專利名稱：：T型非病毒載體及包含其的復合藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因治療藥物領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及非病毒載體融合蛋白TNF咖2-S0N2-GRP與限制性表達綠膿桿菌外毒素基因殺傷功能域高效突變型重組體5XNFBS-SCP-/^Y/iM/t的復合藥物。非病毒載體中的TNFam2是強效低毒的腫瘤壞死因子a(TNFa)衍生物，S0N2是一種DNA結(jié)合蛋白，GRP是胃泌素釋放肽。毒素基因重組體上的5XNFBS是經(jīng)5次重復克隆的NF-icB的結(jié)合位點，SCP是一種腫瘤特異性啟動子，/^//i^^是綠膿桿菌外毒素基因殺傷功能域高效突變型。本非病毒載體可結(jié)合并攜帶上述毒素基因重組體進入GRP受體陽性的細胞，但毒素基因只能在NF-KB+SCP+GRP受體陽性的惡性腫瘤細胞內(nèi)表達，進而強效殺滅此類對化療與放療不敏感的腫瘤細胞。本非病毒載體還可獨立地殺傷GRP受體陽性的惡性腫瘤細胞。本發(fā)明還涉及此復合藥物及單獨的非病毒載體在惡性腫瘤治療中的用途。
背景技術(shù)：
：已知上千種來自微生物、植物、動物以及化學合成的蛋白質(zhì)毒素具有抗腫瘤或抗病毒活性。但它們是人體異源的毒素蛋白質(zhì)，在付之臨床應(yīng)用時存在兩個問題一是由于其細胞殺傷作用不具備腫瘤細胞特異性，可對人體產(chǎn)生嚴重的毒副作用；二是其作為人體異源蛋白質(zhì)，具有很強的免疫原性，導入人體血循環(huán)不僅可導致抗體的迅速生成而被中和失活，并可引起人體發(fā)生嚴重的過敏反應(yīng)。久來人們試圖改造此類蛋白質(zhì)以應(yīng)用于臨床對疾病的治療。如綠膿桿菌外毒素(/^ei/c/OT朋asexotoxinA，PE)是由綠膿桿菌分泌的一種毒素。PE由分別行使受體結(jié)合、轉(zhuǎn)位和酶催化(殺傷細胞)活性的三個結(jié)構(gòu)域domainIa(第1-252位氨基酸)-domainll(第253-364位氨基酸)-domainlb(第365-399位氨基酸)domain-III(第400-613位氨基酸)組成。對PE的改造，曾在提高其殺傷作用的細胞靶向性和降低其免疫原性這兩方面進行過探索。目前，PE的應(yīng)用研究普遍采用蛋白質(zhì)形式。為避免毒素對正常細胞的毒副作用，實現(xiàn)細胞毒作用對腫瘤細胞的靶向性，首先通過刪除結(jié)構(gòu)域Ia來取消PE原有的普遍結(jié)合于任何細胞表面的能力。研究還發(fā)現(xiàn)，PE分子的細胞毒作用可因第609-613位氨基酸的REDLK被替換為KDEL而顯著提高?；耍腥颂剿鬟\用基因工程技術(shù)，把經(jīng)KDEL改造并刪除了結(jié)構(gòu)域Ia的PE片段作為細胞毒效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，并將之與腫瘤特異性受體的配體(或抗體)融合，經(jīng)DNA重組與表達改造成為具有腫瘤細胞耙向性的融合蛋白，如TGFct-PE40，以降低PE的毒副作用。該融合蛋白在體外實驗、或臨床研究的早期階段可以收到較好的效果；但進一步臨床研究表明，該種導向融合蛋白仍可造成嚴重的肝毒性；而且其中的綠膿桿菌毒素PE40對人體仍具有很強的免疫原性，在應(yīng)用于人體的初期即產(chǎn)生抗體，致使該蛋白因中和作用而失效。通過點突變以消除抗原表位只能在一定程度上、部分地降低毒素蛋白的免疫原性，其免疫原性仍然顯著存在。同時，所利用的腫瘤細胞特異性受體往往同時存在于腫瘤細胞與正常細胞表面，所以，此類導向融合蛋白在殺傷腫瘤細胞的同時，還殺傷了其表面也有相同受體的正常細胞。因此，上述關(guān)于人體外源毒素蛋白的導向改造是不成功的，尋求其改造新途徑是必要的。已有研究結(jié)果表明，雙鏈DNA是低免疫原性的，而且不引起和促進機體發(fā)生系統(tǒng)性自身免疫反應(yīng)[l]。我們首先考慮將人體異源毒素蛋白質(zhì)改為其編碼基因?qū)胙h(huán)，以從根本上避免前者的免疫原性。我們認為，實現(xiàn)基因的靶向轉(zhuǎn)移和表達以確?；蛑委煹陌踩裕腔蛑委熢O(shè)計中必須考慮的首要問題。根據(jù)基因作用的原理，如將治療基因特異性地轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞內(nèi)或?qū)⑵浔磉_限制在腫瘤細胞內(nèi)，則可有效避免其對正常組織細胞的傷害，同時也可提高毒素基因轉(zhuǎn)移的準確性與效率，達到靶向性殺傷的效果。據(jù)報告，survivin，作為IAP(inhibitorofap叩tosis)家族的新成員，參與細胞的抗凋亡作用和對細胞增殖的調(diào)節(jié)。已有的研究發(fā)現(xiàn)，survivin呈腫瘤細胞特異性高表達，且該特異性表達與survivinpromoter(啟動子)的轉(zhuǎn)錄活性呈正相關(guān)關(guān)系，即survivinpromoter在腫瘤細胞普遍具有較高的轉(zhuǎn)錄啟動功能，而在絕大多數(shù)的成體正常細胞則活性極低。已證實由269bp組成的survivincorepromoter(縮寫為SCP)具有腫瘤細胞特異性轉(zhuǎn)錄活性，因此可將腫瘤細胞表示為SCP+，正常細胞表示為SCP—。另據(jù)報告，NF-kB(nuclearfactorkappaB)對survivin表達有促進作用。作為轉(zhuǎn)錄因子的NF-kB呈腫瘤細胞特異性高表達和激活，即腫瘤細胞中的NF-kB可與其特異結(jié)合位點(即kBsite，序列為gggactttcc，表示為NFBS)相結(jié)合，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄功能，因此腫瘤細胞可表示為NF-icB+;而在正常細胞中，NF-KB處于被抑制狀態(tài)，停留在細胞質(zhì)中，無法進入細胞核以發(fā)揮功能，因此，正常細胞為NF-kB—。本研究考慮運用具有腫瘤特異性的兩個因子NF-kB與SCP的聯(lián)合控制把毒素基因的表達嚴格限制在腫瘤細胞內(nèi)?；蛑委煹囊环N載體是非病毒載體。它可根據(jù)實際需要加以設(shè)計。而且采用非病毒載體可避免采用病毒載體時所可能造成的一些難以解決的問題。非病毒載體的研制，普遍采用化學合成的多肽的混合的技術(shù)路線。如化學合成的結(jié)合受體的配體、或結(jié)合抗原的抗體多肽片段，用以結(jié)合耙細胞表面的受體或抗原；化學合成的帶正電荷的多聚賴氨酸多肽片段，用以結(jié)合表達型功能效應(yīng)基因重組體；之后，把配體或抗體多肽片段、多聚賴氨酸多肽片段、功能效應(yīng)基因重組體加上脂質(zhì)體包裹成為一種復合物，用以同靶細胞結(jié)合，并將功能基因重組體導入細胞內(nèi)，使之表達，從而發(fā)揮治療作用。這一技術(shù)路線的突出缺點有二一是化學合成肽的成本過高，幾乎不可能被工業(yè)開發(fā)實踐所采納；二是脂質(zhì)體有很強的殺傷細胞的毒副作用。有鑒于此，本發(fā)明采取基因工程的技術(shù)路線，應(yīng)用功能相似的特定的人源基因片段，經(jīng)DNA重組與表達從而獲得一種特定的融合蛋白以作為非病毒載體，不使用脂質(zhì)體，以便在實現(xiàn)功能效應(yīng)基因的準確靶向轉(zhuǎn)移的同時，降低成本投入，避免非病毒載體的毒副作用與免疫原性。我們在設(shè)計與構(gòu)建非病毒載體時，使用了富含帶正電荷的堿性氨基酸并包含核定位序列的DNA結(jié)合蛋白SON—個片段。己知它可結(jié)合富含負電荷的DNA重組體并可引導該重組體進入細胞核，開始持續(xù)轉(zhuǎn)錄的進程。我們在設(shè)計與構(gòu)建非病毒載體時，使用了一類腺癌細胞表面富集的一種受體GRPR的受體配體多肽胃泌素釋放肽GRP。當前，GRPR已成為廣泛關(guān)注的腫瘤治療的作用靶點。由于GRP與GRPR的結(jié)合，則可將下述的復合藥物攜帶到此類細胞的表面，之后經(jīng)細胞的內(nèi)吞作用進入細胞。我們在設(shè)計與構(gòu)建非病毒載體時，使用了經(jīng)突變改造的突變型基因7)VF^么它所表達的TNFa的衍生物TNF咖2是強效低毒的。TNF咖2是野生型TNFa經(jīng)刪除原第1至7位氨基酸，以及原第8至10位氨基酸由Pro-Ser-Asp替換為Arg-Lys-Arg而得到的突變體(151個氨基酸)[2，3]。它已被批準作為非專利藥物用于臨床對惡性腫瘤的治療。這說明，其毒副作用即使有、也沒有超出臨床允許的范圍。基因治療的一類藥物是DNA與蛋白質(zhì)的復合物(DNA/ProteinComplex)。如上所述，普遍采用的技術(shù)路線是研制化學合成肽、功能基因重組體加脂質(zhì)體混合而成的復合物。其缺點是成本高，有毒副作用。而且，多數(shù)其有殺傷功能的基因的表達被置于構(gòu)成型啟動子如pSV40或pCMV的驅(qū)動之下，在配體或抗體的引導下，功能基因重組體既進入腫瘤細胞，也進入正常細胞，以致在殺傷腫瘤細胞的同時，也殺傷正常細胞，造成不同程度的毒副作用。有鑒于此，本發(fā)明采取"雙限制"的策略，從兩個方面把毒素基因的表達加以限制一方面，利用受體與配體相結(jié)合的關(guān)系，把復合物導入該受體陽性的細胞；另一方面運用腫瘤特異性的轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的雙重控制把復合物中的毒素基因的表達嚴格限制在一類惡性腫瘤細胞內(nèi)。毒素基因即使進入正常細胞也不會表達，正常細胞將不被殺傷，從而提高功能基因表達的準確性，并使毒副作用最小化。再，一旦將此類復合藥物導入患者血循環(huán)，其結(jié)合GRP受體的情況將不同于體外細胞試驗。在體內(nèi)，在GRPR+腫瘤細胞表面富集有大量的GRP受體，而在某些正常細胞表面只有少量的GRP受體。復合藥物在體內(nèi)流動運轉(zhuǎn)的過程中，其GRP配體處于同細胞表面GRP受體競爭性結(jié)合的過程主要結(jié)合到GRP受體富集的腫瘤細胞表面，較少地結(jié)合到GRP受體較少的正常細胞表面。處在復合物中的TNFam2則有更少的機會同TNFa受體結(jié)合。這樣，由于結(jié)合到正常細胞表面的TNFa受體而導致對正常細胞的殺傷作用的機會就更少了。而且，該TNFam2己被應(yīng)用于臨床。因此，其毒副作用將被進一歩最小化。
發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明提供了一種非病毒載體，它是一種靶向性融合蛋白。所述融合蛋白由細胞因子突變體多肽、富含堿性氨基酸并包含核定位序列的多肽，和受體配體多肽組成。根據(jù)本發(fā)明，所述細胞因子突變體多肽是TNFa突變形成的強效低毒的衍生物TNFam2;所述富含堿性氨基酸并包含核定位序列的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON及其片段或衍生物，如S0N2;所述受體配體多肽是胃泌素釋放肽GRP或其衍生物。上述三種多肽的DNA編碼序列均取自人基因組，以避免其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫原性。優(yōu)選地，我們構(gòu)建了一種非病毒載體TNFam2-S0N2-GRP(即TSG)。其作用原理如下述。GRPR是G蛋白偶聯(lián)膜表面的胃泌素釋放肽GRP的受體。在一類惡性腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞表面富集此受體GRPR。我們采用GRP作為非病毒載體的靶細胞定位結(jié)構(gòu)域，以期通過GRP與GRPR的結(jié)合，攜帶毒素基因進入GRPR+的細胞。我們選擇上述惡性腫瘤作為靶細胞，還因為此類腺癌往往對化療或放療不敏感，或有抗性。GRP的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，其DNA編碼序列如SEQIDNO.7所示。此非病毒載體上的S0N2是一種DNA結(jié)合蛋白SON中的富含陽性氨基酸的一個片段，并含有核定位序列，帶正電荷,用以結(jié)合所述帶負電荷的毒素基因重組體。其核定位序列用以引導上述毒素基因重組體在進入細胞后繼之進入細胞核，開始毒素基因轉(zhuǎn)錄的進程。S0N2的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，其DNA編碼序列如SEQIDNO.5所示。此非病毒載體上的TNFam2是經(jīng)突變改型的強效低毒的TNFa衍生物。TNFcon2的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其DNA編碼序列如SEQIDNO.2所示。本非病毒載體上的S0N2-GRP的編碼基因難以高表達。TNFam2編碼基因易于高表達。把TNFam2編碼基因克隆在S0N2-GRP的編碼基因上游，獲得了TNF咖2-S0N2-GRP(TSG)融合蛋白(TNFam2_S0N2-GRP的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，其DNA編碼序列如SEQIDN0.9所示)的高表達。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了編碼本非病毒載體的融合基因及其表達型重組體。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)該融合蛋白的工程菌及該融合蛋白的制備方法。另一方面，本發(fā)明鑒于雙鏈DNA(質(zhì)粒)的低免疫原性、且不引起和促進機體發(fā)生系統(tǒng)性自身免疫反應(yīng)的特點，摒棄將毒素蛋白直接導入人體血循環(huán)的技術(shù)路線，而采用將毒素蛋白的DNA編碼序列導入人體血循環(huán)，以期從根本上避免來自外源毒素蛋白質(zhì)的免疫原性。本發(fā)明提供了本非病毒載體和一種關(guān)于毒素基因的限制性表達的DNA重組體的復合藥物，以用于耙向性惡性腫瘤的基因治療。所述表達型重組體包含一種表達對細胞具有殺傷活性的蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)本發(fā)明，所述對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌外毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他一切對細胞具有殺傷能力的來自人體、動植物或者微生物的蛋白，或者是它們的殺傷活性功能區(qū)域、突變體或類似物；以及人工合成的對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)或多肽及其編碼基因。優(yōu)選地，其中所述的對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌外毒素，或者是其第二或第三功能結(jié)構(gòu)域；更優(yōu)選地，所述對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌外毒素的第三功能結(jié)構(gòu)域或其突變體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述突變體為綠膿桿菌外毒素第III功能域突變體(C端的REDLK突變成KDEL)，稱為PEIIImut。其氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，其DNA編碼序列如SEQIDNO.11所示。優(yōu)選地，本發(fā)明構(gòu)建了在NF-kB(5XNFBS的DNA序列如SEQIDNO.12所示)和SCP(SCP的DNA序列如SEQIDNO.13所示)雙重控制下的5X^83-30-/5￡/77/^(片段5XNFBS-SCP-/^//iM^的DNA序列如SEQIDNO.17所示)毒素基因重組體。本發(fā)明將所述非病毒載體與限制性表達的毒素基因重組體按質(zhì)量比在體外混合裝配成復合藥物TNFam2-S0N2-GRP/5XNFBS-SCP-/^//7ffli/t，以用于對腫瘤細胞的耙向性殺傷作用。利用本非病毒載體TNFam2-S0N2-GRP(TSG)結(jié)合并攜帶在NF-kB和survivincorepromoter(SCP)雙重控制下的5XNFBS-SCP-/^7//M7t毒素基因重組體靶向?qū)隚RPR+腫瘤細胞。在NF-kb+與SCP+的腫瘤細胞內(nèi)，毒素基因/^7/7/m/t基因得以表達，從而殺滅該細胞。同時，即使表達型重組體被導入GRPR+正常細胞(NF-kB—和SCP—)，由于在5XNFBS-SCP控制下的毒素基因/^7/7m/t在正常細胞內(nèi)不表達，因此正常細胞不會被殺傷。這樣，毒素蛋白質(zhì)的免疫原性和毒副作用己被最小化。這一復合藥物的主要適應(yīng)癥是GRPR+的胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤。該類腺癌往往對化療與放療耐受、不敏感，或有抗性。這是本發(fā)明的一個主要特征。總之，本發(fā)明的復合藥物具有明確的殺傷GRPR+惡性腫瘤的特異性，因此，該藥物的使用應(yīng)遵循"個體化診斷與個體化治療"的原則。此類具有殺傷作用的耙向特異性、毒副作用與免疫原性最小化的新型藥物，當前國際上稱之為"智能藥物"。另外，非病毒載體TNFam2-S0N2-GRP(TSG)可獨立地發(fā)揮對GRPR+惡性腫瘤的殺傷作用。但其殺傷強度將相對低于綠膿毒素蛋白質(zhì)，如PEIIImut。圖1.本發(fā)明復合藥物的總體設(shè)計圖圖2.PCR反應(yīng)以擴增得到目的產(chǎn)物-yWeI-SCP-5ksI-。第l孔DNA分子量標準SD002(600bp，500bp,400bp,300bp，200bp，100bp)。第2、3孔PCR產(chǎn)物(287bp，二復孔)。圖3.T-SCP克隆篩選的PCR結(jié)果。第1至8孔分別為1號至8號克隆(陽性克隆的PCR產(chǎn)物為287bp)。第9孔DNA分子量標準DL15，000(15000bp，10000bp,7500bp，5000bp，2500bp，1000bp,250bp)。圖4.PCR反應(yīng)以擴增得到目的產(chǎn)物-J/OTI-5XNFBS-5"acI-。第1、2孔:PCR產(chǎn)物(函p)。第3孔為DNA分子量標準DL15,000(15000bp,10000bp,7500bp,5000bp，2500bp，1000bp,250bp)。第4孔為DNA分子量標準SD002(600bp,500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。圖5.為篩選5XNFBS-SCP-^vc克隆的I&&cI雙酶切結(jié)果。第l孔為DNA分子量標準SD002(600bp,500bp，400bp,300bp，200bp,100bp)。第2至7孔:分別為1號至6號克隆(陽性克隆經(jīng)酶切得到兩個片段，分別為5082bp和93bp)。第8孔為DNA分子量標準DL15，000(15000bp，10000bp，7500bp,5000bp，2500bp，1000bp,250bp)。圖6.5XNFBS-SCP-Z"c的DNA測序報告。8圖7.各調(diào)控序列在三個腫瘤細胞株(MCF-7，MDA-MB-231，HeLa)和一個非腫瘤細胞株(CCC-ESF-1)所引導的勿cj'/erase的表達結(jié)果。(A)檢測結(jié)果以經(jīng)過內(nèi)對照校正的RLU(relativeluciferaseunit,即相對熒光素酶單位)值表示。RLl^螢火蟲熒光素酶活性單位/海腎熒光素酶活性單位(B)各調(diào)控序列在不同細胞株中所引導的基因表達，與在非腫瘤細胞株(CCC-ESF-1)的RLU值之比。(C)每種細胞株的各調(diào)控序列所引導的基因表達，與各自Psv40-ESV40所對應(yīng)的RLU值之'比?？s寫(1)Psv40-Esv40:SV40promoter-SV40enhancer;(2)SCP:survivincorepromoter;(3)5XNFBS-SCP:5XkBsites-survivincorepromoter;(4)SCP-Esv40:survivincorepromoter_SV40enhancer;(5)5XNFBS-SCP-Esv40:5XkBsites-survivincorepromoter-SV40enhancer;.(6)5XNFBS:5XkBsites(NF-kB結(jié)合位點)圖8.PCR反應(yīng)以擴增得到目的產(chǎn)物-AfcoI-IsI-。第1孔PCR產(chǎn)物(666bp)。第2孔DNA分子量標準lOObpLadder(1500bp，lOOObp，900bp,800bp，700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp，lOObp)。第3孔陰性對照。圖9.5XNFBS-SCP-克隆的PCR篩選結(jié)果。第l孔DNA分子量標準DL15，000(15000bp,lOOOObp,7500bp,5000bp，2500bp，lOOObp,250bp)。第2至4，6至8孔分別為1號至6號克隆(陽性克隆的PCR產(chǎn)物為666bp)。第5孔DNA分子量標準lOObpLadder(1500bp，1000bp，900bp，800bp,700bp,600bp，500bp,400bp，300bp，200bp，100bp)。第9孔陰性對照。圖10.5XNFBS-SCP-Z^/iTM^克隆的AcoTV單酶切和AfcoI&AaI雙酶切鑒定結(jié)果。第l孔為DNA分子量標準DL2,000(2000bp,1000bp,750bp,500bp，250bp，100bp)。第2孔為5XNFBS-SCP-尸i7/iM^克隆的EcoRV單酶切產(chǎn)物(陽性克隆經(jīng)酶切得到單一片段，為4171bp)。第3孔為5XNFBS-SCP-/^//7m^克隆的AfcoI&J6aI雙酶切產(chǎn)物(陽性克隆經(jīng)酶切得到兩個片段，分別為3519bp和652bp)。第4孔為DNA分子量標準DL15，000(15000bp,10000bp,7500bp,5000bp,2500bp,1000bp，250bp)。圖11.5XNFBS-SCP-/^/77歷"的DNA測序報告。圖12-A，圖12-B，圖12-C，圖12-D.腫瘤特異性表達重組體5XNFBS-SCP-PEIIImut和組成性表達重組體Psv40-/^i77M/卜Esv40的構(gòu)建。圖12-A.重組體5"6F-Zwc的構(gòu)建圖12-B.重組體5XNFBS-SC尸-Z"c的構(gòu)建圖12-C.重組體5XNFBS-5^尸-尸j57iT歷W的構(gòu)建圖12-D.重組體Psv40-Z^i7i/z7W-Esv40的構(gòu)建圖13.RT-PCR檢測,i57/i/z7^的轉(zhuǎn)錄情況。第l孔DNA分子量標準DL2，000(2000bp，1000bp，750bp，500bp,250bp，100bp)。第2、3孔5乂^83-3[-/^///歷^轉(zhuǎn)染后的RT-PCR產(chǎn)物(356bp)。第4孔陰性對照。第5孔陽性對照(322bp)。圖14.脂質(zhì)體介導5XNFBS-SCP-/^777M/t以及Psv40-/^i77y^t-Esv40(對照)轉(zhuǎn)染的MTT檢測結(jié)果。所顯示的值是細胞增殖抑制率(％)，代表細胞殺傷活性大小。DNA工作濃度均為1.33ug/ml。圖15.經(jīng)AnnexinV-FITC&PI處理后的流式細胞儀檢測圖。(MCF-7:腫瘤細胞株NF-kB+SCP+;CCC-ESF-1:非腫瘤細胞株NF-kB+SCP—)(1)Psv40-UJ/鵬t-Esv40(SV40p，oter-尸肌/鵬t-SV40enhancer);(2)5XNFBS-SCP,i7i/z"t(5XkBsites-survivincorepromoterU77鵬f).圖16.PCR反應(yīng)得到分別包含TNFam2,S0N2，GRP的DNA編碼序列的目的產(chǎn)物。1:product1:-yVc/eI-(7)V尸a/z^-"'/^er)-fcofI-(498bp)。2:DNA分子量標準lOObpLadder(1500bp，1000bp,900bp,800bp，700bp,600bp,500bp,400bp，300bp,200bp,100bp)。3:product2:-^co7I-5置》fe威I-(184bp)。4:product3:-TVofeI-5YWiK5feaI-(184bp)。5:product4:-5feI-(h'/^er-M乃-fe/z7#I-(137bp)。圖17.A^eI&I雙酶切篩選pCW-75"克隆。第1至7孔:分別為1號至7號克隆的酶切結(jié)果(陽性克隆經(jīng)酶切得到兩個片段，分別為4887bp和656bp)。第8孔DNA分子量標準100bpLadder(1500bp，1000bp,900bp，800bp，700bp,600bp,500bp,400bp，300bp,200bp，100bp)。圖18.為篩選pCW-W克隆的AWeI&fe/必I雙酶切。第1至5孔分別為5個克隆的酶切產(chǎn)物(陽性克隆經(jīng)酶切得到兩個片段，分別為4887bp和287bp)。第6孔DNA分子量標準DL15,000(15000bp,10000bp，7500bp，5000bp,2500bp，1000bp，250bp)。圖19.PCR反應(yīng)以擴增得到目的產(chǎn)物-AWeI-(7M^a-"/7^r)-&o/PI-S(9A^&肪I-。第1孔為PCR產(chǎn)物(667bp)。第2孔DNA分子量標準lOObpLadder(1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp,500bp,400bp，300bp，200bp，100bp)。圖20.pCW-75Y7克隆的PCR篩選結(jié)果。第l孔陰性對照。第2至4，第7至9孔分別為六個克隆的PCR產(chǎn)物(陽性克隆的PCR產(chǎn)物為786bp)。第5孔為DNA分子量標準lOObpLadder(1500bp，1000bp，900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp，200bp，100bp)。第6孔為DNA分子量標準DL2,000(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp，100bp)。圖21.pCW-n的DNA測序報告。圖22-A，圖22-B，圖22-C.非病毒載體蛋白TNFrnn2-S0N2-GRP(即TSG)的表達重組體pCW-75^的構(gòu)建步驟。圖22-A.片段TiVFa/^-h'Mer-W船的構(gòu)建圖22-B.片段pCW-(7的構(gòu)建圖22-C.重組體pCW-75"6"的構(gòu)建圖23.包涵體提取各步上清及全菌體的SDS-PAGE電泳結(jié)果。第1孔細胞培養(yǎng)物之上清第2孔3%Triton洗滌后之上清第3孔細胞裂解處理后之上清第4孔菌體(未誘導)第5孔菌體(誘導)第6孔蛋白分子量標準(66，45,35,27kDa)第7孔5%Triton緩沖液洗滌后之上清第8孔尿素溶液洗滌后之上清第9孔鹽酸胍溶液洗滌后之上清圖24.包涵體提取各步沉淀及全菌體的SDS-PAGE電泳結(jié)果。第1孔3%Triton洗滌后之沉淀第2孔細胞裂解處理后之沉淀第3孔5%Triton緩沖液洗滌后之沉淀第4孔尿素溶液洗漆后之沉淀第5孔鹽酸胍溶液洗滌后之沉淀第6孔包涵體溶解液第7孔蛋白分子量標準(97.4，66.2，42.7,31.0,14.4kDa)第8孔菌體(誘導)第9孔菌體(未誘導)圖25.經(jīng)誘導菌體的SDS-PAGE結(jié)果凝膠掃描。定量分析顯示，目的蛋白TSG的表達量占經(jīng)誘導全菌體表達蛋白總量的37.819%.圖26.蛋白TSG的反相液相層析圖譜。在洗脫峰分別收集的1號管蛋白TSG收集樣品和2號管蛋白TSG收集樣品。圖27.經(jīng)反相液相層析后所收集的蛋白TSG樣品的SDS-PAGE電泳結(jié)果。第l孔菌體(誘導)第2孔蛋白分子量標準(97.4，66.2，42.7,31.0，20.1,14.4kDa)第3孔包涵體溶解液第4孔1號管蛋白TSG收集樣品第5孔2號管蛋白TSG收集樣品圖28.經(jīng)反相液相層析后所收集的蛋白TSG樣品的SDS-PAGE結(jié)果的凝膠掃描。定量分析顯示，目的蛋白TSG在收集樣品蛋白中的純度為90.608%.圖29-A，圖29-B，圖29-C，圖29-D，圖29-E.蛋白TSG的N端1-15個氨基酸的測序報告。氨基酸序列測定分析報告顯示蛋白TSG的N末端15個氨基酸序列為MRKRKPVAHVVANPQ，與理論序列相符(ABIPR0CISE491測序儀)。圖30.TSG/5XNFBS-SCP-/^J7777"t復合藥物的瓊脂糖凝膠遷移延遲試驗，對非病毒載體蛋白TSG的結(jié)合攜帶DNA的能力進行評價。第l孔DNA分子量標準DL15，000(15000bp,10000bp,7500bp，5000bp,2500bp,1000bp,250bp)。第2至第8孔不同質(zhì)量比的蛋白TSG與DNA的孵育產(chǎn)物。圖31-A，圖31-B，圖31-C.熒光顯微鏡下觀察細胞分別經(jīng)脂質(zhì)體/pEGFP-Nl和TSG/pEGFP-Nl轉(zhuǎn)染。圖32.脂質(zhì)體/pEGFP-Nl，以及蛋白TSG/pEGFP-Nl對三個細胞株的轉(zhuǎn)染效率的分析比較。圖33.不同工作濃度的蛋白TSG/DNA復合物，或蛋白TSG單獨應(yīng)用等對腫瘤細胞株MCF-7(GRPR+NF-kB+SCP+)的殺傷作用。[以細胞增殖抑制率(%)表示，即對細胞殺傷活性]圖中顯示殺傷率與蛋白TSG/DNA復合物，或蛋白TSG單獨應(yīng)用等的劑量的依賴關(guān)系。圖34.不同工作濃度的蛋白TSG/DNA復合物，或蛋白TSG單獨應(yīng)用等對腫瘤細胞株HeLa(GRPR—NF-kB+SCP+)的殺傷作用。[以細胞增殖抑制率(%)表示，即對細胞殺傷活性]圖中顯示殺傷率與蛋白TSG/DNA復合物，或蛋白TSG單獨應(yīng)用等的劑量的依賴關(guān)系。圖35.不同工作濃度的蛋白TSG/DNA復合物，或蛋白TSG單獨應(yīng)用等對非腫瘤細胞株CCC-ESF-1(GRPR—NF-kB+SCF)的殺傷作用。[以細胞增殖抑制率(％)表示，即對細胞殺傷活性]圖中顯示殺傷率與蛋白TSG/DNA復合物，或蛋白TSG單獨應(yīng)用等的劑量的依賴關(guān)系。圖36.不同工作濃度的蛋白TSG的單獨應(yīng)用分別對MCF-7、HeLa、CCC-ESF-1三個細胞株的殺傷作用。[以細胞增殖抑制率(%)表示，即對細胞殺傷活性]圖中顯示殺傷率與蛋白TSG單獨應(yīng)用的劑量的依賴關(guān)系。圖37.蛋白TSG/麗A復合物，或蛋白TSG單獨應(yīng)用等在最高工作濃度時對于MCF-7、HeLa和CCC-ESF-1這三個細胞株的殺傷作用。[以細胞增殖抑制率(%)表示，即對細胞殺傷活性]具體實施方案本發(fā)明的復合藥物的總體設(shè)計見圖1。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明提供了一種非病毒載體，其本質(zhì)是一種靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由細胞因子突變體多肽、富含堿性氨基酸并包含核定位序列的多肽，和受體配體多肽組成。根據(jù)本發(fā)明，所述細胞因子突變體多肽是腫瘤壞死因子a(頂Fa)突變后序列TNFam2;所述富含堿性氨基酸并包含核定位序列的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON或其片段；所述受體配體多肽是能夠與GRPR相結(jié)合的GRP或相關(guān)片段，類似物或突變體。本發(fā)明的非病毒載體所包含的各多肽的DNA編碼序列均取自人基因組，以避免其表達產(chǎn)物對人體的免疫原性。優(yōu)選地，所述細胞因子突變體多肽TNFam2，是TNFa的強效、低毒突變體；其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其DNA編碼序列如SEQIDNO.2所示。優(yōu)選地，所述富含堿性氨基酸并包含核定位序列的多肽是DNA結(jié)合蛋白SON的包含53個氨基酸的片段S0N2;其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。其DNA編碼序列為S0N2原序列(如SEQIDN0.4所示)和已經(jīng)過大腸桿菌偏愛密碼子改造的序列，如SEQIDNO.5所示。優(yōu)選地，所述受體配體多肽是GRP;其氨基酸序列如SEQIDN0.6所示。其DNA編碼序列如SEQIDNO.7所示。特別優(yōu)選地，所述非病毒載體是TNF咖2-S0N2-GRP(TSG)，即自N端至C端依次由TNFam2多肽、S0N2多肽和GRP多肽組成，其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。其DNA編碼序列如SEQIDNO.9所示。優(yōu)選地，通過基因工程方法經(jīng)體外重組獲得融合基因，并在原核細胞中表達該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。在本發(fā)明的實施方案中，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的序列，或其野生型核苷酸序列，其編碼融合蛋白TSG。TSG自N端至C端依次包括TNFam2的151個氨基酸、S0N2的53個氨基酸和GRP的27個氨基酸，其中堿性氨基(賴氨酸和精氨酸)共44個。TSG的氨基酸序列如SEQIDN0.8所示。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述融合基因克隆在溫度控制型原核表達載體pCWlll的PL-SI)的下游，成為PL-SD-7M^^-5WA^-67尸f即PL-SD-757^,命名為pCW-75K。(該溫度控制型原核表達載體pCWlll，即為陳偉京等于2001年12月發(fā)表于《中國醫(yī)學科學院學報》第23巻第6期的題目為《在大腸桿菌中以融合蛋白高效表達基因工程產(chǎn)品人心鈉素》的文獻中公丌的pCWl載體。pCWlll的核苷酸序列如S印IDNO.14所示)[4]。該重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得可以表達融合蛋白的工程菌。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本非病毒載體和一種表達型DNA重組體的復合藥物，以用于靶向性惡性腫瘤的基因治療，所述表達型重組體包含一種表達對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明所述對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌外毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他一切對細胞具有殺傷能力的來自人體、動植物或者微生物的蛋白，或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物；以及人工合成的對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)或多肽及其編碼基因。優(yōu)選地，其中所述的對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌外毒素，或者是其第二或第三功能結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明將綠膿桿菌外毒素PE的第三結(jié)構(gòu)域的C末端的5個氨基酸殘基REDLK的密碼子突變?yōu)镵DEL的密碼子，并引入終止密碼子，從而得到一種DNA重組體，即尸^7/iy^"為了增強毒素基因/^7^M/t在人體內(nèi)表達的安全性，減少其毒副作用，本發(fā)明設(shè)計在毒素基因的上游插入了5個拷貝的NF-kB結(jié)合位點(5XNFBS)和survivincorepromoter(SCP)，以期將毒素基因的表達限制在腫瘤細胞內(nèi)。有鑒于此，本發(fā)明構(gòu)建了5XNFBS-SCP-/^7/7/W毒素基因重組體。優(yōu)選地，所述對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌外毒素第三功能結(jié)構(gòu)域或其突變體，其中所述突變體PEIIImut的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。其DNA編碼序列/^////K/f如SEQIDNO.11所示。在本發(fā)明的實施方案中，首先應(yīng)用熒光酶基因作為報告基因以檢測本發(fā)明所設(shè)計的調(diào)控元件5XNFBS-SCP的功能與調(diào)控效果。所述的5XNFBS的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。所述的SCP的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。運用pGL3系列載體(購于Promega)構(gòu)建了表達型重組體5XNFBS-SCP-Z"c(艮卩kBsite-survivincorepromoter-_Z"ci/erase)禾口Psv40-ZwrEsv40(作為對照的SV40promoter-J"ci/erase-SV40enhancer)。通過檢測熒光酶基因分別在腫瘤特異性5XNFBS-SCP的驅(qū)動下和在無特異性的構(gòu)成型SV40promoter與SV40enhancer的驅(qū)動下其表達情況的不同，從而驗證本發(fā)明設(shè)計的5XNFBS-SCP的調(diào)控作用的腫瘤特異性。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的復合藥物為130/5\^83-5[-/^//7/^^。如前文所述，非病毒載體中的GRP引導該復合藥物結(jié)合到GRPR+腫瘤細胞和正常細胞的表面，并經(jīng)細胞的內(nèi)吞作用進入此類細胞。但該復合藥物中的毒素基因只在NF-KB+SCP+的腫瘤細胞內(nèi)表達，從而殺傷13該GRPR'的腫瘤細胞；而該復合藥物中的毒素基因不能在NF-kB—SCP—的if.常細胞內(nèi)表達，TF.常細胞將不被殺傷。作為對照的TSG/Psv40-尸i57/i/m/t-Esv40的檢測結(jié)果表明，在構(gòu)成型啟動子SV40promoter和增強子SV40enhancer的驅(qū)動下，毒素基因的表達不具有腫瘤細胞特異性既殺傷腫瘤細胞、也殺傷正常細胞，出現(xiàn)了嚴重的毒副作用。因此，該重組體無應(yīng)用前景。同時，通過RT-PCR證實/^7/iM7t在5XNFBS-SCP的引導下能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄與表達。MTT檢測與流式細胞儀檢測結(jié)果，都證實了毒素基因/^7//歷"t的表達所產(chǎn)生的腫瘤細胞特異性細胞殺傷作用。此同時，本發(fā)明還利用綠色熒光蛋白基因的表達比較研究了本非病毒載體與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的不同。再，本發(fā)明把毒素蛋白的表達限制在細胞內(nèi)，這就相當于比較徹底避免了毒素蛋白的免疫原性問題。隨著靶細胞的死亡，毒素蛋白質(zhì)將隨著靶細胞的降解而被降解，一并被機體清除機制所清除。以下通過實施例進一歩描述本發(fā)明。實施例1重組質(zhì)粒5XNFBS-SCP-Z"c(即5XkBsites-survivincorepromoter-J"ci/ersse)的構(gòu)建1.1SCP(艮卩survivincorepromoter)序歹U的克隆已證實，位于人survivin基因的DNA序列(14796bp)的第2543-2811位的長度為269bp的SCP所引導的基因表達具有腫瘤特異性。為利用熒光素酶報告基因表達系統(tǒng)對其予以評價，SCP將通過載體MCS中的A7eI和5kgI位點插入載體。首先將其接入pMD18_Tsimplevector[購自寶生物工程(大連)有限公司(TAKARA)]。據(jù)GenBank提供的人survivin基因的DNA序列設(shè)計引物，以人基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)，得到長度為287bp的目的片段-MeI—SCP—5"/ffaI-(見圖2)。將該片段與線性pMD18-Tsimplevector相連。利用菌液PCR對連接產(chǎn)物進行鑒定，得到產(chǎn)物為287bp片段的陽性克隆(見圖3)。將此有目的片段插入的陽性重組質(zhì)粒命名為T-SCP。測序結(jié)果顯示所得序列與GenBank提供的序列吻合。1.25XNFBS(S卩5XkBsites)序列的克隆NF-kB結(jié)合位點(kBsite)是呈腫瘤細胞特異性高表達和激活的轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的DNA結(jié)合序列。5XNFBS即包含5個拷貝的NF_kB結(jié)合位點的DNA片段。每個拷貝為14bp，即tggggactttccgc(其中的gggactttcc為結(jié)合位點，余為旁側(cè)序列)。5個連續(xù)拷貝共70個核苷酸。依此，設(shè)計兩條退火用單鏈DNA，以兩者的退火產(chǎn)物為模板進行PCR反應(yīng)，得到長度為106bp的目的片段-f/mI-5XNFBS-5"acI-(見圖4)。1.3重組質(zhì)粒SCP-(艮卩survivincorepromoter-Juci/"erase)的構(gòu)建質(zhì)粒T-SCP與熒光素酶報告基因表達載體pGL3-Basic分別進行MeI和I雙酶切，分別得到277bp小片段，即AfteI—SCP—5k3I，和4811bp大片段。將兩片段相連接得到經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒SCP-Z"c(5088bp)。1.4重組質(zhì)粒5XNFBS-SCP-的構(gòu)建將片段-,/wI-5XNFBS-5"acI-與重組質(zhì)粒SCP-Z恥'分別進行I和feeI雙酶切，得到93bp小片段，即/T/otl-5XNFBS-5"acI，和5082bp大片段。將兩片段相連接。將連接產(chǎn)物經(jīng)/Tp/7I、&cI雙酶切鑒定(見圖5)及送測序(見圖6)，證實己得到正確的重組質(zhì)粒5XNFBS-SCP-Z〃c(5175bp)。實施例2其他多種熒光素酶報告基因表達重組體的構(gòu)建2.1重纟且質(zhì)豐立SCP_ZwrEsv40(艮卩survivincorepromoter—7wci/"erase"SV40enhancer)的構(gòu)建將來自實施例1.3的277bp片段MeI—SCP—5"鵬I，借位點順eI和S鵬I插入質(zhì)粒pGL3-Enhancer。經(jīng)證實已得到正確的重組質(zhì)粒SCP-Z"rEsv40。2.2重組質(zhì)粒5XNFBS-Z〃c(即kBsite-^;ci/arase)的構(gòu)建將來自實施例1.4的93bp片段I-5XNFBS-&cI，借位點I和&cI插入質(zhì)粒pGL3-Basic。經(jīng)證實已得到正確的重組質(zhì)粒5XNFBS-Z〃c。2.3重組質(zhì)粒5XNFBS—SCP—Z〃^Esv40(即kBsites-survivincorepromoter-Jwcj'/ersse"SV40enhancer)的構(gòu)建將來自實施例1.4的93bp片段Jp/I-5XNFBS-&jcI，借位點必/7I和I插入重組質(zhì)粒SCP-^y^Esv40。經(jīng)證實己得到正確的重組質(zhì)粒5XNFBS-SCP-^y^Esv40。實施例3由脂質(zhì)體介導熒光素酶報告基因表達重組體的瞬時轉(zhuǎn)染，對調(diào)控序列所引導的基因表達的腫瘤特異性予以評價。3.1將上述^/ci/erase表達載體進行大量提取。包括(1)Psv40-Z〃C"Esv40(2)SCP-(3)5XNFBS-SCP-Z"c(4)SCP-ZEsv40(5)5XNFBS-SCP-ZEsv40(6)5XNFBS-Z〃c3.2各種形式調(diào)控序列引導基因表達情況檢測由脂質(zhì)體介導，將上述^ciTersse表達載體分別對三個腫瘤細胞株(人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231，和人宮頸癌細胞株HeLa;三者均為NF-kB+SCP+);和一個非腫瘤細胞株(人胚胎皮膚成纖維細胞株CCC-ESF-1，為NF-!cB+SCP—)分別進行瞬時轉(zhuǎn)染；并對所收獲細胞進行雙熒光素酶活性檢測和整理分析。其中，NF-kB+示NF-kB處于激活狀態(tài)；其在成體正常細胞一般處于失活狀態(tài)，為NF-kB—。SCP+表示SCP能夠引導基因高水平表達；CCC-ESF-l所引導的基因表達處于極低的水平，表示為SCP—(同成體正常細胞)。將各調(diào)控序列在各細胞株所引導的^/w'/erae的表達結(jié)果作圖(見圖7)。經(jīng)統(tǒng)計學分析，可知5XNFBS-SCP(即kBsites-survivincorepromoter)在進行比較的調(diào)控序列中，其所引導的基因表達具有最高的腫瘤細胞特異性。其在成體正常細胞(NF-KB—SCP")中所引導的基因表達水平應(yīng)將更低于在CCC-ESF-1(NF-kB+SCP—)的水平，說明5XNFBS-SCP表現(xiàn)很強的腫瘤細胞特異性。實施例4腫瘤特異性表達重組體5XNFBS-SCP-/^7/7/zw^和組成性表達重組體Psv40-/^///My卜Esv40的構(gòu)建4.1/^//i/7H7f序列的克隆依據(jù)以PE的天然編碼序列為模板進行PCR反應(yīng)，得到(PE天然編碼序列中的第400-608位氨基酸)-KDEL所對應(yīng)的編碼序列，且?guī)虢K止密碼子和酶切位點，進行引物設(shè)計。經(jīng)PCR反應(yīng)得到666bp的目的產(chǎn)物-Afco1-/^777/"卜^3I-(見圖8)。4.2腫瘤特異性表達重組體5XNFBS-SCP-/^/7//^f的構(gòu)建將片段-AfcoI-/^/J7/Bi^-J/^I-進行AfcoI和J6sI雙酶切，得到652bp片段AfcoI-/^77i/wt-J/I。將質(zhì)粒5XNFBS-SCP-Zwc同樣進行AfcoI和JfeI雙酶切，得到3519bp片段。將兩片段相連接。經(jīng)菌液PCR鑒定，得到產(chǎn)物為666bp片段的陽性克隆(見圖9)。經(jīng)I和J6aI雙酶切鑒定，得到兩片段分別為652bp和3519bp;經(jīng)￡co7V單酶切鑒定，得到一個線性片段(見圖10)。測序結(jié)果顯示已得到正確的重組質(zhì)粒5乂^83-30-/^///歷^(4171bp)(見圖11)。4.3組成性表達重組體Psv40-/^/T7/ZK7f-Esv40的構(gòu)建將上述652bp片段I-/^/J7/z7^-ZZI，插入質(zhì)粒pGL3-Control,經(jīng)證實得到正確的重組質(zhì)粒PsvAO-Z^/iT/m/f-EsvAC^腫瘤特異性表達重組體5XNFBS-SCP-/^7/iyz"t和組成性表達重組體Psv40-/^i7iM/t-Esv40的構(gòu)建步驟，如圖12所示。實施例5通過RT-PCR證實/^////^f在5XNFBS-SCP的引導下能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄。由脂質(zhì)體介導腫瘤特異性表達重組體5XNFBS-SCP-Z^/J/孤"對腫瘤細胞株MDA-MB-231(NF-icB+SCP+)的瞬時轉(zhuǎn)染。以提取的總RNA作為模板，進行RT-PCR反應(yīng)。所得到的目的產(chǎn)物為356bp，證實/^J/iy^t在5XNFBS-SCP的引導下能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄與表達(見圖13)。實施例6對腫瘤特異性表達重組體5XNFBS-SCP-/^7iTy^t和組成性表達重組體PsvAO-Z^J/iM/t-Esv^的細胞殺傷作用進行MTT檢測由脂質(zhì)體分別介導5XNFBS-SCP-尸^/7/m^和組成性表達重組體Psv40-/^/77y7i/卜Esv40的瞬時轉(zhuǎn)染，進行MTT檢測分析。以空白組調(diào)零，利用吸光值計算細胞增殖抑制率(％，以此表示細胞殺傷活性)，計算公式細胞增殖抑制率(%)=[(對照組-實驗組)/對照組]乂100%轉(zhuǎn)染用細胞為兩個腫瘤細胞株(MCF-7和HeLa，均為NF-kB+SCP+)和一個非腫瘤細胞株(CCC-ESF-l，為NF-kB+SCP—)。MTT檢測結(jié)果，即細胞殺傷活性，以細胞增殖抑制率(％)表示。作圖(見圖14)并作表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>經(jīng)證實5XNFBS-SCP-/^7/i/w/t能夠?qū)崿F(xiàn)/^//7/ffl^的腫瘤細胞特異性表達，并產(chǎn)生相應(yīng)的腫瘤特異性細胞殺傷作用。其所產(chǎn)生的細胞殺傷作用，在腫瘤細胞株(NF-icB+SCP+)處于較高的水平；而在非腫瘤細胞(NF-kB+SCP—)則極低，僅等同于由于脂質(zhì)體或外源DNA的添加所產(chǎn)生的作用。實施例7AnnexinV-FITC聯(lián)合PI法的流式細胞儀檢測，進一步證實5XNFBS-SCP-尸i7/i/^t產(chǎn)生腫瘤細胞特異性細胞殺傷作用和機制。依據(jù)流式細胞儀檢測報告結(jié)果(見圖15)，進行整理分析(表格如下)。證實5XNFBS-SCP-/^//7/zW能夠產(chǎn)生腫瘤細胞特異性細胞殺傷作用。表中數(shù)值為各類細胞占細胞總數(shù)百分比(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例8含融合基因7M^/^-5"OViW;y尸的非病毒載體蛋白表達重組體pCW-:T5^的構(gòu)建這里所使用的表達型載體質(zhì)粒pCWlll是本實驗室自行構(gòu)建的。它以常用的原核質(zhì)粒pBR322為基礎(chǔ)。在原四環(huán)素抗性基因Tetr位點處克隆入一個X噬菌體的PL啟動子和適于大腸桿菌系統(tǒng)的SD序列。一股而言，為要獲得目的基因的高表達，則把該基因克隆于PL-SD的下游；如這里的PL-SD-7M^^-5"(9A2W^/7。為控制PL啟動子的作用，在PL的上游插入一個人噬菌體的CI-857基因。在工程菌培養(yǎng)溫度為32nC時，CI-857表達出一種蛋白，并結(jié)合到PL啟動子上，使之處于被阻遏狀態(tài)。一旦要求PL啟動子發(fā)揮驅(qū)動作用，則將工程菌的培養(yǎng)溫度升高至42"C，在這種情況下，CI-857基因?qū)⒉槐磉_，PL啟動子去阻遏，繼之發(fā)揮驅(qū)動其下游目的基因表達的作用。該策略來自X噬菌體基因關(guān)系的研究結(jié)果，而且已被諸多基因工程載體構(gòu)建工作所采用。組裝在PBR322載體質(zhì)粒上的Apm「等基因在pCWlll上保持在原位置上。與此載體相匹配的宿主細胞，一般采用大腸桿菌DH5a。pCWlll的全序列如SEQIDNO.14所示。pCWlll是一個成熟的表達型原核載體，曾用以表達多種目的基因均獲得成功。TNFam2是野生型TNFa經(jīng)過原第1至7位氨基酸的缺失，以及原第8至10位氨基酸由Pro-Ser-Asp替換為Arg-Lys-Arg而得到強效、低毒的突變體(151個氨基酸)(氨基酸序列見SEQIDNO.1，DNA編碼序列見SEQIDNO.2)。S0N2片段(53個氨基酸)包括核定位序列且以堿性氨基酸為主要組成，用于表達的編碼序列己進行大腸桿菌偏好密碼子的替換(氨基酸序列見SEQIDNO.3，DNA編碼序列見SEQIDNO.5)。GRP為全長27個氨基酸(氨基酸序列見SEQIDNO.6，DNA編碼序列見SEQIDNO.7)。三個結(jié)構(gòu)域之間借柔性連接短肽linker(各含10個氨基酸)相連(氨基酸序列見SEQIDNO.15，DNA編碼序列見SEQIDNO.16)。8.1重組體pCW-7XpCW-5X的構(gòu)建經(jīng)PCR反應(yīng)分別獲得目的產(chǎn)物-yWeI-(7M^邁2-h'/^er)-i5boyI-(498bp)和-fco/PI-^WA^^mWI-(184bp)(見圖16)。將兩片段及表達載體pCWlll分別經(jīng)雙酶切(yWeI與&MI，^b^I與^3/^1)，并將各自的酶切產(chǎn)物大片段回收連接。所得到的連接產(chǎn)物經(jīng)yWel和^^WI雙酶切鑒定，陽性克隆得到產(chǎn)物分別為656bp和4887bp(見圖17)，并經(jīng)測序證實已得到完全正確的重組體pCW-r5"(5543bp)。經(jīng)PCR反應(yīng)分別獲得目的產(chǎn)物-/WeI-5"6Wi^5)肪I-(184bp)，和-5"鵬I-(h'Mer-CA"-泡/ff〃I-(137bp)。將兩片段及表達載體pCWlll分別經(jīng)雙酶切(M/eI與5"/z;sI，5feal與fe歷〃1)，并將各自的酶切產(chǎn)物大片段回收連接。所得到的連接產(chǎn)物經(jīng)A^eI和及mWI雙酶切鑒定，陽性克隆得到產(chǎn)物分別為287bp和4887bp(見圖18)，并經(jīng)測序證實已得到完全正確的重組體pCW-5^(5174bp)。8.2表達重組體pCW-75^的構(gòu)建以重組體pCW-7^為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)得到-A^eI-(7M^z^-h'/Aer)-I-5"6)A^"5"鵬I-(667bp)(見圖19)。將該片段與重組體pCW-5^分別進行/fcfeI和5k3I雙酶切，并分別回收大片段，即分別為/WeI-(7M^/z^-h'/^er)-feo7I-5WA^5k3I(652bp)禾卩pCW-57aI-("'/^e/-6^/^-fe/a￥I(5008bp)，將兩片段相連。所得到的連接產(chǎn)物經(jīng)菌液PCR鑒定，陽性克隆得到產(chǎn)物符合786bp(見圖20)，經(jīng)測序證實已得到完全正確的表達重組體pCW-75K(5660bp)。(測序結(jié)果見圖21)非病毒載體蛋白TNFam2-S0N2-GRP(TSG)的表達重組體pCW-75^的構(gòu)建步驟，，如圖22所示。實施例9融合基因r56"的誘導表達、包涵體提取與檢測9.1誘導表達和包涵體提取9.1.1大體積溫控誘導表達18取包含表達重組體pCW-7:SY的工程菌液50u1接種至5ml含氨芐LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12hr。將所得到的5ml菌液全部接種至300ml含氨芐LB液體培養(yǎng)基，32°C振蕩培養(yǎng)12hr。將所得到的300ml菌液平均接種至4L含氨芐LB液體培養(yǎng)基中(500ml/瓶，共8瓶)，32°C振蕩培養(yǎng)4hr至0D值達到0.6，置42。C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4hr。9.1.2菌體收集與洗滌6，000g離心15min收集菌體，稱重濕菌體。向菌體沉淀加入3%TritonX-100洗滌液，室溫攪拌30min充分懸浮菌體。6，OOOg離心15min收集菌體沉淀。(按照10ml-50ml緩沖液/lg濕菌體的比例，本研究采用200ml)9.1.3溶菌酶破細胞用細胞裂解緩沖液(50mMTris-HC1，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-IOO，lmg/ml溶菌酶。pH8.5-9.0)將菌體懸浮，室溫下繼續(xù)攪拌30min，使懸液因溶菌酶的作用而粘稠。9.1.4超聲破細胞先冰浴5分鐘。超聲波功率約70W，每次作用5sec，共100次，每次間隔20sec。至液體不再粘稠。為防止因超聲產(chǎn)熱對蛋白產(chǎn)生破壞作用，使用玻璃燒杯盛裝待處理菌體裂解產(chǎn)物，且全程于冰水浴中；超聲探頭深入液面及距燒杯底部的距離都需大于3cm。超聲完畢，6，000g離心15min收集沉淀。9.1.5包涵體洗滌與溶解用5%TritonX-100洗滌緩沖液徹底懸浮沉淀，并超聲波處理30次。6，OOOg離心15min收集沉淀。再分別使用尿素緩沖液、鹽酸胍緩沖液懸浮沉淀，超聲波處理并離心收集沉淀。用35ml包涵體溶解液充分溶解包涵體沉淀，得到包涵體溶液。9.2蛋白鑒定9.2.1SDS-PAGE蛋白電泳電泳將上述各步的上清和沉淀留樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。在Tris-甘氨酸電泳緩沖液中，選擇恒流電泳。即首先以8mA使樣品通過濃縮膠；當溴酚藍泳至兩層膠的分界處時，再以12mA的電流至溴酚藍剛泳出分離膠。9.2.2凝膠的染色與脫色電泳結(jié)束后，小心取下凝膠，用至少5倍于凝膠體積的考馬斯亮藍染色液浸泡凝膠，室溫振搖染色4hr以上。回收染液，將凝膠浸泡于脫色液中振搖，更換脫色液數(shù)次，直至蛋白條帶清晰顯示。9.2.3凝膠分析將留存的包涵體提取各步驟的上清與沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(見圖23，24)。經(jīng)與依據(jù)蛋白TSG的理論氨基酸序列計算得到的平均分子量所對應(yīng)位置的比對，證實目的蛋白TSG以包涵體表達形式表達；在包涵體的提取過程中，其損失情況不明顯。626nm波長的凝膠掃描定量分析結(jié)果顯示，目的蛋白TSG的表達量占經(jīng)誘導全菌體表達蛋白總量的37.819%(見圖25)。實施例IO對包涵體中的目的蛋白TSG利用反相高效液相層析進行純化，并復性10.1反相柱的準備起始緩沖液(A液):10%乙睛，0.05%TFA;洗脫緩沖液(B液):90%乙睛，0.1%TFA。反相柱自填6mlSourcel5RPC樹脂；柱床(CV)=12ml。利用A液清洗機器管路，并在25min內(nèi)達到A液的柱平衡。再采用梯度上升的方式，在5min內(nèi)達到B液的柱平衡。隨后，重新瞬時恢復至A液的柱平衡。10.2上樣將得到的包涵體溶液14，000卬m離心10min后，取上清經(jīng)過0.22um孔徑濾膜，得到包涵體上樣用液。當達到A液柱平衡后，用上樣注射器吸取樣品3ml推入上樣柱(不要引入氣泡)，并設(shè)置流速為3ml/min。10.3蛋白的洗脫與目的蛋白的收集流速保持在3ml/min。上樣后8min，開始實施蛋白的B液梯度洗脫(B液在30min內(nèi)由0%梯度升至100%)，隨之，流動相的極性將逐漸增加，相應(yīng)極性的蛋白組分從固定相洗脫下來，隨洗脫液出柱，A260和A280監(jiān)測，收集相應(yīng)的明顯的洗脫峰所對應(yīng)的洗脫液(見圖26)。10.4層析收集樣品的SDS-PAGE電泳檢測。將反相層析收集樣品，以及上柱樣品、菌體樣品，一同進行SDS-PAGE電泳檢測，鑒定含有目的蛋白的洗脫收集樣品(見圖27);對此樣品所對應(yīng)電泳結(jié)果進行凝膠掃描顯示目的蛋白TSG的量占該樣品的蛋白總量的90.608。/。(見圖28)。10.5蛋白的復性將含有目的蛋白的洗脫收集樣品分裝至透析袋(15ml/袋)，分別在2L透析緩沖液透析5小時；再重復一次。將透析袋中的蛋白樣品收集混勻，存放于4'C。實施例ll融合蛋白TSG的測定11.1BCA法蛋白定量經(jīng)復性得到蛋白樣品，使用BCAProteinAssayReagentkit(PIERCE),按照產(chǎn)品說明書所提供方法，在96孔板進行顯色反應(yīng)，酶標儀測定各孔在光波562nm時的吸收值；再利用以標準白蛋白樣品(BSA，2mg/ml)所作的蛋白濃度與光吸收值的二維標準曲線，得到吸收值所對應(yīng)的蛋白濃度(mg/ml)。經(jīng)定量檢測，蛋白樣品的濃度為1.2mg/ml。共50ml，因此經(jīng)復性所得到的蛋白總量為60mg，因來自12.21g濕菌體，蛋白得率為4.9mg/g。11.2N端氨基酸序列測定(見圖29)報告顯示蛋白TSG的N末端15個氨基酸序列為MRKRKPVAHVVANPQ，與理論序列相符。實施例12復合藥物的制備與轉(zhuǎn)染靶向性12.1瓊脂糖遷移延遲分析融合蛋白TSG作為非病毒載體，通過靜電作用與目的質(zhì)粒形成蛋^質(zhì)/DNA復合物。將兩者以不同的比例進行孵育并進行瓊脂糖凝膠電泳，比較遷移率變化情況，當比例合適以形成蛋白/DNA復合物，則呈明顯的出孔延遲現(xiàn)象。檢測結(jié)果顯示，制備蛋白TSG/質(zhì)粒5XNFBS-SCP-Z^7/iMyt復合物，選擇兩者質(zhì)量比為4:1(見圖30)。12.2蛋白TSG/DNA復合物的轉(zhuǎn)染蛋白TSG與綠色熒光蛋白報告載體pEGFP-Nl(購自BDBioscience)以質(zhì)量比4:1進行孵育形成復合物對細胞進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)果熒光照片見圖31，并計算轉(zhuǎn)染效率為<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>并作圖(見圖32)。轉(zhuǎn)染效率的檢測結(jié)果顯示，融合蛋白TSG作為非病毒載體，與質(zhì)粒DNA形成復合物所產(chǎn)生的細胞轉(zhuǎn)染呈GRPR+細胞靶向性。實施例13融合蛋白TSG/毒素基因腫瘤特異性表達重組體5XNFBS-SCP-/^7///^t復合藥物及融合蛋白TSG單獨應(yīng)用的殺傷細胞實驗13.1MTT法檢測復合物及融合蛋白TSG單獨應(yīng)用對細胞的殺傷作用。待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒毒素基因組成性表達型重組體Psv40-/^7///^t-Esv40毒素基因腫瘤特異性表達型重組體5XNFBS-SCP-/^///M;t待轉(zhuǎn)染用蛋白TSG待轉(zhuǎn)染細胞株腫瘤細胞株MCF-7(GRPR+NF-kB+SCP+);HeLa(GRPR—NF-kB+SCP+);非腫瘤細胞株CCC-ESF-1(GRPR—NF_kB+SCP—)轉(zhuǎn)染用制劑1ip/Psv40U/麗卜Esv40;TSG/Psv40-尸￡/77孤"-Esv401ip/5XNFES-SCP-Z^TT/ffli/t;TSG/5XNFBS-SCP-ProteinTSG;5XNFBS-SCPUJ/威liposomeDNA分別采用四種工作濃度，艮卩1.33嗎/ml，2.00嗎/ml，4.00嗎/ml禾卩8.0(Hig/ml。所對應(yīng)的蛋白TNFam2-S0N2-GRP的工作濃度分別為各自DNA濃度的4倍。13.2殺傷細胞實驗結(jié)果整理并統(tǒng)計學分析經(jīng)MTT檢測得到的結(jié)果[以細胞增殖抑制率(％)表示]:MCF-7HeLaCCC-ESF-1(GRPR+NF-kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP—)1ip/Psv40-尸肌/邁"-Esv40(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>對復合物在最高工作濃度所對應(yīng)的結(jié)果(％)進行統(tǒng)計學分析MCF-7HeLaCCC-ESF-l(GRPR+NF--kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP—1lip/Psv40-尸肌/邁"卜Esv4051.98±3.7267.08±5.1645.42±6.292TSG/Psv40-尸肌/啦卜Esv4057.53±4.1226.18±1.3819.03±2.5631ip/5XNFBS-SCP-尸肌/邁z/f46.80±3.3152.48±6.2911.31±1.374TSG/5XNFBS-SCP-尸J5777邁W63.15±4.2325.07±2.3918.86±1.515ProteinTSG37.26±5.7935.89±2.3726.89±2.5865XNFBS-SCP-尸肌/邁"1.86±0.152.03±0.312.35±0.737liposome5.58±0.754.83±0.315.33±1.06第i組與第2組比較P>0.05P〉0.05P<0.01第3組與第4組比較P〈0.05P〈0.01P>0.05第2組與第4組比較P〉0.05P>0.05P>0.05第1組與第5組比較P<0.01P>0.05P>0.05第2組內(nèi)分別與CCC-ESF-1比較P<0.01P>0.05第4組內(nèi)分別與CCC-ESF-1比較P<0.01P>0.05第5組內(nèi)分別與CCC-ESF-1比較P〉0.05P〉0.05上述結(jié)果表明，由融合蛋白TSG與毒素基因的限制性表達重組體5XNFBS-SCP-/^7/7/wyt組裝形成的新型復合藥物TNFam2-S0N2-GRP/5XNFBS-SCP-Z^i7iM/t，對腫瘤細胞株MCF-7(GRPR+NF-kB+SCP+)的細胞殺傷作用處于較高水平；對腫瘤細胞株HeLa(GRPR—NF-kB+SCP+)和非腫瘤細胞株CCC-ESF-1(GRPR—NF-kB+SCP—)的作用則顯著降低。其細胞殺傷活性與GRPR有關(guān)，參照5XNFBS-SCP引導基因表達的特征，該復合藥物的細胞殺傷活性應(yīng)呈GRPR+腫瘤細胞靶向性。該復合藥物通過非病毒載體蛋白TSG的GRP結(jié)構(gòu)域與GRPR的靶向結(jié)合，在GRPR+腫瘤細胞(此類腺癌普遍表現(xiàn)為GRPR過表達，且往往對化療與放療不敏感，有抗性)表面發(fā)生大量富集并經(jīng)細胞的內(nèi)吞作用進入細胞，實現(xiàn)毒素基因/^7/7M7t表達，從而殺傷此類腫瘤細胞。同時，載體蛋白中的TNFani2的信號轉(zhuǎn)導可能增強此殺傷作用。對于GRPR+正常細胞，細胞表面GRPR數(shù)目遠低于GRPR+腫瘤細胞(呈指數(shù)關(guān)系)，而且/^////z"t在5XNFBS-SCP的控制下在此正常細胞內(nèi)不表達，因此不能殺傷正常細胞?？紤]到體內(nèi)實驗與體外實驗的不同情況，預期在體內(nèi)實驗所得到的對GRPR+TNFR+正常細胞的殺傷作用較體外實驗將處于更低的水平。對于GRPR的機體絕大多數(shù)正常細胞，則不發(fā)生本復合藥物同細胞表面GRPR的耙向結(jié)合及內(nèi)吞作用，本復合物將不殺傷這些細胞。融合蛋白TSG的獨立應(yīng)用所產(chǎn)生的殺傷細胞作用，雖未表現(xiàn)顯著的GRPR+腫瘤細胞特異性,但TNF咖2己成為常規(guī)藥物應(yīng)用于臨床對惡性腫瘤的治療，因此，其毒副作用應(yīng)不超出臨床允許的范圍。本發(fā)明所得到的初步體外細胞水平的生物學活性檢測結(jié)果及其分析表明，TNFam2-SON2-GRP/5XNFBS-SCP-Z^Zr/M^復合物與TNFam2-SON2-GRP的單獨應(yīng)用，均有實際應(yīng)用前景。參考文獻1.MorG，SinglaM，SteinbergAD，HoffmanSL，OkudaK,KlinmanDM.DoDNAvaccinesinduceautoimmunediseaseHumGeneTher.1997Feb10;8(3):293陽300.2.NakamuraS，KatoA，MasegiT，etal.Anovelrecombinanttumornecrosisfactor-alphamutantwithincreasedanti-tumoractivityandlowertoxicity,/""Cawc^r1991Jul9;48(5):744-8.3.SatoT,WatanabeN，YamauchiN,etal.Differentiationinductionbyatumor-necrosis-factormutant471inhumanmyelogenousleukemiccellsviatumor-necrosis-factorreceptor-p55.J1998Oct5;78(2):223-32.4.陳偉京，等，在大腸桿菌中以融合蛋白高效表達基因工程產(chǎn)品人心鈉素，^^^"^^/^^烷學/y2001年第23巻第6期573-9.序列表<110>中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所<120〉T型非病毒載體及包含其的復合藥物<130><160>17<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>151<212>PRT<213>人工序列<400>1MRKRKPVAHVVANPQAEGQLGWL服RANALLANGVELRDNGLVVPSEGLYL工YSGVLFKG6〇GGCPSTHVLLTHTISR工AVSYGTKVNLLSAIKSPCGRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFGL120EKGDRLSAE工NRPDYLDFAESG(2VYFG工IA151<210〉2<211>453<212>DNA<213>人工序列<400>2atgcgtaaacgcaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctc60cagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataac120cagctggtggtgcc3tcsgagggcctgtacCtC3tCt3Ctcccaggtcctcttcsa_gggc180caaggctgccCCtCC3CCC3tgtgctcctc3CCC3C3CC3tcagccgcatcgccgtctcc240taccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagsgggagacccca300gagggggctgsggccaagccctggtatgagCCC3七Ct3tCtgggsggggtcttccagctg360gsgaagggtgsccgactcagcgctgsgatcaatcggcccgactatctcgactttgccgag420tctgggcaggtctactttgggatcsttgccctg453<210〉3<211>53<212>PRT<213>人工序列<400>3KHRSKSRERKRKRSSSRDNRKTVRARSRTPSRRSRSHTPSRRRRSRSVGRRRS53<210>4<211>159<212>DNA<213>人工序列<400>4ssgcacsgatccs3gtct3gC3sgctccagggataaccga60tcgsaccccssgtcgtcgg3gtcggsgtcatactccaagt120cgtcgscg33ggtctsgstctgtgggtagaagaaggagc159<210>5<21>159<212>DMA<213>人i:序列<400>5aaacatcgtagcaaatctcgcgaacgtaaacgcaaacgttcasgctcccgtgst33ccgc60aaaaccgttcgtgcacgcagtcgcaccccgtctcgtcgcagccgtsgtcstaccccgagt120cgtcggcgtcgcagccgctctgtgggtcgtcgccggagc159<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<400>6VPLPAGGGTVLTKMYPRGNHWAVGHLM27<210>7<211>81<212>DNA<213>人工序列<400>7gtcccgctgcctgcgggcggsgggsccgtgctgaccaagatgtacccgcgcggca_accac60tgggcggtggggcacttaatg81<210>8<211>255<212>PRT<213>人工序列<400>8MRKRKPVAHVVANPQAEGQL，LNRRANAXLANGVELRDNGLVVPSEGLYL工YSQVLFKG60QGCPSTHVLLTHTISR工AVSYGTKVNLLSA工KSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQL120EKGDRLSAE工NRPDY]LDFAESGQVYFG工IALGGGGSGGGGSEFKHRSKSRERKRKRSSSR180DNRKTVRARSRTPSRRSRSHTPSRRRRSRSVGRRRSPGGGGGSGGGGSVPLPAGGGTVLT24〇KMYPRGNHWAVGHLM255<210>9<211>765<212>DNA<213>人工序列<400>9atgcgtaaacgcaagcctgtsgcccstgttgtsgcaaaccctcaagctgaggggcsgctc60cagtggctgasccgccgggccsatgccctcctggccaatggcg亡ggagctgagagataac120C3gctggtggtgcc3tcagsgggcctgtacCtC3七Ct3Ctcccsggtcctcttcaagggc180caaggctgccCCtCC3CCC3tgtgctcctc3CCC3C3CC3tcsgccgcstcgccgtctcc240sggtcMcctcctctctgccatcaagagcccctgccag3gggagaccccs30〇gagggggctgaggccssgccctggtatgagCCC3tCt3tCtgggaggggtcttccagctg360gagaagggtgaccgsctcsgcgctgsgatcaatcggcccgsctatctcg3ctttgccgag420tctgggcaggtctactttgggatcattgccctgggtggcggsggttctggtggcggaggt480tctgaattc3aacatcgtagcswtctcgcgaacgtaaacgc33scgttcasgctcccgt540gatsaccgc3aaaccgttcgtgcscgcsgtcgcaccccgtctcgtcgcagccgtsgtcat600accccgagtcgtcggcgtcgcsgccgctctgtgggtcgtcgccggagccccgggggtggc660ggaggttctggtggcggaggttctgtcccgctgcctgcgggcggagggaccgtgctgacc720aagatgtacccgcgcggcaaccsctgggcggtggggcacttaatg765<210>10<211>213<212>PRT<213>人工序列<400>10FLGDGGDVSFSTRGTG麗TVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQS工VFGGVRARS60QDLDA工WRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLA120APEAAGEVERL工GHPLPLRLDA工TGPEEEGGRLETILGWPLAERTVV工PSAIPTDPRIWG180GDLDPSS工PDYASGPGKPPKDEL213<210>11<211>639<212>DNA<213>人工序列<400>11ttcctcggcgacggcggcgacgtcagcttcagcacccgcggcacgcagaactggacggtg60gagcggctgctccaggcgcaccgccaactggsggagcgcggctatgtgttcgtcggctac120cacggcaccttcctcgaagcggcgcaasgcatcgtcttcggcggggtgcgcgcgcgcagc180caggacctcgacgcgatctggcgcggtttctatatcgccggcgatccggcgctggcctac240ggctacgcccaggaccaggaa_cccgscgc3cgcggccggatccgcaacggtgccctgctg300cgggtctatgtgccgcgctcgagcctgccgggcttctaccgcaccagcctgaccctggcc360gcgccgg己ggcggcgggcgaggtcgaacggctgatcggccatccgctgccgctgcgcctg420g3cgccatc3ccggccccg3ggaggaaggcgggcgcctggagsccsttctcggctggccg480ctggccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgstcccc3ccgacccgcgcaacgtcggc540ggcgacctcgacccgtccagcatccccgacsaggaacaggcgatcagcgccctgccggac600tacgccagccsgcccggcaaaccgccgaaggacgagctg639<210>12<211>70<212>DNA<213>人工序列<400>12tggggactttccgctggggsctttccgctggggactttccgctggggactttccgctggg60gactttccgc70<210>13<211〉269<212〉DNA<213〉人1:序列<400>13cgcgttctttgagggggcgctaggtgtgggcagggscgsgctggcgcggc60gtcgctgggtgcaccgcgaccacgggcagagccacgcggccaactcccgg120cscsccccgcgccgccccgcctctsctcccagaaggccgcggggggtggaccgcct3sgs180gggcgtgcgctcccgacatgccccgcggcgcgcc3ttsaccgcc3gstttgaatcgcggg240acccgttggcagaggtggcggcggcggca269<210>14<211>5495<212〉DNA<213>人工序列<400〉14atgtttgacagcttatcatcgstaagctttaatgcggtagttt3tcacsgttM3ttgct60ascgcsgtC3ggcsccgtgtacaatgcgctcatcgtcstcctcggcaccg120tcsccctggstgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcggg180atatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgt240tgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcc300cagtcctgctcgcttcgctacttggagccact3tcgsct3cgcgatcatggcgscc3C3c360ccgtcctgtggatctctcscatgcccccct420agataacatctgcggtgatsWtt3tCtctggcggtgttg480cactggcggtgattactgagcacatcagcsggscgcactgaggtgacgct540aagccctgaagaagggcsgcgaaggctttggggtgtgtga600agcattggccgtaagtgcgattccggattagctgccaatgtgccaatcgc660ggggggttttcgttcaggactacssctgcc3C3C3CC3CC720tccagatggatgcscaaac3cgccgccgcgaacgtcgcgcagagaaacaggctcaatgga78033gc3gcaaatcccctgttggttggggtaagcgcas33ccagttaacggccgsaagattt840tttt33Ct3t33scgctgstggaagcgtttatgcggasgaggtasagcccttcccgagta90〇atsaccccgctCtt3C3C3ttccagccctgsaaaagggca960ccacacctatggtgtatgcatttatttgca七3C3ttC33tcsattgttat1020ctaaggaaat3Cttac3tatttgsacagtgccgcaagtgg1080cagsaggcagagcgatcgctcggcaacgggagasgttggctga_tccggtc1140tggcgagastctcaatatcagaasatgcgggatactctcgaccgccgtatcgctssacsg1200aaagagcgcccsccsgccag3asagcgcgg3tctcgtggc1260ttgsaggggaggcggaggascggcgcatcgccs3tgctcttggcgctctc1320ccctgcattgcctgctatatgcatggagtaatatctaatgaggtgtctctgcaccatatc1380gccggtcgtaccgcgccgggttgtcataaaaagcaattgccsctttgt3gatggcscc3c1440cagcstgcsgctccggctgaagtaagsgaaggctggtccctgttcatgcc1500gatggtgtggttggaggcaactgcagcccggggttcgtggtccgcgttct1560<image>imageseeoriginaldocumentpage29</image>gccctustctttccctttatttttgctgcggtaagtcgcatcttcstaat4320tC33tCC3tttactatgtt3tgttctgsggttcccctaattcgatgasga4380ttcttgctcaattgttatcagctatgcgccccttgccgatcagccaaacg4440tctcttcaggccsctgact3gcgataactttCCCC3C33Cggaacaactctcattgcstg4500ggatcattgggtactgtgggtttsgtggttctgsccgctstccctgatca4560gtttcttgaaggtaaactcstC3CCCCC33gtctggctatcctggctcas4620cagcctgctcsgggtcsacgttccgtcaggasagcttggcttggsgcctg4680ttggtgcggtccttcsacctcaagccsgaactggcttttt4740tggttgtgcttscccstctctccgcstcscctttggtsaaggttctsagcttaggtgaga4800acatccctgcctgaacatgaggtactcatactcacttctsagtgacggct4860gcatactaaccgct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