專利名稱：：一種檢測豬肉質(zhì)性狀的方法一種檢測豬肉質(zhì)性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種檢測豬肉質(zhì)性狀的方法。技術(shù)背景現(xiàn)代育種技術(shù)使豬的生長速度和痩肉率等都有了很大的提高。然而，由于肉質(zhì)性狀與生長性狀以及胴體性狀在總體上存在一定的頡頏關(guān)系，在那些經(jīng)高強度選擇生長速度和胴體痩肉率的品系中，常伴隨著豬肉品質(zhì)的下降。隨著人們生活水平的提高，豬肉消費已不再單獨追求痩肉型，而是要求色、香、味具全的優(yōu)質(zhì)豬肉。與之相適應(yīng)的，豬的育種生產(chǎn)也正在向著優(yōu)質(zhì)肉豬培育的方向發(fā)展，發(fā)達國家已在1996至2000年期間將肉質(zhì)性狀納為豬的育種目標(biāo)。因此選育具有較好的肌肉顏色、pH值、系水力、肌內(nèi)脂肪和嫩度的優(yōu)質(zhì)肉豬一直是商品豬生產(chǎn)者、肉品經(jīng)營者、育種學(xué)家們孜孜不倦的追求目標(biāo)。豬肉質(zhì)性狀為屠宰后測定的性狀，常規(guī)育種方法很難對其進行選擇。遺傳是決定肉質(zhì)特性的重要因素，從總體上看，豬肉質(zhì)性狀的遺傳力為中等偏下，但不同從遺傳基礎(chǔ)上看，這些性狀受到一個或多個數(shù)量性狀位點的影響，這些數(shù)量性狀位點大部分是由多個基因組成，也有很少部分存在著主效基因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因組技術(shù)的進步，人們期望通過各種現(xiàn)代生物技術(shù)手段尋找這些主效基因和與之緊密連鎖的分子標(biāo)記以及參與這類性狀形成的基因網(wǎng)絡(luò)。近年來，采用分子生物學(xué)技術(shù)對影響豬肉質(zhì)性狀的主效基因、候選基因及QTL定位已取得迅猛發(fā)展，目前已有多個肉質(zhì)性狀的主效基因被鑒定，如導(dǎo)致PSE肉的氟烷基因(halothanegene，HAL)和增加肌糖原含量，降低腌制和烹飪火腿產(chǎn)量的效益，并引起豬肉酸化的酸肉基因(RendementNapolegene，RN)。然而這兩種主效基因僅分別在特定群體中，并已應(yīng)用于豬的標(biāo)記輔助選擇。其他與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因有(1)Gerbens等證實了位于豬6號染色體上的心臟脂肪酸結(jié)合蛋白與豬中肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)，該基因已被申請了專利，其專利號為WO97/35878;(2)激素敏感脂酶(HormoneLipase,HSL)，作為脂肪降解的限速酶，在脂肪動員過程中負責(zé)甘油三脂向甘油二脂的轉(zhuǎn)換。隨著它的活性增高，甘油三脂的分解速度增快，脂肪的沉積減少，從而降低胴體的脂肪含量。因此可把它作為標(biāo)記基因?qū)χ竞窟M行選擇?，F(xiàn)在已將HSL基因定位在豬6號染色體上6p1.l-1.2上；(3)影響肌肉嫩度的組織蛋白酶B(Cath印sinB，C75W)基因(RussoV，F(xiàn)ontanesiL，DavoliR，M,ButtazzoniL，VirgiliR,YerleM.Investigationofcandidategenesformeatqualityindry-curedhamproduction:theporcinecathepsinB(CT効andcystatinB(CISTS)genes.C"e/3ef，2002，33:123-131.)。滋養(yǎng)層細胞來源的非編碼RNA(trophoblast-derivednoncodingRNA，TncRNA)是一種典型的RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的長非編碼RNA。Peyraan(PeymanJA.R印ressionofmajorhistocompatibilitycomplexgenesbyahumantrophoblastribonucleicacid.1999，60:23-31)發(fā)現(xiàn)在人上，它有多個轉(zhuǎn)錄本，0.5kb長的轉(zhuǎn)錄本特異性表達于胎盤之中，2.4kb的轉(zhuǎn)錄本表達于胎盤、心臟和胰腺中，而長約4.0kb的轉(zhuǎn)錄本遍在性表達。在這些轉(zhuǎn)錄本中，0.5kb的研究最多，主要與MHCII分子的表達有關(guān)，如TncRNA通過抑制II類反式激活因子(classII，majorhistocompatibilitycomplex,transactivator，6T7加的第3、4號啟動子來抑制千擾素Y誘導(dǎo)的MHCII分子的表達，但它不改變CIITA啟動子區(qū)的甲基化，而且這種抑制反應(yīng)可以跨物種行使(GeirssonA,BothwellAL,HammondGL.Inhibitionofalloresponsebyahumantrophoblastnon—codingRNAsuppressingclassIItransactivatorpromoterIIIandmajorhistocompatibilityclassIIexpressioninmurineB-lymphocytes.//fearf7^朋5^朋f，2004，23:1077-1081)。而對于其他兩種轉(zhuǎn)錄本的研究，最近Hutchinson在掃描核內(nèi)轉(zhuǎn)錄物時發(fā)現(xiàn)兩種連鎖性的非編碼RNA與SC35剪接域相關(guān)，其中有一條為NEAT(nuclearenrichedabundanttranscripts)，實際上就是TncRNA中4.0kb的轉(zhuǎn)錄本，亞細胞分布實驗發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄本主要分布于胞核，位于SC35核斑的外周，可能參與mRNA的代謝(HutchinsonJN，EnsmingerAW，ClemsonCM，LynchCR，Lawrence瓜ChessA.AscreenfornucleartranscriptsidentifiestwolinkednoncodingRNAsassociatedwithSC35splicingdomains.AiCfe/20/zu'cs，2007，8:39)。此夕卜，從該非編碼RNA的表達變化看，TncRNA在病毒感染或毒素刺激的組織或細胞中上調(diào)表達(SahaS，MurthyS，RangaxajanPN.Identificationandcharacterizationofavirus-induciblenon-codingRNAinmousebrain.Kz>。_/，2006，87:1991—1995)，在多禾中腫瘤的不同階段也是差異表達的，如Ishiyama(IshiyamaT，KanoJ，AnamiY,OnukiT，IijimaT，MorisitaY，Yokota_J，NoguchiM.OCIAdomaincontaining2ishighlyexpressedinadenocarcinomamixedsubtypewithbronchioloalveolarcarcinomacomponentandisassociatedwithbetterprognosis.C朋cer5"cj'，200798:50-57)發(fā)現(xiàn)7>2c/&^在侵染性的混合型肺腺癌(含細支氣管肺泡癌)中的表達量遠高于非侵染性的細支氣管肺泡癌。有趣的是該非編碼RNA在杜氏營養(yǎng)不良癥的肌肉中下調(diào)表達，而在訓(xùn)練的肌肉中上調(diào)表達(TimmonsJA，Larsson0，JanssonE，F(xiàn)ischerH，GustafssonT，Greenhai"fPL，RiddenJ，RachmanJ"，Peyrard-JanvidM，WahlestedtC，etal.HumanmusclegeneexpressionresponsestoendurancetrainingprovideanovelperspectiveonDuchennemusculardystrophy.乂2005，19:750-760)。盡管影響豬肉質(zhì)性狀的侯選基因的研究取得了一些重要進展，但對于肉質(zhì)性狀形成的分子機制了解甚少，這也限制了候選基因的鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用。隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，人們可以從基因組水平全貌了解性狀形成的分子機制。在哺乳動物基因組中，約62%被轉(zhuǎn)錄，而在這些轉(zhuǎn)錄單元中超過一半為非編碼RNA(FANT0MConsortiumandRIKENGenomeExplorationResearchGroupandGenomeScienceGroup(GenomeNetworkProjectCoreGroup).TheTranscriptionalLandscapeoftheMammalianGenome.5"cie/ce，2005，309:1559-1563)。因而，僅依據(jù)編碼基因進行分析會造成轉(zhuǎn)錄譜信息的殘缺，這些信息的丟失對于理解性狀形成的分子機制非常不利。根據(jù)這種信息篩選候選基因的工作也就十分困難。另外，非編碼RNA作為一種調(diào)控分子在某些性狀形成過程中起著重要作用已得到證明，如非編碼RNA簇(GTL2、MEG8、PEG11)還在綿羊的Callipyge表型(一種臀部和后肢骨骼肌異常肥大的現(xiàn)象)的極化超顯性方式遺傳中起著至關(guān)重要的作用(DavisE，JensenCH,SchroderHD，F(xiàn)arnirF,Shay-HadfieldT，KliemA,CockettN，GeorgesM，CharlierC.EctopicexpressionofDLKlproteininskeletalmuscleofpadumnalheterozygotescausesthecallipygephenotype.O/rrA'o7，2004，14:1858-1862)。這些要求創(chuàng)造性的改變以往思路，進一步探求和尋找與豬重要經(jīng)濟性狀相關(guān)非編碼RNA基因的工作迫在眉睫。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測豬肉質(zhì)性狀的方法。本發(fā)明所提供的一種檢測豬肉質(zhì)性狀的方法，是檢測自序列表中序列l(wèi)的5'端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為C還是G，確定豬的基因型，然后通過基因型確定肉質(zhì)性狀；所述確定豬的基因型的方法為如果自序列表中序列l(wèi)的5'端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為C時，其純合體的基因型為AA;自序列表中序列1的5'端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為G時，其純合體的基因型為BB;它們的雜合體基因型為AB;通過基因型確定豬肉質(zhì)性狀的方法為所述AA基因型豬的豬肉嫩度和肌肉PH值高于AB基因型豬，AB基因型豬的豬肉嫩度和肌肉TO值高于BB基因型豬。所述方法中，所述檢測自序列表中序列l(wèi)的5'端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為C還是G確定基因型的方法包括先PCR擴增含有自序列表中序列l(wèi)的5'端第451位核苷酸的豬基因組片段，然后對擴增產(chǎn)物進行測序或者用酶切擴增產(chǎn)物；所述含有自序列表中序列1的5'端第451位核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物為具有序列表中序列1所述核苷酸序列的片段或具有序列2所述核苷酸序列的片段;所述酶切所述具有序列2所述核苷酸序列的片段，若得到lllbp，108bp2個片段，其基因型為AA純合體；當(dāng)若得到219bp—個片段，其基因型為BB純合體；若得到lllbp,108bp和219bp三個片段，其基因型為AB雜合體；為了使方法更簡便，具有更高的效率，上述酶切后獲得片段的檢測方法為凝膠電泳檢測。所述擴增產(chǎn)物的模板為豬基因組DNA;所述擴增得到具有序列1所述核苷酸序列的片段的引物對為具有序列表中序列3所述序列的核苷酸和具有序列表中序列4所述序列的核苷酸；所述擴增得到具有序列2所述核苷酸序列的片段的引物對為具有序列表中序列5所述序列的核苷酸和具有序列表中序列6所述序列的核苷酸。本發(fā)明的方法在保守區(qū)設(shè)計引物擴增不同品種豬基因組DNA的上調(diào)表達的長非編碼RNA基因的物種間保守區(qū)，獲得的片段含有一C/G突變，并利用該突變位點引起的Xspl酶切位點的多態(tài)性檢測豬重要經(jīng)濟性狀-肉質(zhì)相關(guān)性狀。實驗證明了該突變位點與豬重要經(jīng)濟性狀-肉質(zhì)相關(guān)性狀存在顯著相關(guān)，表明本發(fā)明利用該突變位點檢測豬的肉質(zhì)性狀的方法是非常準確簡便的方法。綜上所述，本發(fā)明的方法可用于檢測豬的嫩度和pH值等反映肌肉品質(zhì)的性狀，從而為豬的分子育種提供了一個新的檢測其遺傳性狀的方法，并將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。圖1為本發(fā)明中包含豬TncRNA基因物種間保守區(qū)序列，保守區(qū)序列用下劃線標(biāo)注，突變位點用方框標(biāo)注。圖2為本發(fā)明中豬TncRNA基因保守區(qū)的三種基因型(AA，AB，BB)J印I-RFLP檢測電泳結(jié)果。M:DNA分子量標(biāo)準(100-國bpladder)具體實施方式下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、RFLP多態(tài)性檢測豬肉質(zhì)性狀的方法的建立及其效果驗證1、豬肉質(zhì)相關(guān)基因的部分DNA序列的單核苷酸多態(tài)性檢測在LongSAGE數(shù)據(jù)庫(唐中林，博士論文，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006)中，篩選出一部分沒有基因詮釋的差異表達標(biāo)簽，然后從對應(yīng)的UniGene數(shù)據(jù)庫中下載EST序列，并利用SeqMan軟件(Lasergene6.0，USA)進行Contigs拼接。對這些Contigs，利用ORFfinder軟件(NCBI)進行閱讀框(Openreadframe,ORF)預(yù)測，保留沒有編碼潛能或只含〈100aa的Contigs，并對于這些預(yù)測的小肽進行Blastp比對，進一步保留與現(xiàn)有各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫都沒有同源性的Contigs，然后利用Blastn(NCBI)搜索人基因組加轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)可能與人滋養(yǎng)層來源的非編碼RNA(trophoblast—derivednoncodingRNA,ThoffiVJ)有部分的序列同源'性。lt匕夕卜，Blast搜索?；蚪M序列發(fā)現(xiàn)豬的該contig與牛29號染色體的基因組contig存在較高的同源性，但牛該基因組區(qū)域尚無基因注釋。利用Wu-Blast搜索TIGR的牛基因索引數(shù)據(jù)庫(TheDFCIAosz^/rMGeneIndex(BtGI))發(fā)現(xiàn)牛該區(qū)域的TC序列對應(yīng)人7)7C/SW所處的染色體位置。因此，該豬contig對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本為豬長非編碼RNA7)7C7^^基因，該基因與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)。以豬的該contig物種間保守區(qū)序列為依據(jù)設(shè)計引物，引物序列如下-UPL4:5'GGAGGTGGACAAAATTGACC3'(如序列表中序列3所示)UPR4:5'GACACGGGACATTGGAGAAC3'(如序列表中序列4所示)分別以通城豬、大白豬、長白豬、五指山豬、萊芫豬、巴馬香豬各三只的基因組DNA為模板，以UPL4和UPR4為引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)總體積為25uL，其中模板DNA為50ng，含lXbuffer，75umol/L的dNTP，0.3pmol/L的引物，1.5mmol/L的Mg2+,1.0UTaqDNA聚合酶。PCR擴增程序為:95°C5min，95°C30s，60°C30s，然后72。C30s共循環(huán)35次，最后72°C延伸5min。產(chǎn)物片段長559bp，分別純化回收，克隆測序，然后將所有測序獲得的序列用DNAstar軟件中的SeqMan程序比對并分析其可能的多態(tài)位點，測序表明上述PCR擴增片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。結(jié)果顯示在上述擴增的序列中包含2個的多態(tài)位點，即序列表中序列1的5'端第434位核苷酸為C或T(存在C-T轉(zhuǎn)換突變)和序列表中序列1的5'端第451位核苷酸為C或G(C-G的顛換突變)。其中序列表中序列1的5'端第451位核苷酸的C-G突變，會引起酶切位點的多態(tài)。2、RFLP多態(tài)性檢測豬肉質(zhì)性狀的方法的建立在這兩個多態(tài)位點設(shè)計引物，并采用Jspl-RFLP方法進行SNP分型，引物序列如下SnL3:5'-GTACCCGCTGAAAGCTACGC-3'(如序列表SEQID:5所示)SnR2:5'-GGCCTAGACACGGGACATTG-3'(如序列表SEQID:6所示)用于基因多態(tài)性檢測的DNA樣品來自7個豬群，見表1。釆用常規(guī)方法提取其基因組DNA后于-2(TC保存作為模板。表1.SNPs檢測的群體和樣品數(shù)品種組合樣品數(shù)類型來源地五指山豬Wuzhishan43近交系小型豬購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所香豬Xiang42近交系小型豬購自貴州市畜禽良種場巴馬香豬Bamaxiangpig45近交系小型豬購自廣西大學(xué)巴馬香豬近交繁育中心萊蕪豬Laiwupigs41地方純種購自山東省萊蕪市萊蕪黑豬保種場長白豬Landrace17國外純種購自湖北通城縣畜牧局大白豬Yorkshire20國外純種購自湖北通城縣畜牧局通城豬Tongcheng44地方純種購自湖北通城縣畜牧局PCR擴增條件:PCR反應(yīng)總體積20uL，其中豬基因組DNA約100ng，含1Xbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150umol/L，引物終濃度為0.2mol/L，2U7邵DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序為95°C5min，95°C30s，60°C30s，然后72°C25s共循環(huán)35次，最后72°C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，并回收測序。Xspl-RFLP檢測PCR產(chǎn)物用I印I酶切，酶切反應(yīng)體積是IOuL，其中10Xbuffer1nL，PCR產(chǎn)物3-5uL，限制性內(nèi)切酶0.2-0.3uL(10.0U)，用(1(0120補足10uL，將樣品混勻后離心，37。C溫浴4h。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，凝膠成像系統(tǒng)照像。結(jié)果表明，利用引物對SnL3和SnR2擴增得到的片段長226bp，具有序列表中序列2的核苷酸序列(自序列表中序列2的5'端第l一226位核苷酸序列，圖1所示的序列)，自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為C或G(序列表中序列1的5'端第451位核苷酸)；自序列表中序列2的5'端第130位核苷酸為C或T(序列表中序列1的5'端第434位核苷酸)。自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為/spI-RFLP檢測多態(tài)性位點。當(dāng)自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為C時(序列表中序列1的5'端第451位核苷酸為C)，該基因假定為由A等位基因控制，當(dāng)序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為G時(序列表中序列1的5'端第451位核苷酸為G)，該基因假定為由B等位基因控制，這兩個等位基因可組成三種基因型純和體AA、BB，雜和體AB。當(dāng)自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸處為C時，在序列表中序列2所示的片段中，有2個/spl的酶切位點，分別為自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸處和自序列表中序列2的5'端第219位核苷酸處，當(dāng)自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸處為G時，只有自序列表中序列2的5'端第219位核苷酸處一個Zs;I的酶切位點，但219處酶切產(chǎn)生的小片段(7bp)在瓊脂糖凝膠電泳分析時很難檢測到，因此分型時不考慮該片段。當(dāng)基因型為AA時，X9/7l酶切檢測結(jié)果有111bp，108bp共2個片段；基因型為BB時，則導(dǎo)致失去了112處的Xspl酶切位點，Xspl酶切得到l個片段，長度為219bp;當(dāng)基因型為雜和體AB時，則i^I酶切得到111bp，108bp和219bp。豬肉質(zhì)相關(guān)基因X^I-RFLP的三種基因型AA，AB和BB如圖2所示。結(jié)果表明表1所述的豬通過PCR測序檢測和PCR后X邵I-RFLP檢測其多態(tài)性的結(jié)果是一致的，自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸的單核苷酸多態(tài)性在不同品種中的分布如表2所示，根據(jù)表2的基因型和基因頻率的結(jié)果顯示，在所檢測的這幾個品種中，除了長白豬兩種等位基因相差不大外(Cvs.G=0.412vs.0.588)，其它幾個品種都是A等位基因占優(yōu)勢。表2.Js/I-RFLP多態(tài)性在7個豬群中的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、豬不同基因型與其肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析試驗豬群將三元雜交組合品種，即長X(大X通)(簡稱為長大通)、大X(長X通)(簡稱大長通)，及三個純繁組品種(瑞典長白、英國大白和通城豬)仔豬斷奶后，從每個品種中挑選8窩出生日期盡可能相近、生長較一致的仔豬(每窩4-6頭，原則上公母各半)作為候試豬群，，每個品種包含3個公豬血統(tǒng)。預(yù)試前從候選群中挑選發(fā)育正常的豬只參加試驗，共172頭，提取基因組DNA樣品，按照步驟2的方法檢測基因型，并按照下述方法檢測肉質(zhì)性狀。肉質(zhì)性狀檢測方法肉色屠宰后2h內(nèi)測定眼肌胸腰結(jié)合處的橫斷面的顏色，采用美國和日本的標(biāo)準比色板測定法，按5級分制標(biāo)準肉色評分圖評分.大理石紋大理石紋評定方法同肉色評定，以大理石紋評分圖為參照對象。pH值屠宰后45min內(nèi)用酸度計(美國奧立龍公司，CHN82801型)直接測定左半胴體倒數(shù)第3與第4胸椎處背最長肌的pH值。系水力屠宰后2h內(nèi)采用重量加壓測定法測定.稱取10g左右左半胴體第2、3腰椎處背最長肌，在肉樣上方各覆蓋一層醫(yī)用紗布，紗布外各墊18層化學(xué)分析定性濾紙，濾紙外各墊一層硬質(zhì)書寫用塑料墊板，將墊好的肉樣放置于壓縮儀平臺上中央位置，勻速緩慢轉(zhuǎn)動壓縮儀的搖把，使磅秤上的壓力達到35公斤，并保持此壓力5分鐘，而后迅速撤除壓力，取出被壓肉樣，并立即用電子秤稱重，前后之差即為失去的水分，再計算系水力。滴水損失屠宰后2h內(nèi)在第3，4處腰椎處背最長肌處，順肌纖維方向切成2cra厚的肉樣，除去筋膜、脂肪組織，將其制成2(高)X3(寬)X5(長)的肉樣，將肉樣置于精密天平上稱重，用扎絲鉤住肉樣一端，使肌纖維垂直向下吊掛于小鐵籠中，并置于充氣的聚乙烯食品袋中，扎緊袋口，避免肉樣與袋壁接觸；放入冰箱，在2—4。C條件下儲存24h，取出肉樣，小心用濾紙擦拭肉樣，而后置于精密天平上稱重，前后之差即為失去的水分，再計算滴水損失。肌肉嫩度屠宰后2h內(nèi)在胸、腰椎結(jié)合處背最長肌上，順肌纖維方向切成2cm厚的肉樣，剝離附帶的筋膜、脂肪組織，用聚乙烯食品將肉樣包好，于15—16'C下放置24h進行尸僵處理；再將其置于冰箱，在2—4"條件下熟化24h;取出經(jīng)熟化的肉樣放至室溫，打開肉袋，用溫度計插入肌肉中心部位，扎好袋口，使袋口向上放入恒溫水浴鍋。加蓋后持續(xù)加熱，直至肌肉中心部位達7(TC。取出肉樣，用自來水沖洗片刻，使肉樣冷至室溫；按與肌纖維呈垂直方向切取1.5cm厚的肉樣，再用直徑為1.27cm的圓形取樣器順肌纖維方向切取肉樣，打開G-LM3數(shù)顯式肌肉嫩度儀電源開關(guān)，視肉樣情況設(shè)置100N或150N檔位；將肉樣按肌纖維走向橫放在嫩度計剪切片的三角孔底部，用手扶平，啟動儀器升降按鈕使處于下降位置，再按動工作按鈕進行剪切操作，記錄讀數(shù)；計算10個重復(fù)樣的平均值，作為該肉樣的嫩度。試驗豬群基因型與經(jīng)濟性狀關(guān)聯(lián)分析是應(yīng)用SAS(視窗V8版)GLM程序肉質(zhì)性狀(肉的嫩度(tenderness)、pH值)在不同基因型之間的差異進行最小二乘方差分析來完成的。所采用的線性模型Yijk="+Bi+Gj+eijk其中，Yijk是性狀觀察值，y為總體均值，Bi為組合效應(yīng)Gj為基因型效應(yīng)，eijk為隨機誤差，假定服從N(0，02)分布。應(yīng)用模型根據(jù)最小二乘分析法直接分析基因型的效應(yīng)，同時進行基因型間的兩兩比較?；蛐烷g性狀的簡單均數(shù)和標(biāo)準差分析結(jié)果總結(jié)于表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此多態(tài)位點的不同基因型個體在肉的嫩度(tenderness)、pH值上差異顯著(P<0.05)，AA基因型的豬個體的肉的嫩度(tenderness)、pH值均明顯比AB基因型和BB基因型的豬個體的高，并且AA基因型個體與BB基因型的個體在肉嫩度上差異極顯著(P〈0.01)，而在pH值上差異顯著(P<0.05);AB基因型的豬個體的肉的嫩度(tenderness)、pH值明顯高于BB基因型的豬個體，即BB基因型的豬的肉質(zhì)比AA基因型和AB基因型的豬的肉質(zhì)好，AB基因型的豬比AA基因型的豬的肉質(zhì)好。表3.豬的基因型與豬群體肉質(zhì)性狀和免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>a用于肉質(zhì)性狀分析的個體數(shù)。f表示差異顯著P0.05，"表示差異極顯著P<0.01序列表〈160>6〈210>1<211〉559<212>薩<213〉野豬屬豬(5""sscr。/aV，e"icai9/^5"5W)〈220>〈22l>misc—feature<222>(451)<223>n=g或c<400〉1gg鄉(xiāng)tggscaaaattgacccacgctttattttcc已ggtggcagtgctcccttttggact60tttcctgtaggttccgtgctaacctcttctgtgagctcactctgcccctcctcctcctcc120tcctccctttaactccctcgaggttccccattggcttaagcgttgcttctggbtctgg180taagccccggaagttgctccagtccctgttggsgtcggt3ctgctggtaatcctg犯gga240gg卿ggcctcccctgttgagactctgggtgggtgggtggcttgc鄉(xiāng)tg眺ggggtgg300ggcgtggatgtgcaccccccgggtgggcccgcggccatggtaccagctgaaagctacgca36。aatgcctcat卿tggtggtttgttgctgtagtgttcatcatggcgagctgatggcacca420卿gg3tggagcccctggccagtgtgagtcntagcagtgcaccctggagg480卿gagcccgcctaaattg3tgtctgcagattgaatttcc540ttctccaatgtcccgtgtc559〈210>2<211〉226〈212>腿〈213〉野豬屬豬(5""sscr。/a^OTe5ticaS"'S5W)〈220><221>misc-feature<222>(112)<223〉n=g或c<400>2gtaccagctgaaagctacgcaaatgcctcatagatggtggtttgttgctgtagtgttcat60catggcgagctgatggcaccaggaggatggagcccctggccagtgtgagtcntagcagtg120caggaggggagaccctggaggagagagcccgcctaaattgatgtctgcagattgaatttc180cagaggcttaggaggaggaagttctccaatgtcccgtgtctaggcc226<210>3<211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉3gacacgggacattggagaac20<210>4〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉〈400〉4ggaggtggacaaaattgacc20<210〉5〈211〉20<212>DNA<213〉人工序列〈220>200710176964.1〈223〉〈400>5gtacccgctgaaagctacgc〈210>6<211>20<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223〉<400〉6ggcctagacacgggacattg權(quán)利要求1、一種檢測豬肉質(zhì)性狀的方法，是檢測自序列表中序列1的5′端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5′端第112位核苷酸為C還是G，確定豬的基因型，然后通過基因型確定肉質(zhì)性狀；所述確定豬的基因型的方法為如果自序列表中序列1的5′端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5′端第112位核苷酸為C時，其純合體的基因型為AA；自序列表中序列1的5′端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5′端第112位核苷酸為G時，其純合體的基因型為BB；它們的雜合體基因型為AB；通過基因型確定豬肉質(zhì)性狀的方法為所述AA基因型豬的豬肉嫩度和肌肉PH值高于AB基因型豬，AB基因型豬的豬肉嫩度和肌肉pH值高于BB基因型豬。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測自序列表中序列1的5'端第451位核苷酸或自序列表中序列2的5'端第112位核苷酸為C還是G確定基因型的方法包括先PCR擴增含有自序列表中序列1的5'端第451位核苷酸的豬基因組片段，然后對擴增產(chǎn)物進行測序或者用酶切擴增產(chǎn)物；所述含有自序列表中序列1的5'端第451位核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物為具有序列表中序列1所述核苷酸序列的片段或具有序列2所述核苷酸序列的片段;所述J邵I酶切所述具有序列2所述核苷酸序列的片段，若得到lllbp，108bp2個片段，其基因型為AA純合體；當(dāng)若得到219bp—個片段，其基因型為BB純合體；若得到lllbp，108bp和219bp三個片段，其基因型為AB雜合體。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述擴增產(chǎn)物的模板為豬基因組DNA;所述擴增得到具有序列l(wèi)所述核苷酸序列的片段的引物對為具有序列表中序列3所述序列的核苷酸和具有序列表中序列4所述序列的核苷酸;所述擴增得到具有序列2所述核苷酸序列的片段的引物對為具有序列表中序列5所述序列的核苷酸和具有序列表中序列6所述序列的核苷酸。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測豬肉質(zhì)性狀的方法。該方法，是檢測自序列1的5′端第451位核苷酸或自序列2的5′端第112位核苷酸為C還是G，確定豬的基因型，然后通過基因型確定肉質(zhì)性狀；確定豬的基因型的方法為如果自序列1的5′端第451位核苷酸為C時，其純合體的基因型為AA；自序列1的5′端第451位核苷酸為G時，其純合體的基因型為BB；雜合體基因型為AB；通過基因型確定豬肉質(zhì)性狀的方法為所述AA基因型豬的豬肉嫩度和pH值高于AB基因型豬，AB基因型豬的豬肉嫩度和pH值高于BB基因型豬。本發(fā)明的方法可用于檢測豬的嫩度和pH值等反映肌肉品質(zhì)的性狀，為豬的分子育種提供了一個準確簡便的檢測其遺傳性狀的方法。文檔編號C12Q1/68GK101230391SQ20071017696公開日2008年7月30日申請日期2007年11月7日優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日發(fā)明者唐中林,勇李,奎李,楊述林申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所