRSGKSCRLRNKWALIARLFPGRTDNAVKNHWHVLMAR朋PVVALH腿HRYSQQYSGYSGAAESDESASQRGGAQATTDSHTIP卿FLGVGATEETEEGGHGGGVQGKLCARGHWRPAEDAKL60WFNQLDPRINRRAFTEEEEERLMAAHRAYG120REQSGAFRRRKPSSSSASPAPAPAPPPPPQ180TCTTDLSLSSGSAAAAAAAAAMNIPCCFY24026權(quán)利要求1、一種調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列，其特征在于，所提供的一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有水稻OsMS4蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第1-798位的核苷酸序列。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列，其特征是，所分離出的調(diào)控水稻溫光敏核不育的蛋白質(zhì)活性的多肽，它包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列，其特征是，所述的的DNA分子是一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。全文摘要一種調(diào)控溫光敏核不育的蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有水稻OsMS4蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的序列具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽，所述的序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第1-798位的核苷酸序列。本發(fā)明在發(fā)掘和利用水稻溫光敏核不育方面具有明顯的作用，可以產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，用來生產(chǎn)雜交種子，開展新型二系雜交水稻、輪回選擇和創(chuàng)造基因庫，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。文檔編號C12N15/29GK101186919SQ20071017259公開日2008年5月28日申請日期2007年12月20日優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日發(fā)明者輝張,張大兵,梁婉琪,政袁申請人:上海交通大學(xué)