專利名稱：構(gòu)建小球藻表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化小球藻和破壁小球藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體地，涉及利用橢圓小球藻硝酸還 原酶缺失突變體高效、安全的表達(dá)常規(guī)的基因工程表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌 和酵母)不適合表達(dá)的外源蛋白的體系建立及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小球藻((^2/0^//^屬于綠藻門小球藻屬的一類單細(xì)胞真核微藻，具有 真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、鐵、鈣等營養(yǎng)
成分，被認(rèn)為是極有價(jià)值的食品和飼料添加劑的來源(Bricknell and Dalmo,2005)，且易繁殖培養(yǎng)，適宜于規(guī)?；a(chǎn)。
基于小球藻所具有的上述特點(diǎn)，以小球藻作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源基 因?qū)⒕哂忻黠@的優(yōu)點(diǎn)，多個(gè)研究小組對(duì)此已進(jìn)行了探索。Dawson a a/.，(1997)利用微粒轟擊轉(zhuǎn)化的方法將Cv"/gw^的硝酸還原酶基因?qū)氲?C.^rahm'mw硝酸還原酶突變體中，得到了能在含有硝酸鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 的藻株，這是關(guān)于小球藻中外源基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的首例報(bào)道。Richard ef a/. (1999 )用PEG轉(zhuǎn)化法將人的生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入Cv"/gm^ C-27和 C.sorahm'a"fl ATCC-22521中，研究了隨機(jī)整合與同源重組對(duì)外源基因表達(dá) 的影響。Kim " d，(2002)用PEG轉(zhuǎn)化法將比目魚生長(zhǎng)激素基因(/G用轉(zhuǎn)入到 C.e//^^0^^中，投喂試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小球藻對(duì)魚苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作 用，表明轉(zhuǎn)基因小球藻具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。中國科學(xué)院的孫勇如研究小 組克隆了橢圓小球藻(Ce/Zz^o^a)的硝酸還原酶基因及其啟動(dòng)子(Wang effl/.， 2003， 2004)。硝酸還原酶(NR)是氮同化過程中的一個(gè)重要的酶，能 夠?qū)⑾跛猁}還原為亞硝酸鹽，從而使野生型小球藻能夠利用硝酸鹽作為氮 源進(jìn)行正常的生長(zhǎng)發(fā)育。小球藻的硝酸還原酶功能缺失突變體則不能利用硝酸鹽作為氮源，但可以利用亞硝酸鹽作為氮源。因此外源基因轉(zhuǎn)化小球 藻硝酸還原酶功能缺失突變體時(shí)，可用硝酸還原酶基因作為篩選標(biāo)記
(Wang " a/. ， 2005; Zhang " a/. ， 2006)。
防御素是廣泛存在于動(dòng)植物及昆蟲體內(nèi)的一類陽離子肽，它是長(zhǎng)期進(jìn) 化形成的生物體防御微生物入侵的天然屏障，作為潛在的新一代抗生素藥 物在臨床上具有很好的應(yīng)用前景。兔防御素NP-1最初從兔嗜中性白細(xì)胞 分離得到(Ganz， 1989)，由33個(gè)氨基酸組成，屬于a防御素。作為最早 發(fā)現(xiàn)的防御素之一，人們對(duì)其功能也研究得較多，NP-1是目前從生物界 分離到的30多種防御素中抗性譜最廣的一個(gè)。像防御素這樣的抗菌肽由 于本身對(duì)宿主有很強(qiáng)的毒害作用，所以很難用常規(guī)的基因工程表達(dá)系統(tǒng)如 大腸桿菌和酵母來生產(chǎn)(Li""/.， 2004)。
啟動(dòng)子是影響外源基因的表達(dá)的重要因素。Wu'，"/啟動(dòng)子對(duì)外源基 因在小球藻中的表達(dá)調(diào)控有較高的效率，Q序列對(duì)外源基因的表達(dá)有顯著 的增強(qiáng)作用(WangWa/., 2001)。 Wang " "/.， (2004)報(bào)道小球藻的硝酸還原 酶基因啟動(dòng)子比f/Zn々M衍"啟動(dòng)子對(duì)其控制的下游基因有更強(qiáng)的效果。Chen "a/. (2001)在橢圓小球藻中以A^77/為篩選標(biāo)記基因，以U&々W""啟動(dòng) 子控制A^-7基因，表達(dá)了NP-l,但獲得的轉(zhuǎn)基因藻株在去掉篩選壓力后 檢測(cè)不到NP-1的活性，在以往的小球藻轉(zhuǎn)化研究中，A^n/常被用作篩 選標(biāo)記基因，篩選試劑為G418。但僅利用G418篩選獲得的轉(zhuǎn)基因小球藻 不夠穩(wěn)定，去掉G418后外源基因易丟失(本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù))，而且在 含有G418的培養(yǎng)基中大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻成本比較高。
在植物基因工程研究中常會(huì)出現(xiàn)外源基因不易整合到染色體基因組， 或整合后表達(dá)不穩(wěn)定等現(xiàn)象。人們推測(cè)這一現(xiàn)象的發(fā)生可能是因?yàn)橄嗤?啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)有限的轉(zhuǎn)錄因子，引起轉(zhuǎn)錄水平降低從而影響到外源基因的翻 譯水平(Park etal., 1996)。通常該現(xiàn)象是由啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的一段同源序列 引起。己有報(bào)道指出，啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)90bp的同源序列就足以抑制兩個(gè)基 因的表達(dá)水平(Vaucheret, 1993)。我們構(gòu)建的植物表達(dá)載體中，篩選標(biāo)記 硝酸還原酶基因由小球藻的硝酸還原酶基因啟動(dòng)子控制，如果外源基因 iV尸-7也用硝酸還原酶基因啟動(dòng)子控制，再加上小球藻本身也含有硝酸還 原酶基因啟動(dòng)子，過多的硝酸還原酶基因啟動(dòng)子可能會(huì)造成外源基因啟動(dòng)效率不高，在小球藻中整合不穩(wěn)定等問題。這在我們以前發(fā)表的論文
(Zhang "a/.， 2006)中沒有給以足夠關(guān)注。本研究中我們用C/^々m衍"啟 動(dòng)子控制A^-7，這也許是獲得具有NP-1活性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因藻株的重要因
素之一。
小球藻的轉(zhuǎn)化方法目前大致分為四種1、 PEG轉(zhuǎn)化法(Richard " a/.,1999)。 2、電穿孑L導(dǎo)入基因法(Ladygin and Boutanave , 2002; Maruyama "a/.，1994)。 3、基因槍法(Boynton"a/., 1988; Kindle""/., 1989)。 4、玻 璃珠攪拌法(Kindlee a/.,1991， 1990)。利用電擊方法和基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn) 行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)需要昂貴的儀器設(shè)備，玻璃珠攪拌法效率很低。小球藻遺傳 轉(zhuǎn)化多采用PEG方法，但PEG法因?yàn)槠洳僮鞑襟E較多而容易染菌。本研 究改進(jìn)了PEG轉(zhuǎn)化方法，與Richard a/.， ( 1999)用的PEG方法相比， 節(jié)省了酶的用量，節(jié)約了轉(zhuǎn)化成本，并且減少了操作步驟，進(jìn)而減少了染 菌的幾率。
影響NP-1活性檢測(cè)的重要因素之一是轉(zhuǎn)基因小球藻的破壁。普通小球 藻的破壁多采用超聲破碎法，但轉(zhuǎn)NP-l小球藻如果超聲破碎時(shí)間過長(zhǎng)則可 能導(dǎo)致NP-1二硫鍵的斷裂而影響NP-1的活性。如果超聲破碎時(shí)間過短則不 能完全破碎轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞，使得單位藻液NP-1產(chǎn)量過低。本試驗(yàn)經(jīng)過多次 摸索得出濕藻重與玻璃珠的質(zhì)量比為1:1時(shí)超聲9 s，循環(huán)90次破碎時(shí)的效 果最好。
本研究以橢圓小球藻硝酸還原酶基因缺失突變體為受體，以iVP7Y/和 硝酸還原酶基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，以t/W^^/"啟動(dòng)子控制A^-7，采用經(jīng)濟(jì)實(shí)用 的小球藻PEG轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在初篩時(shí)利用7V尸27/和硝酸還原酶基因 作為雙重篩選標(biāo)記，用G418和硝酸鹽進(jìn)行雙重篩選壓力篩選(3次固體培 養(yǎng)平板篩選和3次液體培養(yǎng)篩選)，然后再僅利用硝酸鹽進(jìn)行篩選，獲得了 能夠在硝酸鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)而且具有較強(qiáng)NP-1活性的轉(zhuǎn)基因小球藻，目前 尚未見報(bào)道到去掉G418篩選壓力能夠具有較強(qiáng)NP-l活性的iV/M的轉(zhuǎn)基因 藻株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在一個(gè)方面提供了一種用于小球藻硝酸還原酶基因缺失突變體中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，其是通過將NR表達(dá)框(SEQIDNO:6)， C/Z^i^/w啟動(dòng)子(SEQIDNO:l)和Q序列(SEQIDNO:5)依次首尾連 接克隆入載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中而獲得，其中所述載體質(zhì)粒適于在小球 藻硝酸還原酶基因缺失突變體中表達(dá)外源基因。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體質(zhì)粒選自由pBinl9， pGreen0029， pCABIA1300， pBinl21， pbin221和pBADW組成的組。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體質(zhì)粒是如圖l所示的 pbin221質(zhì)粒。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是如圖4所示的 pbin-NR-UQ或如圖8所示的pGreen-NR-UQ。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述外源基因是A73-/基因，其核 苷酸序列為SEQ IDNO:12所示的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述小球藻藻種為普通或者橢圓小球藻。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了上述表達(dá)載體在小球藻硝酸還原酶基 因缺失突變體中表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。特別地，其中所述載體質(zhì)粒、外 源基因和小球藻藻種如上所定義。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種構(gòu)建在小球藻硝酸還原酶基因缺 失突變體中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體的方法，包括將NR表達(dá)框(SEQID NO: 6) t/Z^M"/w啟動(dòng)子(SEQIDNO:l)和Q序列(SEQIDNO:5)依 次首尾連接克隆入載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中的步驟，其中所述載體質(zhì)粒適 于在小球藻硝酸還原酶基因缺失突變體中表達(dá)外源基因。特別地，其中所 述載體質(zhì)粒、外源基因和小球藻藻種如上所定義。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種小球藻PEG轉(zhuǎn)化方法，其包括 將小球藻細(xì)胞用酶解液(山梨醇0.6M， CaClr12H20 50 mM， R-10纖維 素酶(lU/mg)3X—6%， R-10果膠酶(lU/mg)1 % — 4 % ， Y-23果膠酶 (lU/mg)0.1%。一1.5%。)懸浮后置于25t:，遮光培養(yǎng)，其中所述百分比為質(zhì) 量/體積。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述R-10纖維素酶(lU/mg)含量為 4%， R-10果膠酶(lU/mg)含量為2X， Y-23果膠酶(lU/mg)含量為1%。。
7在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種高效的轉(zhuǎn)基因小球藻破壁方法， 其特征在于利用超聲破碎的方法，按小球藻濕重(g):玻璃珠(g):水(ml) 二h 1: l的比例加入玻璃珠和水。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述超聲波破碎的條件是超聲破碎
7-12 s，間隔2-6s，破碎次數(shù)70-90次。
由本發(fā)明的內(nèi)容可知，本發(fā)明的表達(dá)載體安全、高效，不用抗生素篩 選，利用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的藻株可在無抗生素存在的條件下高效表達(dá)外源基因。
同時(shí)本發(fā)明的小球藻PEG轉(zhuǎn)化方法降低了現(xiàn)有技術(shù)中PEG轉(zhuǎn)化的成 本和步驟，使該轉(zhuǎn)化體系更加有利于小球藻和其他單細(xì)胞藻類細(xì)胞轉(zhuǎn)化的 應(yīng)用。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因小球藻高效破壁技術(shù)，大大提高了轉(zhuǎn)基因小球藻 的破壁率，提高了表達(dá)產(chǎn)物的得率。


圖l.pbin221質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。 圖2. pbinUGUS質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。 圖3. pbinUQGUS質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。 圖4. pbin-NR-UQ質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。 圖5. pGreen0029質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。 圖6. pGreen0029nos質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。 圖7. pGreenUQNos質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。 圖8. pGreen-NR-UQ質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。 圖9. pbin-NR-UQ-NP-l質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
圖IO. PEG融合方法轉(zhuǎn)化橢圓小球藻硝酸還原酶功能缺失突變體得到 的抗G418的藻落。
圖ll. 7V尸7Y/基因PCR檢測(cè)結(jié)果。1-7，轉(zhuǎn)化藻株l-7; 8，未轉(zhuǎn)化藻株 4; 9，陽性質(zhì)粒。
圖12.7V尸-7基因PCR檢測(cè)結(jié)果。1，陽性質(zhì)粒；2，未轉(zhuǎn)化藻株"rw-4; 3-9，轉(zhuǎn)化藻株l-7。圖13.轉(zhuǎn)基因小球藻粗蛋白提取液在液體培養(yǎng)基中對(duì)大腸桿菌的抑菌
效果。上圖Ck， LB培養(yǎng)基；1/2 1/64，分別為轉(zhuǎn)基因m7n-4粗蛋白提取 液用LB培養(yǎng)基稀釋的比例(V/V);下圖Ck， LB培養(yǎng)基；1/2 1/64，分 別為w，-4E蛋白提取液用LB培養(yǎng)基稀釋的比例(V/V)。
圖14.轉(zhuǎn)基因小球藻粗蛋白提取液在固體培養(yǎng)基上對(duì)大腸桿菌的抑菌
效果。1， 3:分別為"rm一可溶性蛋白提取液和無菌水；2， 4:轉(zhuǎn)基因藻
株可溶性蛋白提取液。
具體實(shí)施例方式
下面參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以 理解的是，下述實(shí)施例是舉例說明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本 發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所限定。
各種限制性內(nèi)切酶，DNA上樣緩沖液(6x Loading Buffer)購自TaKaRa 公司；普通Taq酶，plus 2000 Maker, DNA純化回收試劑盒，購自北京全 式金生物技術(shù)有限公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；葡萄糖及其他無 機(jī)試劑均購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；鮭魚精DNA購自 Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購于Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 TOYOBO公司；纖維素酶(Onozuka R-10),果膠酶(Onozuka R-IO)，果膠 酶Y-23購自鼎國公司；玻璃珠購于Sigma公司。
實(shí)施例1.橢圓小球藻硝酸還原酶突變體的表達(dá)載體構(gòu)建方法
根據(jù)Wz々m淑"啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:l)設(shè)計(jì)引物，上游引物 5， CCGGAAGCTTGTGCAGCGTGACCCG3， (SEQ ID NO:2);下游引物5， GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3， (SEQ IDN0:3)，其中在上游引物中加入歷>^111 酶切位點(diǎn)，下游引物中加入B"m//I酶切位點(diǎn)，用PCR方法從玉米基因組 中得到t/W^加"啟動(dòng)子，測(cè)序結(jié)果顯示為W^w加"啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:4，其在SEQ ID NO;l的5'端及3'端分別添加了歷"d III酶切位點(diǎn)和 Sam/7 I酶切位點(diǎn))。將PCR產(chǎn)物用/Z/"d in和&m//I內(nèi)切酶雙酶切，質(zhì)粒 pBI221 (Clontech)(圖l)也經(jīng)州>^111和^ 附//1內(nèi)切酶雙酶切161:連接過 夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在含有50mg/L氨芐霉素的LB培養(yǎng)基上
937。C倒置培養(yǎng)過夜，對(duì)長(zhǎng)出的抗性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，能夠得到
1987bp大小片段(即Wu一/^啟動(dòng)子)的質(zhì)粒即命名為pbinUGUS(圖2)。 根據(jù)Q序列(SEQ ID NO:5)，人工合成該基因，并在其上游加入S"w// I酶切位點(diǎn)，在下游加入Sm"I酶切位點(diǎn)。將合成基因用Sm"I和Sflm/ZI 內(nèi)切酶雙酶切，質(zhì)粒pbinUGUS也經(jīng)5>w" I和Saw// I內(nèi)切酶雙酶切16°C 連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct，在含有50mg/L氨芐霉素的LB 培養(yǎng)基上37t:倒置培養(yǎng)過夜，對(duì)長(zhǎng)出的抗性菌落測(cè)序鑒定為Q序列，則 將上述連接產(chǎn)物命名為pbinUf2GUS (圖3)。
將pbinUQGUS用歷W III內(nèi)切酶酶切，用同樣的酶切pSK-NR質(zhì)粒 (含有硝酸還原酶表達(dá)框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank， 接收號(hào)為AY275834， NR表達(dá)框序列如SEQ IDN0:6所示，涉及pSK-NR質(zhì) 粒及NR表達(dá)框的專利
發(fā)明者孫勇如, 洋 安, 尹維波, 張麗華, 軍 胡, 胡贊民, 趙世民, 陳宇紅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所