專利名稱：一種利用秸稈細(xì)胞壁蛋白構(gòu)建的高效纖維素酶解體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于纖維素酶解發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用秸稈細(xì)胞壁蛋白和 木霉纖維素酶之間的協(xié)同作用，構(gòu)件的纖維素高效酶解體系及其在木質(zhì)纖維素降 解中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的可再生資源，也是生產(chǎn)生物能源、化工產(chǎn)品 的重要原料。木質(zhì)纖維素具有極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，除了纖維素以外，仍然有大量的 半纖維素、木質(zhì)素、膠質(zhì)、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪酸等存在。木質(zhì)纖維素的酶解 是其轉(zhuǎn)化的中心環(huán)節(jié)，盡管進(jìn)行了廣泛的研究，然而轉(zhuǎn)化效率仍然較低。天然纖 維素通常由纖維束組成，平行排列的纖維束通過氫鍵和范德華力緊密結(jié)合在一 起，形成了極其致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。由于木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素的存在，纖維素酶可 以與之通過非共價鍵產(chǎn)生非特異結(jié)合，這大大降低了纖維素酶的利用效率。從木 質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟(jì)可行性角度分析，木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)、木 質(zhì)素對纖維素酶的非特異性吸附和和高昂的纖維素酶成本是其高效轉(zhuǎn)化的瓶頸， 也是實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)亟待解決的問題。
目前纖維素酶主要來源于微生物，而植物內(nèi)源性纖維素酶解體系沒有得到重 視。植物細(xì)胞壁中存在比較豐富的酶蛋白，在植物生長的各個階段，酶蛋白參與 了細(xì)胞壁的松弛、合成、分解等過程。與其它來源的纖維素酶相比，植物內(nèi)源性 細(xì)胞壁酶蛋白對細(xì)胞壁的作用具有高效、基因調(diào)控復(fù)雜等特點(diǎn)。植物收獲后的秸 稈仍然處于生理上的衰老階段，其中也存在比較豐富的細(xì)胞壁酶蛋白，它們對該 階段細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化也起重要作用。盡管從已經(jīng)植物生理角度對細(xì)胞壁酶蛋白 進(jìn)行了一定的研究，然而其在木質(zhì)纖維素降解中的潛在價值及其應(yīng)用迄今沒有研 究。
本發(fā)明從對纖維素降解具有促進(jìn)作用的秸稈細(xì)胞壁蛋白入手，從新的角度分 析和解決木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化中的瓶頸問題。分別從秸稈細(xì)胞壁中分離出了具有氫鍵斷裂作用的蛋白Zeal，具有改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的蛋白Zea2， (1， 3),(1， 4)-fi-葡聚
糖外切酶、e-葡萄糖苷酶、e-葡聚糖內(nèi)切酶、木聚糖酶和果膠酶。在分析上
述酶蛋白與木霉纖維素酶相互作用的基礎(chǔ)上，充分利用各組分之間的協(xié)同作用， 構(gòu)建了一種新型高效的纖維素酶解體系。植物秸稈資源豐富，將秸稈細(xì)胞壁蛋白 應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的降解，不僅提高了纖維素的酶解效率，也為降低纖維素酶的 成本開辟了嶄新的方向，而且實(shí)現(xiàn)了資源的高值化利用，達(dá)到了利用植物自身資 源高效降解的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種利用秸稈細(xì)胞壁蛋白與木霉纖維素酶之間的協(xié)同作用，構(gòu)建 纖維素高效酶系的方法及其在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用。
本發(fā)明的構(gòu)思如下在植物的衰老過程中，仍然有豐富的細(xì)胞壁蛋白，它們 參與了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化的調(diào)節(jié)。以秸稈為原料，分離到了纖維素酶具有協(xié)同作用
的非水解性蛋白Zeal和Zea2; (1， 3),(1， 4)-B-葡聚糖外切酶、B-葡萄糖苷酶、 B-葡聚糖內(nèi)切酶、木聚糖酶和果膠酶。蛋白Zeal能夠削弱或打斷纖維素內(nèi)部的 非共價鍵，使底物變的疏松，從而使纖維素酶更容易與其結(jié)合；蛋白Zea2能夠 與木質(zhì)素反應(yīng)，減少木質(zhì)素與纖維素酶的非特異性結(jié)合。利用秸稈細(xì)胞壁蛋白與 木霉纖維素酶之間的協(xié)同作用，開發(fā)了新型纖維素酶解體系。
一種利用秸稈細(xì)胞壁蛋白構(gòu)建的高效纖維素酶系及其在木質(zhì)纖維素降解中 的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟
1. 玉米秸稈細(xì)胞壁總蛋白的提取將秸稈置于l-2倍的研磨緩沖液中研磨，過 濾后濾渣置于提取緩沖液中，然后過濾；液體即為細(xì)胞壁總蛋白?？偟鞍字邪?br> 括植物內(nèi)源性纖維素酶(i， 3)，(1， 4)-B-葡聚糖外切酶、e-葡萄糖苷酶和e-
葡聚糖內(nèi)切酶；與纖維素酶具有協(xié)同作用的蛋白Zeal和Zea2;具有酶解非 纖維素組分的木聚糖酶和果膠酶，它們能夠提高底物中纖維素的可及性。
2. 蛋白Zeal、 Zea2的分離、純化將l)中得到的粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨 沉淀，DEAE-瓊脂糖(圖1A)和葡聚糖GJ5 (圖1B)層析，得到蛋白Zea 1， 分子量為60.2kDa (圖3)。將l)中得到的粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，Phenyl-Superose HR 5/5 (圖2A)和葡聚糖G-75 (圖2B)層析，得到蛋白Zea 2，分子量為39.6kDa (圖4) 。 Zeal能夠打斷底物中的氫鍵，使底物變得 疏松，從而提高底物的可及性。Zea2能夠改變木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，減少木質(zhì)素與 纖維素酶的非特異性結(jié)合。
3. 利用蛋白Zea 1酶解純纖維素酶解在醋酸緩沖液(100 mM, pH 4.5)中， 40-50。C下進(jìn)行；在酶解體系中，每克底物加入100-200微克蛋白Zea 1和10-30 FPU木霉纖維素酶。其中以濾紙為底物時的酶解曲線如圖5所示，。
4. 利用細(xì)胞壁總蛋白酶解純纖維素酶解在醋酸緩沖液(IOO mM, pH 4.5)中， 40-50°C下進(jìn)行;在酶解體系中，每克底物加入1-2毫克粗細(xì)胞壁蛋白和10-30 FPU纖維素酶。
5. 利用蛋白Zeal、Zea2酶解木質(zhì)纖維素酶解在醋酸緩沖液(IOO mM， pH 4.5) 中，50。C下進(jìn)行；在酶解體系中，每克底物分別加入200-300微克Zea 1、 500-700微克Zea 2和10-30 FPU纖維素酶。以蒸汽爆破預(yù)處理的玉米秸稈為 底物時的酶解曲線如圖6所示。
6. 利用粗細(xì)胞壁蛋白酶解木質(zhì)纖維素酶解在醋酸緩沖液(100mM,pH4.5)中， 40-50°C下進(jìn)行;在酶解體系中，每克底物加入3-5毫克粗細(xì)胞壁蛋白和10-30 FPU纖維素酶。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1) 秸稈細(xì)胞壁蛋白與纖維素酶具有協(xié)同作用，可以大幅度提高纖維 素的轉(zhuǎn)化率，節(jié)約纖維素酶的用量。
2) 秸稈細(xì)胞壁蛋白來源豐富，這既保證了充足的原料供應(yīng)，又實(shí)現(xiàn) 了秸稈資源的高效利用，達(dá)到了利用秸稈自身資源降解纖維素的 目的。


圖1A為蛋白Zeal的DEAE-瓊脂糖層析圖；圖1B為蛋白Zea2的葡聚糖 G-75層析圖；圖2A為蛋白Zea 2的Phenyl-Superose HR 5/5層析圖；圖2B為蛋白Zea 2的 葡聚糖G-75層析圖3為蛋白Zeal的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖； 圖4為蛋白Zea 2的SDS-PAGE圖5為濾紙酶解曲線圖6為蒸汽爆破預(yù)處理的玉米秸稈的酶解曲線具體實(shí)施例方式
實(shí)例l:利用秸稈細(xì)胞壁蛋白提高濾紙酶解效率
將玉米秸稈置于2倍體積的研磨緩沖液中研磨，過濾后濾渣置于提取緩沖液 中，然后過濾，得到粗細(xì)胞壁蛋白；將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，DEAE-瓊 脂糖和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea 1;濾紙酶解在醋酸緩沖液(100 mM, pH 4.5)中，50。C下進(jìn)行；在酶解體系中，每克濾紙加入15FPU木霉纖維素酶、150 微克Zea 1或1.8毫克粗細(xì)胞壁蛋白。
實(shí)例2:利用秸稈細(xì)胞壁蛋白提高廢棄紙張酶解效率
將玉米秸稈置于2倍體積的研磨緩沖液中研磨，過濾后濾渣置于提取緩沖液 中，然后過濾，得到粗細(xì)胞壁蛋白；將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，DEAE-瓊 脂糖和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zeal;廢棄紙張酶解在醋酸緩沖液(IOO mM， pH4,5)中，5(TC下進(jìn)行；在酶解體系中，每克濾紙加入20FPU木霉纖維素酶、 160微克Zea 1或2毫克粗細(xì)胞壁蛋白。
實(shí)例3:利用秸稈細(xì)胞壁蛋白提高玉米秸稈酶解效率
將玉米秸稈置于2倍體積的研磨緩沖液中研磨，過濾后濾渣置于提取緩沖液 中，然后過濾，得到粗細(xì)胞壁蛋白；將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，DEAE-瓊 脂糖和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea 1;將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀， Phenyl-SuperoseHR5/5和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea2;汽爆預(yù)處理玉米 秸稈的酶解在醋酸緩沖液(100mM，pH4.5)中，50。C下進(jìn)行；在酶解體系中，每 克濾紙加入20 FPU木霉纖維素酶，220微克Zea 1和600微克Zea 2或3毫克粗細(xì)胞壁蛋白。
實(shí)例4:利用秸稈細(xì)胞壁蛋白提高小麥秸稈酶解效率
將玉米秸稈置于2倍體積的研磨緩沖液中研磨，過濾后濾渣置于提取緩沖液 中，然后過濾，得到粗細(xì)胞壁蛋白；將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，DEAE-瓊 脂糖和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zeal;將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀， Phenyl-Superose HR 5/5和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea 2;汽爆預(yù)處理小麥 秸稈的酶解在醋酸緩沖液(100mM,pH4.5)中，50。C下進(jìn)行；在酶解體系中，每 克濾紙加入25 FPU木霉纖維素酶，250微克Zea 1和700微克Zea 2或4毫克粗 細(xì)胞壁蛋白。
實(shí)例5:利用秸稈細(xì)胞壁蛋白提高稻草酶解效率
將玉米秸稈置于2倍體積的研磨緩沖液中研磨，過濾后濾渣置于提取緩沖液 中，然后過濾，得到粗細(xì)胞壁蛋白；將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，DEAE-瓊 脂糖和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea 1;將粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀， Phenyl-Superose HR 5/5和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea 2;汽爆預(yù)處理稻草 的酶解在醋酸緩沖液(100mM,pH4.5)中，50°C下進(jìn)行；在酶解體系中，每克濾 紙加入25 FPU木霉纖維素酶，240微克Zea 1和600微克Zea 2或4.5毫克粗細(xì) 胞壁蛋白。
權(quán)利要求
1. 一種利用秸稈細(xì)胞壁蛋白構(gòu)建的高效纖維素酶解體系，其特征包括以下步驟1)秸稈細(xì)胞壁總蛋白的提取將秸稈置于1-2倍體積的研磨緩沖液中研磨，過濾后濾渣置于提取緩沖液中，然后過濾，液體即為細(xì)胞壁總蛋白，包括具有氫鍵斷裂作用的蛋白Zea1、具有改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的蛋白Zea2、(1，3)，(1，4)-β-葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖內(nèi)切酶、木聚糖酶和果膠酶；2)蛋白Zea1、Zea2的分離、純化將1)中得到的細(xì)胞壁總蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀、DEAE-瓊脂糖和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea1，分子量為57.6kDa；將1)中得到的粗細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀、Phenyl-Superose HR5/5和葡聚糖G-75層析，得到蛋白Zea2，分子量為39.6kDa；3)利用細(xì)胞壁總蛋白酶解純纖維素酶解在醋酸緩沖液(pH4.5)中，35-50℃下進(jìn)行；在酶解體系中，每克底物加入1-2毫克粗細(xì)胞壁蛋白和10-30FPU木霉纖維素酶；4)利用蛋白Zea1酶解純纖維素酶解在醋酸緩沖液(pH4.5)中，35-50℃下進(jìn)行；在酶解體系中，每克底物加入100-200微克Zea1和10-30FPU纖維素酶；5)利用細(xì)胞壁總蛋白酶解木質(zhì)纖維素酶解在醋酸緩沖液(pH4.5)中，35-50℃下進(jìn)行；在酶解體系中，每克底物加入3-5毫克粗細(xì)胞壁蛋白和10-30FPU纖維素酶；6)利用蛋白Zea1、Zea2酶解木質(zhì)纖維素酶解在醋酸緩沖液(pH4.5)中，50℃下進(jìn)行；在酶解體系中，每克底物分別加入200-300微克Zea1、500-700微克Zea2和10-30FPU纖維素酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述秸稈細(xì)胞壁蛋白的來 源包括玉米秸、稻草、豆秸、高粱秸和麥秸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的研磨緩沖液為醋酸緩沖液(pH 4.5-6.5), 0.5-1.5 mM EDTA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于:所述的提取緩沖液為15-30 mM C8H18N204S， 1-3 mM EDTA, 2-4 mM Na2S205， 0.5-1.5 M NaCl,0.5-2 mM苯甲基磺酰氟，pH 4.5-7.0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的純纖維素包括濾 紙、微晶纖維素和廢棄紙張;所述木質(zhì)纖維素包括玉米秸稈、稻草、 麥秸、高粱秸、豆秸、龍須草以及茅草。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用秸稈細(xì)胞壁蛋白構(gòu)建高效纖維素酶系的方法及其在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用。以秸稈為原料，利用秸稈細(xì)胞壁中的植物內(nèi)源性纖維素酶以及與纖維素酶具有協(xié)同作用的蛋白，構(gòu)建了新型纖維素酶解體系。蛋白Zea 1能夠通過打斷底物中的氫鍵，提高纖維素酶的可及性；蛋白Zea 2能夠改變木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，減少木質(zhì)素對纖維素酶的無效吸附。木聚糖酶和果膠酶能夠酶解非纖維素組分，提高纖維素的可及性。在木質(zhì)纖維素的酶解中，添加秸稈細(xì)胞壁蛋白不僅能夠大幅度提高纖維素的轉(zhuǎn)化率，還能夠降低纖維素酶添加量，達(dá)到了利用秸稈自身資源促進(jìn)纖維素降解的目的。
文檔編號C12P19/00GK101423853SQ200710176768
公開日2009年5月6日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者陳洪章, 韓業(yè)君 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所