專利名稱：：一種α-N-乙酰半乳糖胺酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種a-N-乙酰半乳糖胺酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1900年，Landsteiner首次發(fā)現(xiàn)ABO血型系統(tǒng)并提出同型輸血，為現(xiàn)代輸血醫(yī)學(xué)奠定了基礎(chǔ)，Landsteiner因此獲得1930年諾貝爾獎。I960年Witkins證明A朋的抗原決定簇是糖類，這一發(fā)現(xiàn)加深了人們對血型的認(rèn)識。近二十多年來，通過運(yùn)用其它學(xué)科先進(jìn)的分析方法，輸血醫(yī)學(xué)得到長足發(fā)展，在保障人民生命安全中發(fā)揮了巨大作用。然而，輸血安全和血液偏型仍是擺在我們面前的兩大難題。長期以來，因血型鑒定錯誤、識別錯誤等主客觀因素引起的錯誤輸血發(fā)生率居高不下，在科技發(fā)達(dá)的美國，錯誤輸血發(fā)生率達(dá)1例/1.2萬單位之多，其中，ABO血型不合的錯誤率為l例/3.3萬單位，死亡率約l例/80萬單位，是輸血死亡的首要原因，比輸血傳播疾病(如HIV、HBV等)發(fā)生率(l例/200萬單位)高得多。由于目前紅細(xì)胞的保存期僅6周，在遇到長節(jié)假日、寒暑假等情況時采血量大大減少，很容易出現(xiàn)某種血型RBC供應(yīng)告急而其它型RBC過剩甚至過期以至浪費(fèi)的偏型現(xiàn)象。血液偏型不僅危及需要輸血患者的生命安全，還造成巨大的浪費(fèi)，美國統(tǒng)計(jì)達(dá)6%之多，這對本來就不充裕的血源來說無疑是雪上加霜。人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)至少有29種，以ABO和Rh血型系統(tǒng)對輸血安全最為重要。O型RBC不含A或B抗原，在他D血型匹配的前提下，可安全地輸給A、B、AB或0型的受血者，因此又被稱為"通用型RBC"。應(yīng)用通用型RBC可以極大的降低因ABO血型不合所致的輸血反應(yīng)，提高輸血的安全性；解決血液偏型難題、減少血液浪費(fèi)；簡化血液采集、儲存和配型程序，提高血站和醫(yī)院輸血科的工作效率，輸血成本可節(jié)省近9%，據(jù)報(bào)道美國每年可節(jié)約7億美元，保守估計(jì)我國每年可節(jié)約3億元。美國紅十字會血液中心科學(xué)主管Garratty預(yù)計(jì)未來幾年內(nèi)有望將A、B或AB型RBC轉(zhuǎn)變成O型，屆時將只儲存和使用O型RBC，這將是輸血醫(yī)學(xué)的一場革命。此外，在戰(zhàn)爭、恐怖襲擊、巨大災(zāi)難和其它突發(fā)事件中，及時安全的輸血是救治傷員的一個關(guān)鍵因素。應(yīng)用通用型RBC時，無需檢查受血者的ABO血型，使用簡便、迅速、安全，可增強(qiáng)應(yīng)急輸血保障能力，提高傷員的存活率。ABH血型抗原的本質(zhì)為糖蛋白和糖脂，血型是由其末端糖鏈的種類及排列順序決定的。0型RBC僅表達(dá)H抗原；B型RBC僅含B抗原，B抗原非還原端比H抗原多一個a-1，3半乳糖；A型RBC較為復(fù)雜，主要分為Al和A2兩種亞型。在Al亞型紅細(xì)胞上含有A和Al抗原，而A2型紅細(xì)胞上僅含有A抗原。A2亞型RBC表面的A抗原比H抗原多一個a-1,3-N-乙酰半乳糖胺，而Al亞型RBC表面的Al抗原比A抗原多一個N-乙酰半乳糖胺a1—3(巖藻糖a1—2)半乳糖[GalNAca1—3(Fuca1—2)Gal]三糖結(jié)構(gòu)，我國A1亞型占A型99X以上；AB型RBC則含有A、B兩種抗原。糖苷水解酶酶解法是目前實(shí)現(xiàn)通用型紅細(xì)胞的最有前途的方法。糖苷水解酶存在廣泛，種類豐富。國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會根據(jù)作用機(jī)制和酶切底物分類，已正式命名了150多類糖苷水解酶。這些糖苷水解酶部分來自高等動物、酵母、黑曲霉等，這些酶都是溶酶體酶，最適pH在3.54.5之間，酶比活性一般不超過50U/mg，反應(yīng)需要高濃度的酶蛋白(〉3mg/mL)和低pH值，酶解不完全，不能滿足血型轉(zhuǎn)變要求。部分糖苷水解酶來源于產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、肺炎球菌、雙歧桿菌、空腸彎曲桿菌、黃桿菌、糞球菌等微生物中。a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)可分別將A抗原、Al抗原非還原端的N-乙酰半乳糖胺酶切，生成O型紅細(xì)胞表面的H抗原。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的a乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)。本發(fā)明所提供的a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)，名稱為aNAGA，來源于月囟膜膿毒性金黃桿菌(CAr75"eo/actei^w歷歷e/w'/^ose/"c"歷)ZYP01CGMCCNo.2198，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。腦膜膿毒性金黃桿菌(C力iTseo/^cz^rj'咖歷e/i/7^^印z^'c咖)ZYP01CGMCCNo.2198是從中國臨床標(biāo)本中分離得到的，已于2007年10月17日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)大屯路的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。其中，序列表中的序列3由427個氨基酸殘基組成。為了使(a)中的aNAGA便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的aNAGA可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的aNAGA的編碼基因可通過將序列表中SEQIDN2:l的自5'末端第52至1332位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為了便于蛋白的可溶表達(dá)，還可在所述aNAGA的氨基末端添加上信號肽序列。如添加由序列表中2的自氨基末端第1至17位氨基酸殘基組成的多肽，得到由序列表中2所示的氨基酸序列組成的蛋白。序列表中的序列2由444個氨基酸殘基組成。自氨基末端(N端)第1-17位氨基酸殘基為信號肽(signalp印tide)序列。上述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)的編碼基因，具體可為如下l)或2)或3)的基因1)其編碼序列是序列表中的序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在O.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65"下與NC膜或PVDF膜雜交并洗滌。序列表中的序列1由1335個脫氧核糖核苷酸組成，自5'末端的第52至1332位核苷酸為序列3的ciNAGA的編碼序列，自5'末端的第1-51位核苷酸為信號肽的編碼序列。含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體具體可為將核苷酸序列是序列1的自5'末端的第52至1332位核苷酸插入pET-22b(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體pET-22b-aNAGA。本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)上述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)上述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)的方法，是將含有上述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌具體可為BL21(DE3)、E.coliJM109,E.coliHB101或E.coliToplO等。當(dāng)所述宿主為大腸桿菌時，用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為現(xiàn)有的在上述大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體。上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。培養(yǎng)含有本發(fā)明的a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)編碼基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)證明，該a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)aNAGA能夠在中性pH下高效、完全酶解人RBC表面的A抗原和A1抗原，使之轉(zhuǎn)變?yōu)镠抗原，從而實(shí)現(xiàn)A型RBC到0型RBC的轉(zhuǎn)變。說明aNAGA可將人紅細(xì)胞血型由A型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锽型。aNAGA可用于制備用于血型轉(zhuǎn)變的試劑盒；aNAGA還可用于制備通用型紅細(xì)胞。aNAGA具有重要的臨床意義和廣闊的市場前景，還可成為糖生物學(xué)研究的一個工具酶。圖1為aNAGA的全長基因和基因片段(序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸)的PCR產(chǎn)物電泳圖譜M:500bpDNAMarker,1:aNAGA的全長基因，2:aNAGA基因片段(序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸)圖2為pMD-18T-aNAGA和pET-22b-aNAGA的PCR鑒定圖譜。M:500bpDNAMarker;1:質(zhì)粒pMD-18T-aNAGA的PCR結(jié)果;2:質(zhì)粒pET-22b-aNAGA的PCR結(jié)果。圖3為SDS-PAGE電泳圖M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:pET-22b-aNAGA/大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)0.4mMIPTG誘導(dǎo)后的總蛋白；2:pET-22b-aNAGA/大腸桿菌BL21(DE3)未加IPTG誘導(dǎo)的總蛋白；3:pET-22b-aNAGA/大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)0.4mMIPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌上清蛋白經(jīng)Ni2+鰲合親合層析柱純化所得的蛋白；4:將組2+鰲合親合層析柱純化的蛋白再用陰離子交換層析柱HitrapQFF純化所得的蛋白。圖4A為用血型定型試劑檢測N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)對Al亞型紅細(xì)胞的酶解圖4B為用血型定型試劑檢測a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)對A2亞型紅細(xì)胞的酶解圖5為顯微鏡檢測紅細(xì)胞血型照片A:Al亞型紅細(xì)胞酶解前；B:Al亞型紅細(xì)胞酶解lh后；C:A2亞型紅細(xì)胞酶解前；D:A2亞型紅細(xì)胞酶解lh后。圖6為用流式細(xì)胞儀檢測酶解紅細(xì)胞的血型檢測A:Al亞型紅細(xì)胞酶解前；B:Al亞型紅細(xì)胞酶解lh后；C:A2亞型紅細(xì)胞酶解前；D:A2亞型紅細(xì)胞酶解lh后，E:0型紅細(xì)胞。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人所編《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、a-N-乙酰半乳糖胺酶aNAGA編碼基因的克隆將腦膜膿毒性金黃桿菌(CAzTseo/^"en'咖/Be"&^^e;"c咖)ZYP01CGMCCNo.2198菌株接種到培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，5g/LNaCl，3g/LK2HP04，其余為水。pH7.2)中，200rpm，30。C培養(yǎng)過夜。按照Promega基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，利用上游引物(序列為5，-ATGGGCGCCTTAATTCCC-3，)和下游引物(序列為5，-TTAGTAGTCGTCATTTATTGC-3，)進(jìn)行PCR。PCR條件為:先95。C預(yù)變性5rain;然后95。C變性30s，50。C退火30s，72。C延伸90s,共30個循環(huán)；最后72。C延伸10min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1335bp的條帶(圖l中，泳道l)。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收該片段。將該回收片段與pMD18-T質(zhì)粒(Takara公司)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pMD18-T載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和T7終止子序列為引物對其進(jìn)行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明擴(kuò)增到的基因由1335個脫氧核糖核苷酸組成(序列表中的序列1)，其開放閱讀框(ORF)為序列表中序列1的自5'末端第1至1335位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白質(zhì)，自序列表中序列1的5'末端的第1-51位核苷酸為信號肽的編碼序列。序列表中序列1的自5'末端第52至1335位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白質(zhì)。將含有序列表中序列1的自5'末端第1-1335位脫氧核糖核苷酸的aNAGA基因的重組載體命名為pTE-aNAGA。實(shí)施例2、aNAGA的表達(dá)1、含有aNAGA編碼基因的表達(dá)載體pET-22b-aNAGA的構(gòu)建以pTE-aNAGA為模板，用上游引物(序列為5，-ATCATATGCCAAAAAAAGTAAGAATTGC-3，(具有NdeI酶切位點(diǎn)))，和下游引物(序列為5'-TGCTCGAGGTAGTCGTCATTTATTGC-3，(具有XhoI酶切位點(diǎn))PCR擴(kuò)增核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸的aNAGA基因片段。PCR條件為先95r預(yù)變性5rain;然后95。C變性30s，43。C退火30s，72。C延伸90s，共30個循環(huán)；最后72。C延伸10min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1300bp的條帶(圖1中，泳道2)。按照TAKARA公司的操作指南，將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用酶切法、PCR法和測序鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒，將含有核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸的aNAGA基因片段的重組載體命名為pMD-18T-aNAGA。其中，pMD-18T-aNAGA的PCR鑒定結(jié)果如圖2中泳道1所示，得到約為1300bp的條帶。按照TAKARA公司的操作指南，用NdeI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pMD-18T-aNAGA，得到約1300bp的片段；用NdeI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pET-22b(+)(Novagen公司)，得到長為5364bp的線性質(zhì)粒，分別切下包含1300bp和5364bpDNA的瓊月旨糖膠，回收DNA，連接所得產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用酶切法、PCR法和測序鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒，將含有核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸的aNAGA基因片段的重組載體命名為pET-22b-aNAGA。其中，pET-22b-aNAGA的PCR鑒定結(jié)果如圖2中泳道2所示，得到約為1300bp的條帶。2、aNAGA的表達(dá)和純化將質(zhì)粒pET-22b-aNAGA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，通過酶切法、PCR法和測序鑒定，篩選得到轉(zhuǎn)入pET-22b-aNAGA的陽性細(xì)胞，所得的陽性細(xì)胞即為可以表達(dá)目的蛋白的遺傳工程宿主細(xì)胞。將該陽性菌稱為pET-22b-aNAGA/大腸桿菌BL21(DE3)。將pET-22b-aNAGA/大腸桿菌BL21(DE3)劃線接種于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100ug/ml)培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落接種于3mlLB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100ug/ml)培養(yǎng)過夜，以1:100的體積比稀釋過夜培養(yǎng)菌液于LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100ug/ml)中，于37。C250轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)至菌液0D600達(dá)到0.8時，加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.4mmol/L，于30。C誘導(dǎo)表達(dá)12h。4。C離心收集菌體。每克濕菌體加入10ml結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，500mMNaCl，20mM咪唑，pH7.4)，加入0.2rag/ml溶菌酶，20ug/mlDNAse，lraMMgCl2，lmMPMSF，室溫下攪動30min，反復(fù)凍融5次。10000rpm離心20min，取上清液。將上清液上樣至已經(jīng)平衡的Ni"鰲合親合層析柱(HistrapFFcrude層析柱，lmL，Pharmacia公司，11一0004—58)，用IO倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，用洗脫緩沖液(20慮磷酸鈉緩沖液，0.5MNaCl，500raM咪唑，pH7.4)洗脫目的蛋白。將洗脫蛋白上樣至陰離子交換層析柱HitrapQFF(HitrapQFF層析柱，5mL，Pharmacia公司，17-5156-01)上，洗滌緩沖液為20raMTris緩沖液，pH8.2;洗脫緩沖液為20mMTris緩沖液，1MNaCl，pH8.2。洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果如圖3所示，表明得到50kDa的aNAGA。洗脫下的目的蛋白用酶解緩沖液(200mM甘氨酸，3raMNaCl，p服.8)用超濾管超濾(AmiconUltra—15離心管，15ml，截留分子量50kd,貨號UFC900508，Millipore公司)，用HPLC檢測酶溶液純度為98%，使用BCA蛋白定量試劑盒(pierce公司，貨號23225)確定濃度為800ug/ml。實(shí)施例2、用a-N-乙酰半乳糖胺酶將人紅細(xì)胞由A型轉(zhuǎn)變?yōu)?型分別用生理鹽水洗滌0.5ml人Al亞型壓縮紅細(xì)胞和0.5ml人A2亞型壓縮紅細(xì)胞1遍，分別用酶解緩沖液(甘氨酸200raM，NaCl3mM，p朋.8)洗滌人Al亞型紅細(xì)胞和人A2亞型紅細(xì)胞2遍，分別取lml壓積為20%的Al亞型紅細(xì)胞和A2亞型紅細(xì)胞，加入a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosarainidase)200ug，室溫放置l小時，其間搖晃兩次。用抗A血型定型試劑(長春博德生物技術(shù)公司，目錄號s10960081，批號20060809)、抗Al單抗(加拿大DominionBiology公司，商品目錄號AL18001A)和流式細(xì)胞儀檢測紅細(xì)胞血型。1、用血型定型試劑檢測紅細(xì)胞血型取酶解前或酶解后的紅細(xì)胞40ul，分別加入等量(40ul)的抗A、抗A1、抗B與抗H抗體，充分混勻，5min后觀察結(jié)果。取10ul用顯微鏡觀察。血型定型試劑檢測結(jié)果如圖4A和圖4B所示，a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)酶解前A1紅細(xì)胞與抗A、抗A1強(qiáng)凝集，與抗H弱凝集，與抗B不凝集。酶解后的A1亞型紅細(xì)胞與抗A、抗A1、抗B不凝集，與抗H強(qiáng)凝集；酶解前A2紅細(xì)胞與抗A強(qiáng)凝集，與抗H弱凝集，與抗A1、抗B不凝集。酶解后的A2亞型紅細(xì)胞與抗A、抗A1、抗B不凝集，與抗H強(qiáng)凝集。顯微鏡觀察結(jié)果如圖5所示，表明酶解前A1、A2亞型紅細(xì)胞與抗A抗體形成大凝塊，酶解后A1、A2亞型與抗A抗體均不凝集。說明aNAGA將Al亞型和A2亞型RBC表面的A抗原以及.,Al亞型RBC表面的Al抗原最外側(cè)的GalNAca1，3糖苷鍵斷裂，將a-N-乙酰半乳糖胺降解掉，使Al和A抗原均轉(zhuǎn)化為H抗原。說明aNAGA為一種a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N陽acetylgalactosaminidase)。2、用流式細(xì)胞儀檢測紅細(xì)胞血型取酶解前或酶解后的紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2次，用PBS洗滌1次，加入lOOul人抗A血清(效價為l:64)，37。C水浴lh，PBS洗滌3次，加入1:100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG二抗100ul，室溫孵育lh，PBS洗滌3次，用流式細(xì)胞儀檢測。每次檢測分選10000個細(xì)胞。結(jié)果如圖6所示，表明A1和A2亞型紅細(xì)胞酶解后的峰明顯左移，熒光顯著減弱，與O型紅細(xì)胞的流式表現(xiàn)一致。說明aNAGA已將紅細(xì)胞分別由Al亞型和A2亞型轉(zhuǎn)變?yōu)?型。序列表<160〉3〈210〉1<211〉1335<212>DNA〈213〉腦膜膿毒性金黃桿菌(CArj^eoZ^cz^er7'咖/ffeyi/7卵5"e/7"c咖)<400〉1atgggcgccttaattccctcgagctcatta"ttcaacattttcgattttaa60gta^g^ttgc"ttttatagcCgCgg3C卿ctcacgta^gaaa^catggcg120卿cgcgatggLCgt卿ggt"tgtggcttttgc卿tccggatccgtacatggtaggccgt180gcgcaggdaag3atggc卿aagtttttggaa^cggaaat240tacgactacaaaaacatgctt3aagata^aatatcgatgC"tgt"ttttgtatcctctcca300tgggaatggcaccatgaacatggtgtagcagcceitgaaagctggtaaaattgtcgg肌tg360gaggtttgtggtgctttaacaatggatgagtgctgggattttccgagcag420acaggagttccgtt肌tggctttggaa^tgtatgttacagacgcgatattatggctgtc480cttaac3tggta^ga^aagacatgttcggagaattaattcgcgg獄gggaggctaccag540cacgatctcagaccagttcttttcaatagcggaatxaacggt犯aaacgg卿tggtgtt600gagtttggtgacaaagccttcagtg鄉(xiāng)cg3^tggaga^cca^cc^ttata^3aacaga660aacgggg犯ctctaccctactcacggtt"taggcccattac720cgcggg犯caattatcatct111acataaa780tatgtcgtgg3t犯gggCggggaaagccatccaaatgcaa犯gtaga^tggaaacaagga840gatattgta^ccactcagatccagtgta^c織gg卿gactattg"tatt皿cccacgat■accagcctgctaacctgggaaggtxtttgg960gaagattttggctgggg卿tgc3gcacaaggatttattt1020cattctcacag"gggatggtggWg認(rèn)gaatatgaccacccgatgtgg1080tg"ttggtgcaggtc&ggcggd3tggatt￡tcttccttgat1140aatacttttatcgagtgtatcaaacgaaatg^gcattcccgctggatgtttacgatctg1200gcgacgtggtattccattacacctcttagtgaaaagtctattgctgaaa^cggtgccgtt1260ctgattctactggaa^actga"tttgc犯ta1320aatgacgactactaa1335<210>2〈211>444<212>PRT〈213〉腦膜胺毒性金黃桿菌(CAr"eo/^cfei^'咖/Z7e/2i/gase/d'c鵬)<400〉2MetGlyAlaLeulieProSerSerSerLeuPheAsnliePheAspPhe151015AsnProLysLysValArglieAlaPhelieAlaValGlyLeuArgGly202530GinThrHisValGluAsnMetAlaArgArgAspAspValGluValVal354045AlaPheAlaAspProAspProTyrMetValGlyArgAlaGinGlulie505560LeuLysLysAsnGlyArgLysProAlaLysValPheGlyAsnGlyAsn65707580TyrAspTyrLysAsnMetLeuLysAspLysAsnlieAspAlaValPhe859095ValSerSerProTrpGluTrpHisHisGluHisGlyValAlaAlaMet100105110LysAlaGlyLyslieValGlyMetGluValCysGlyAlaLeuThrMet115120125AspGluCysTrpAspTyrValLysValSerGluGinThrGlyValPro130135140LeuMetAlaLeuGluAsnValCysTyrArgArgAsplieMetAlaVal145150155160LeuAsnMetValArgLysAspMetPheGlyGluLeulieArgGlyThr165170175GlyGlyTyrGinHisAspLeuArgProValLeuPheAsnSerGlylie180185190AsnGlyLysAsnGlyAspGlyValGluPheGlyAspLysAlaPheSer195200205GluAlaLysTrpArgThrAsnHisTyrLysAsnArgAsnGlyGluLeu210215220TyrProThrHisGlyLeuGlyProLeuHisThrMetMetAsplieAsn225230235240ArgGlyAsnArgLeuLeuArgLeuSerSerPheAlaSerLysAlaArg245250255GlyLeuHisLysTyrValValAspLysGlyGlyGluSerHisProAsn260265270AlaLysValGluTrpLysGinGlyAsplieValThrThrGinlieGin275280285CysAsnAsnGlyGluThrlieValLeuThrHisAspThrSerLeuGin290295300ArgProTyrAsnLeuGlyPheLysValGinGlyThrGluGlyLeuTrp305310315320GluAspPheGlyTrpGlyAspAlaAlaGinGlyPhelieTyrPheGlu325330335LyslieMetAsnHisSerHisArgTrpAspGlySerGluLysTrpMet340345350LysGluTyrAspHisProMetTrpLysLysHisGluGinLysAlaVal355360365GlyAlaGlyHisGlyGlyMetAspTyrPheLeuAspAsnThrPhelie370375380GluCyslieLysArgAsnGluAlaPheProLeuAspValTyrAspLeu385390395400AlaThrTrpTyrSerlieThrProLeuSerGluLysSerlieAlaGlu405410415AsnGlyAlaValGinGlulieProAspSerThrAsnGlyLysTrpLys420425430ThrAlaLysAsnThrPheAlalieAsnAspAspTyr435440<210〉3<211〉427<212>PRT<213〉腦膜膿毒性金黃桿菌(CAr7sea63cfen'咖/ze//^c^e;^ic咖)〈400〉3ProLysLysValArglieAlaPhelieAlaValGlyLeuArgGlyGin151015ThrHisValGluAsnMetAlaArgArgAspAspValGluValValAla202530PheAlaAspProAspProTyrMetValGlyArgAlaGinGlulieLeu354045LysLysAsnGlyArgLysProAlaLysValPheGlyAsnGlyAsnTyr505560AspTyrLysAsnMetLeuLysAspLysAsnlieAspAlaValPheVal65707580SerSerProTrpGluTrpHisHisGluHisGlyValAlaAlaMetLys859095AlaGlyLyslieValGlyMetGluValCysGlyAlaLeuThrMetAsp100105110GluCysTrpAspTyrValLysValSerGluGinThrGlyValProLeu115120125MetAlaLeuGluAsnValCysTyrArgArgAsplieMetAlaValLeu130135140AsnMetValArgLysAspMetPheGlyGluLeulieArgGlyThrGly145150155160GlyTyrGinHisAspLeuArgProValLeuPheAsnSerGlylieAsn165170175GlyLysAsnGlyAspGlyValGluPheGlyAspLysAlaPheSerGlu180185190AlaLysTrpArgThrAsnHisTyrLysAsnArgAsnGlyGluLeuTyr195200205ProThrHisGlyLeuGlyProLeuHisThrMetMetAsplieAsnArg210215220GlyAsnArgLeuLeuArgLeuSerSerPheAlaSerLysAlaArgGly225230235240LeuHisLysTyrValValAspLysGlyGlyGluSerHisProAsnAla245250255LysValGluTrpLysGinGlyAsplieValThrThrGinlieGinCys260265270AsnAsnGlyGluThrlieValLeuThrHisAspThrSerLeuGinArg275280285ProTyrAsnLeuGlyPheLysValGinGlyThrGluGlyLeuTrpGlu290295300AspPheGlyTrpGlyAspAlaAlaGinGlyPhelieTyrPheGluLys305310315320lieMetAsnHisSerHisArgTrpAspGlySerGluLysTrpMetLys325330335GluTyrAspHisProMetTrpLysLysHisGluGinLysAlaValGly340345350AlaGlyHisGlyGlyMetAspTyrPheLeuAspAsnThrPhelieGlu355360365CyslieLysArgAsnGluAlaPheProLeuAspValTyrAspLeuAla370375380ThrTrpTyrSerlieThrProLeuSerGluLysSerlieAlaGluAsn385390395400GlyAlaValGinGlulieProAspSerThrAsnGlyLysTrpLysThr405410415AlaLysAsnThrPheAlalieAsnAspAspTyr42042權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦耹)或2)或3)的基因1)其編碼序列是序列表中的序列1的自5'末端第52-1332位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述a-N-乙酰半乳糖胺酶的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述的基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5、一種表達(dá)權(quán)利要求l所述蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求l所述蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到權(quán)利要求1所述的蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將核苷酸序列是序列1的自5'末端的第52至1332位核苷酸插入pET-22b(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體pET-22b-aNAGA。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。8、權(quán)利要求1所述蛋白在將人紅細(xì)胞血型由A型轉(zhuǎn)變?yōu)?型中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求1所述蛋白在將人紅細(xì)胞血型由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锽型中的應(yīng)用。10、一種包括權(quán)利要求1所述蛋白的用于血型轉(zhuǎn)變的試劑盒。全文摘要本發(fā)明公開了一種α-N-乙酰半乳糖胺酶及其編碼基因與應(yīng)用。該α-N-乙酰半乳糖胺酶是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該α-N-乙酰半乳糖胺酶可將人紅細(xì)胞血型由A型轉(zhuǎn)變?yōu)镺型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锽型。αNAGA可用于制備用于血型轉(zhuǎn)變的試劑盒；αNAGA還可用于制備通用型紅細(xì)胞。文檔編號C12N9/14GK101182497SQ200710176778公開日2008年5月21日申請日期2007年11月2日優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日發(fā)明者華徐,章?lián)P培,郁成雨申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所