專利名稱：大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌及其制備方法，本發(fā)明還涉及所述 大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在農(nóng)作物秸稈和殘留物中，纖維素和半纖維素的含量可占到干重的75%以上，將農(nóng)作 物秸稈進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，是很好的獲得乙醇的方式。
纖維素主要是由葡萄糖分子經(jīng)過(guò)e-i， 4糖苷鍵連接而成的直鏈分子；半纖維素是包
括木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露和葡萄糖等多種糖分的非結(jié)晶異質(zhì)多聚體，又以木糖的 含量為最高。
大腸桿菌含有利用六碳糖和五碳糖的所有必需酶，可發(fā)酵葡萄糖、果糖等六碳糖， 也可以發(fā)酵木糖、阿拉伯糖等五碳糖。但是利用野生型大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，在產(chǎn)業(yè)上
并不可行，原因有二
一是野生型大腸桿菌進(jìn)行的是混合酸發(fā)酵，得到的是多種產(chǎn)物，乙醇在發(fā)酵產(chǎn)物中 僅占很少一部分。
其二是野生型大腸桿菌對(duì)乙醇非常敏感。在較高濃度乙醇環(huán)境下，大腸桿菌細(xì)胞膜
構(gòu)成就會(huì)發(fā)生變化，生長(zhǎng)受到抑制。如30g/L的乙醇已經(jīng)明顯抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，濃度更
高時(shí)，抑制作用更明顯。因此不適合進(jìn)行乙醇發(fā)酵生產(chǎn)。
綜上，將農(nóng)作物秸稈進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，并在產(chǎn)業(yè)可行，需要解決以上兩個(gè)難題，
即對(duì)大腸桿菌的乙醇代謝途徑進(jìn)行改造，引入高效的乙醇發(fā)酵途徑，使乙醇成為主要發(fā) 酵產(chǎn)物；同時(shí)所述菌株必須耐高濃度的乙醇，在高乙醇濃度下仍然保持較高發(fā)酵速率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌，使其在用五碳糖和六碳糖做 底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)在高濃度乙醇下依然能夠保持較高的發(fā)酵速率，而且有較高的乙醇轉(zhuǎn) 化率。
本發(fā)明用以下兩種方式解決了技術(shù)問(wèn)題，得到了一種新型的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程
菌
31、篩選得到了高耐乙醇的大腸桿菌突變株；
將大腸桿菌經(jīng)過(guò)高濃度乙醇多代的定向篩選后獲得了乙醇耐性，得到的耐乙醇突變 株可在45g/L的乙醇中生長(zhǎng)。
2、對(duì)高耐乙醇的大腸桿菌突變株進(jìn)行了基因改造。
在上述高耐乙醇的大腸桿菌突變株中轉(zhuǎn)入了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和 丙酮酸脫羧酶基因，兩個(gè)基因在可被大腸桿菌RNA聚合酶高效識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac啟動(dòng) 下發(fā)生共表達(dá)，得到耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。
由于引入同型乙醇發(fā)酵途徑，控制其細(xì)胞內(nèi)的碳代謝向生成乙醇的方向進(jìn)行，使得其 發(fā)酵主產(chǎn)物為乙醇。
本發(fā)明的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌具體的具體制備方法是
1、 利用大腸桿菌JM109菌株進(jìn)行耐乙醇篩選，經(jīng)過(guò)幾次篩選后涂布到含有異丙醇的 固體LB培養(yǎng)基上，挑選生長(zhǎng)迅速的單菌落繼續(xù)進(jìn)行乙醇耐受培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)多代的定向篩選 后得到可在45g/L的乙醇中生長(zhǎng)的耐乙醇突變株ET1。
按照上述篩選過(guò)程重復(fù)進(jìn)行菌株的培養(yǎng)和篩選，可以得到的同樣的結(jié)果，即可以得 到在45g/L的乙醇中生長(zhǎng)的耐乙醇突變株。
2、 將包含有SD序列的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因經(jīng)過(guò)PCR 克隆后連接到pGEM-T easy載體上，經(jīng)過(guò)酶切后置于含有可被大腸桿菌RNA聚合酶高效識(shí) 別的強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac的表達(dá)載體pZY507上，使得乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因在大 腸桿菌中發(fā)生共轉(zhuǎn)錄和共表達(dá)，得到大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用本發(fā)明所提供的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌在發(fā)酵五碳糖和六碳糖生 產(chǎn)乙醇時(shí)，其發(fā)酵葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論產(chǎn)值的86%,發(fā)酵木糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論產(chǎn)值的 78%。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1. 以大腸桿菌耐乙醇突變株ET1構(gòu)建乙醇發(fā)酵工程均的初發(fā)菌株，使得工程菌在高 濃度乙醇下依然能夠保持較高的發(fā)酵速率；
2. 本發(fā)明利用了含有能被大腸桿菌RNA聚合酶高效識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac的表達(dá)載體 使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因在大腸桿菌耐乙醇突變株ET1 中共同轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。使得其發(fā)酵主產(chǎn)物為乙醇，在提高乙醇產(chǎn)率的同時(shí)降低了后續(xù)蒸餾過(guò) 程中的投入。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 耐乙醇大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌的制備 A、大腸桿菌乙醇耐受突變株的篩選
大腸桿菌JM109在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后轉(zhuǎn)接到含有10g/L、20g/L、30g/L 、 40g/L和50g/L乙醇的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)中，(乙醇經(jīng)過(guò)0. 45um的濾膜過(guò)濾除菌后加入到LB 培養(yǎng)基中)，30g/L的乙醇濃度己經(jīng)明顯的抑制大腸桿菌JM109的生長(zhǎng)。將生長(zhǎng)在含有30g/L 乙醇的LB中的JM109經(jīng)過(guò)連續(xù)多代的轉(zhuǎn)接，每轉(zhuǎn)接三代后將其涂布到含有異丙醇(不易 揮發(fā)同時(shí)可以保持乙醇選擇壓)的固體LB培養(yǎng)基上，選擇生長(zhǎng)迅速的單菌落繼續(xù)轉(zhuǎn)接。
以生長(zhǎng)在無(wú)乙醇的LB培養(yǎng)基中的JM109為對(duì)照，通過(guò)倍比稀釋涂平板計(jì)算菌落數(shù)和 測(cè)定液體LB培養(yǎng)基中OD,的吸光值來(lái)測(cè)量篩選菌株和對(duì)照菌株之間生長(zhǎng)速度的差異，經(jīng) 過(guò)12代連續(xù)轉(zhuǎn)接篩選以后，得到了和對(duì)照沒(méi)有明顯差異的可以在30g/L乙醇的LB培養(yǎng)基 中正常生長(zhǎng)的JM109菌株。將該菌株接種到含有35g/L乙醇的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行定向 選擇，以同樣的方法測(cè)定其生長(zhǎng)速度，直到最后選擇得到可以在45g/L的LB中生長(zhǎng)的JM109 菌株ET1，繼續(xù)在高濃度乙醇中篩選沒(méi)有得到可耐更高濃度乙醇的突變株。
B、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XWIOI乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因的克隆 以SEQ ID NO: 1 (5， -GGATCCGTGTTTTGAATATATGGA-3')和SEQ ID NO: 2 (5' -GCATGCTAGA GGAGCTTGTTAACAG-3')為引物，擴(kuò)增運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因，其產(chǎn)物大小為 翻bp;以SEQ ID NO: 3 (5' -GCGAGCTCAGTATGTAGGGTGAGG-3')和SEQ ID NO: 4 (5' -GTCGACT TAGAAAGCGCTCAGGAA-3')為引物，擴(kuò)增運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因，其產(chǎn)物大小為 1200bp。并分別克隆到pGEM-T easy (Promeg)載體上，經(jīng)測(cè)序分析后，與已報(bào)道的運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因的同源性為99%，經(jīng)過(guò)酶切后將"&和 a必5基因連接到表達(dá)載體pZY507上得到質(zhì)粒pZY507bc。 PCR反應(yīng)體系U." :
10XPCR buffer214
2. 5mMdNTP
10XBSA
50pM gfol
50pM gfo2
模板DNA5ng
5U/WTaq酶0. 25W
加無(wú)菌水至
PCR反應(yīng)條件:1、 94。C預(yù)變性 300s
2、 94°C 30s 56 °C 30s 72 °C 60s
(28個(gè)循環(huán))
3、 72。C 5min PCR反應(yīng)體系/ a必歷
10XPCR buffer 2W 2.5mMd, 2W 10XBSA 50pM gfol
50pM gfo2 214 模板DNA 5ng 5U/WTaq酶 0. 25W
加無(wú)菌水至20W PCR反應(yīng)條件
1、 94'C預(yù)變性 300s
2、 94°C 30s 62 。C 30s 72 °C 40s
(28個(gè)循環(huán))
3、 72°C 5min 連接體系與連接反應(yīng)
2 X buffer 5)4 pGEM-T easy PCR產(chǎn)物 114 L連接酶(3 U/W)
加水至10W， 4'C過(guò)夜連接。 C、基于乙醇耐受突變株的大腸桿菌乙醇工程菌的構(gòu)建
利用氯化鈣將大腸桿菌乙醇耐受突變株ET1制成感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)熱激(42t:90秒，冰 上120秒)轉(zhuǎn)化后，在含有25ug/ml的氯霉素和異丙醇的LB培養(yǎng)基上工程菌株,得到工程菌株ETlbc。
D、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因的驗(yàn)證 采用B中的引物，以工程菌株ETlbc的質(zhì)粒為模板(反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如B中所述)， 可分別擴(kuò)增到大小約1.2kb和1.8kb的條帶，利用RNA試劑盒提取ETlbc的總RNA，經(jīng)反 轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增到一條3. 0Kb的條帶，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌XW101乙醇脫氫酶基因和丙酮 酸脫羧酶基因在大腸桿菌中做為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元發(fā)生了共轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例2工程菌株ETlbc發(fā)酵生產(chǎn)乙醇
1. 培養(yǎng)條件
1.1培養(yǎng)基成分
葡萄糖10%、酵母浸膏0. 5%、氯化鈉1. 0°/。、蛋白胨1. 0%、磷酸緩沖液PH7. 0; 木糖10%、酵母浸膏0.5%、氯化鈉1.0%、蛋白胨1.0%、磷酸緩沖液pH7.0;
1.2培養(yǎng)和發(fā)酵條件
將ETlbc接種到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到0D6。。=0. 2左右時(shí)加入1. OmM的IPTG誘導(dǎo)，當(dāng)ETlbc 生長(zhǎng)到0D6。。=1. 0時(shí)離心收集菌體，接種到1. 1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后使其ODbo。値 大約為1.0左右，37攝氏度厭氧培養(yǎng)。
2. 發(fā)酵液中殘留糖的測(cè)定
采用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵液中的殘留糖含量，測(cè)定條件如下，檢測(cè)器Waters410 示差折光檢測(cè)器；柱溫35°C;色譜柱大連依利特公司HypersilNH2(4.6mmi.d.X250mm5 um,);流動(dòng)相V(乙腈)V(水"80 : 20;流速lml min-l ，進(jìn)樣量10um。
3. 乙醇的測(cè)定
采用GC-17A島津氣相色譜儀檢測(cè)發(fā)酵液中的乙醇含量，F(xiàn)ID檢測(cè)器。
色譜柱CP-Wax57CB毛細(xì)管柱，長(zhǎng)50m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.2um。 色譜條件柱溫13(TC。 檢測(cè)器溫度訓(xùn)。C。 進(jìn)樣器溫度18(TC。
載氣高純氮；氫氣流速50ml/min;空氣500ml/min;尾吹30.0ml/min。進(jìn)樣量0.5ul。
5.試驗(yàn)數(shù)據(jù)(50ml培養(yǎng)基)10%糖含量
ETlbc葡萄糖 ETlbc木糖
葡萄糖含量(g/L) 乙醇含量(g/L) 木糖含量(g/L)乙醇含量(g/L) 3.21 42.91 "7 40.38
2.26 43.37 2'86 38.33
2.11_^__39.31
平均 2. 52_43.91_^_39. 34
6. 試驗(yàn)結(jié)果
以10%的五碳糖或者六碳糖為發(fā)酵底物，在37攝氏度的發(fā)酵條件下，經(jīng)過(guò)96小時(shí) 發(fā)酵后，發(fā)酵木糖和葡萄糖產(chǎn)率分別達(dá)到理論產(chǎn)率的79%和87%。
說(shuō)明所有利用農(nóng)作物秸稈進(jìn)行乙醇生產(chǎn)的技術(shù)都是將其經(jīng)過(guò)酶解或者酸解處理成為 五碳或者六碳糖以后再進(jìn)行發(fā)酵的。
7. 試驗(yàn)結(jié)論
本發(fā)明制備的工程菌在用農(nóng)作物秸稈等分解后的主要產(chǎn)物五碳糖和六碳糖做底物發(fā) 酵生產(chǎn)乙醇時(shí)，有較高的乙醇轉(zhuǎn)化率。
權(quán)利要求
1. 一種耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌，其特征是在高耐乙醇的大腸桿菌突變株中轉(zhuǎn)入了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌的制備方法，其步驟如下1)將大腸桿菌經(jīng)過(guò)高濃度乙醇多代的定向篩選后獲得了乙醇耐性，得到高耐乙醇的 大腸桿菌突變株；2)在上述高耐乙醇的大腸桿菌突變株中轉(zhuǎn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和 丙酮酸脫羧酶基因，兩個(gè)基因在可被大腸桿菌RNA聚合酶高效識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac啟動(dòng) 下發(fā)生共表達(dá)，得到耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌的制備方法，所述將大 腸桿菌經(jīng)過(guò)高濃度乙醇多代的定向篩選是利用大腸桿菌JM109菌株進(jìn)行耐乙醇篩選， 經(jīng)過(guò)幾次篩選后涂布到含有異丙醇的固體LB培養(yǎng)基上，挑選生長(zhǎng)迅速的單菌落繼續(xù)進(jìn)行 乙醇耐受培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)多代的定向篩選后得到可在45g/L的乙醇中生長(zhǎng)的耐乙醇突變株。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌的制備方法，所述轉(zhuǎn)入 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶基因是將包含有SD序列的運(yùn)動(dòng)發(fā) 酵單胞菌乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因經(jīng)過(guò)PCR克隆后連接到pGEM-T easy載體 上，經(jīng)過(guò)酶切后置于含有可被大腸桿菌RNA聚合酶高效識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac的表達(dá)載體 pZY507上，使得乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因在大腸桿菌中發(fā)生共轉(zhuǎn)錄和共表達(dá)。
5、 用權(quán)利要求1所述的耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌在用五碳糖和六碳糖做底 物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
6、 一種高耐乙醇的大腸桿菌突變株，其特征是將大腸桿菌經(jīng)過(guò)高濃度乙醇多代的定 向篩選后獲得了乙醇耐性，可在45g/L的乙醇中生長(zhǎng)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的高耐乙醇的大腸桿菌突變株的制備方法，其特征是利用大 腸桿菌JM109菌株進(jìn)行耐乙醇篩選，經(jīng)過(guò)幾次篩選后涂布到含有異丙醇的固體LB培養(yǎng)基 上，挑選生長(zhǎng)迅速的單菌落繼續(xù)進(jìn)行乙醇耐受培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)多代的定向篩選后得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。本發(fā)明經(jīng)多代的定向篩選得到了高耐乙醇的大腸桿菌突變株，并在所述突變株中轉(zhuǎn)入了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶基因，得到了一種新型耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。本發(fā)明得到的工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)，在高濃度乙醇下依然能夠保持較高的發(fā)酵速率，而且有較高的乙醇轉(zhuǎn)化率。
文檔編號(hào)C12P7/06GK101429488SQ20071017700
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者平淑珍, 維 張, 敏 林, 王占朝, 偉 陸, 明 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所