專利名稱：鼠源IgG核酸適配子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)--一系統(tǒng)進(jìn) 化指數(shù)富集技術(shù)設(shè)計(jì)和制備一組與鼠源IgG高特異性和高親和力結(jié) 合的鼠源IgG核酸適配子及其應(yīng)用。背景技術(shù)：
鼠源IgG是用于抗原檢測的單抗的主要種類，廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室 和臨床診斷領(lǐng)域。其高特異性、高親和性的配體，對于鼠IgG的分離 純化以及檢測具有重要意義，可替代生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用的二 抗。SELEX技術(shù)(系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))是90年代初研制的一種 新的組合化學(xué)技術(shù)，其利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨 機(jī)寡核苷酸文庫，其中隨機(jī)序列一般長度在20 40bp左右，文庫容 量在10" 1015之間，由于單鏈隨機(jī)寡核苷酸片段特別是RNA易形成 發(fā)卡、口袋、假節(jié)、G-四聚體等二級結(jié)構(gòu)，故能與蛋白質(zhì)、小肽，甚 至金屬離子結(jié)合，形成具有很強(qiáng)結(jié)合力的復(fù)合物。這種方法具有簡便、 快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，與其他組合化學(xué)庫如隨機(jī)肽庫、抗體庫和噬菌體 表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的核酸適配子具有許多 優(yōu)勢a.本身是寡核苷酸，分子量較小可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；b. 具有比抗體更高的親和性和特異性；c.便于標(biāo)記，在不同部位有選擇 性的標(biāo)記；d.穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，易于保存，對高溫和劇烈條件 不敏感。因此，寡核苷酸適配子在臨床檢測及診斷中具有良好的應(yīng)用 前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鼠源IgG核酸適配子，它通過SELEX技 術(shù)篩選鼠IgG的核酸適配子，與現(xiàn)有鼠IgG的特異性抗體相比，本發(fā) 明中的核酸適配子具有更高的特異性、親和力，因此可替代抗體，用 于簡潔快速、高靈敏度、高特異性的鼠IgG檢測及分離純化方法的建本發(fā)明的第二個目的是提供一種鼠源IgG核酸適配子替代抗體在鼠源 IgG檢測上的應(yīng)用或用于鼠源IgG的分離純化。本發(fā)明的第三個目的是提供第二種鼠源IgG核酸適配子。本發(fā)明的第四個目的是提供第二種鼠源IgG核酸適配子在鼠源IgG檢 測上的應(yīng)用或用于鼠源IgG的分離'純化。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種鼠源'IgG核酸適配子，其特征在于，它是具 有序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18的核苷酸序列之一。上述所述的SEQ IDNo.l SEQ ID No.18的核苷酸序列具有下述結(jié)構(gòu)之一<image>image see original document page 7</image>上述所述的核苷酸序列也可以是與SEQ.一種鼠源IgG核酸適配子的核苷酸序列之一相同功能。上述所述的核苷酸序列也可以是與SEQ 一種鼠源IgG核酸適配子的核苷酸序列之-有相同功能。上述所述的核苷酸序列也可以是用SEQ 一種鼠源IgG核酸適配子的核苷酸序列之一上述所述的核苷酸序列的不少于一個位 有堿基甲基化嘌呤或二氫尿嘧啶或次黃嘌呤ID No. 1 SEQ ID No. 18'中的 同源序列占60%以上，使其具有ID No. 1 SEQ ID No. 18中的 -雜交的寡核苷酸序列，使其具ID No. 1 SEQ ID No. 18中的 轉(zhuǎn)錄的RNA序列。 置的A或G或C或T或U被稀 置換后，使其具有相同功能。上述所述的核苷酸序列的不少于一個位置進(jìn)行磷酸化或甲基化 或氨基化或巰基化或同位素化或結(jié)合生物素或結(jié)合地高辛或結(jié)合熒 光物質(zhì)或結(jié)合納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記修飾，使其具有相同.功能。一種鼠源IgG核酸適配子的篩選制備方法，其特征在于，它是由以下步驟構(gòu)成(1) 用PCR制備ssDNA文庫；文庫擴(kuò)增方案一 采用對稱PCR擴(kuò)增得到5'端帶有生物素的dsDNA文庫，后者以鏈親和素磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離并變性解鏈，磁分離后經(jīng)乙醇沉淀得到 后續(xù)篩選的ssDNA文庫。 文庫擴(kuò)增方案二采用不對稱PCR，獲得ssDNA文庫。(2) 反篩與篩選 "以Protein A—瓊脂糖為基質(zhì),反篩去掉ssDNA文庫中的非特異 結(jié)合部分，篩選得到與鼠源IgG特異結(jié)合的ssDNA;(3) 克隆及陽性克隆的序列測定擴(kuò)增數(shù)輪篩選后所得次級文庫，回收目標(biāo)片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化， 挑取單克隆白斑，對PCR反應(yīng)鑒定的陽性克隆進(jìn)行序列測定。一種鼠源IgG核酸適配子的應(yīng)用，其特征在于在實(shí)驗(yàn)室、臨床及 工業(yè)化的應(yīng)用，包括用于鼠源IgG的檢測、鼠源IgG的分離純化。上述所述的鼠源IgG核酸適配子的應(yīng)用，其具有序列表中SEQ ID No. 19 SEQ ID No. 36的核苷酸序列之一，用于實(shí)驗(yàn)室、臨床及工業(yè) 化，包括鼠源IgG的檢測和/或鼠源IgG的分離純化。本發(fā)明的優(yōu)越性在于具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，與其他組 合化學(xué)庫如隨機(jī)肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷 酸文庫中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢1)本身是寡核苷酸，分子量 較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；2)具有比抗體更高的親和性和特 異性；3)便于標(biāo)記且可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記；4)重復(fù)性和 穩(wěn)定性好，且易于保存，即對高溫和劇烈條件不敏感。因此，SELEX 技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景，特別是在抗體工程領(lǐng)域。

圖1為檢測一種鼠源IgG核酸適配子與鼠源IgG特異性結(jié)合的 點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2為一種鼠源IgG核酸適配子檢測鼠源IgG的Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(其中圖2-a為核酸適配子檢測鼠源IgG的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖2- b為抗體檢測鼠源IgG的實(shí)驗(yàn)結(jié)果)v圖3為一種鼠源IgG核酸適配子檢測鼠源IgG的組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果(其中圖3-a為核酸適配子檢測鼠源IgG的組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖3- b為鼠源IgG組織化學(xué)檢測的空白對照)。具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l一種鼠源IgG核酸適配子，其特征是具有序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18所述的核苷酸序列之一。 SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列'5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCAGTCACTC TGTGTTTMG CCCAGTACCC 50 TCTTCAACTT GAGCAAMTC ACCTGCAGGG''G 3' 81SEQ ID No.2所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTMCGC ACGCATGTCA ACAGACGTCC 50 GCTGCACTTG AGCAAMTCA CCTGCAGGGG 3， 80SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列V5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTAGCGACA GACGCMTCC CCACGCGCAT 50 CGAGGCACTT GAGCAAMTC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.4所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCAAGA GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50 CCCGCMCTT GAGC嵐ATC ACCTGCAGGG G 3, 81SEQ ID No.5所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGGCAGCG ATAGAGCCAT CATCCCCCCC 50 CACCCACTTG AGCAAMTCA CCTGCAGGGG 3， 80SEQ ID No. 6所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTCACAC CGTCATTGAT CCTCCGACAC 50 AAGCTAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 7所述的核苷酸序列 ，5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTCCCTCAGC ACCCAGACCC CGCTTCTCCC 50ACATTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.8所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TACCCGTTAC CCMCCGATT TCCTTACGCC 50 GCMTTACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No.9所述的核苷酸序列5' ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCGCCCCACA ACACACTGTC CCGCTGCCAT 50 CCCGTCAACT TGAGCAAAAT CACCTGCAGG GG 3' 82SEQ ID No. IO所述的核苷酸序列:'"5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTGGCCCCG CTCTCTCCTA CCTCTTTCAC 50 CACGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 11所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGTATGCTG AGTGTACCAG CCCTTCTCTC 50 ACCCTAACTT GAGCAMATC ACCTGCAGGG G 3' 81SEQ ID No. 12所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGCCGMC CATCTCGATC CCCAGCTGGG 50 ACTACACTTG AGCAAAATCA CCTGCAGGGG 3' 80SEQ ID No. 13所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCMCATCC GGCTTCCCGC GTACGCGCGT 50TGTGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3, 81 SEQ ID No. 14所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCM《A GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50 CCCGCAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 15所述的核苷酸序列 ''5, ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGCCMTCC CCCMGGTTC CTCCATTACA 50TCCGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 16所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TC雄CGCCC CATACCGTCT TCACCCATCC 50 GCCCTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81SEQ ID No. 17所述的核苷酸序列''5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGAGCCCAT CACCTGCAGG GGACCCCGGA 50 TTCACTTGAG CA嵐TCACC TGCGGGGG 3， 78SEQ ID No. 18所述的核苷酸序列5， ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCACCTGGA AAAGCATAGC TTG嵐CATC 50 GCACAAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3， 81 本發(fā)明中用于SELEX篩選的單鏈DNA隨機(jī)庫及引物由 irwitrogen公司合成，兩端為固定序列，中間為35個堿基的隨機(jī)序 列5， CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT- ( N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3，，庫容量為10"以上，引物l: 5' CCCCT GCAGGTGATTTTGCTCMGT 3，，引物2: 5， -biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGAT ACT 3，，引物3: 5， biotin-CCCCTGCAGGT GATTTTGCTCMGT3，，引物 4: 5' -ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。鼠源IgG購于天津華生生物技術(shù) 有限公司，硝酸纖維素濾膜購于MiriiPore公司，寡核苷酸的純化試 劑購于北京天為時(shí)代公司，PCR試劑盒和T載體購于Promega公司。實(shí)施例2一種鼠源IgG核酸適配子的篩選制備方法，其特征在于，它是由以下步驟構(gòu)成(l)用PCR制備ssDNA文庫文庫擴(kuò)增方案一PCR反應(yīng)體系為 IOX擴(kuò)增緩沖液 10 ul 4種dNTP混合物各200 u mol/L引物l 100pmo1(5， CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCMGT 3，)引物2 lOOpmol (5， biotin-ATCCGCCTGATTAGCGAT ACT3，)模板DNA lug (5， CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCMGT- (N35)-AGTATCGCTMTCAGGCGGAT 3')Taq DNA聚合酶 2. 5UMg2+ 1.5ramol/X加雙或三蒸水至 100 ulPCR反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性3min,然后94'C變性lmin， 65°C 退火45sec， 72。C延伸30sec，循環(huán)30次,最后72。C延伸5min。將PCR擴(kuò)增得到5'端帶有生物素的dsDNA文庫，dsDNA產(chǎn)物經(jīng) 分離純化，與鏈親和素磁珠結(jié)合；然后用0. 15mol/L的Na0H使dsDNA 變性解鏈，磁分離；液體經(jīng)乙醇沉淀，溶于TE緩沖液中。98° C加 熱2 min，冰上1 min，室溫5 min，測定吸光度(A)值，作為篩選 的ss靈文庫。 "''文庫擴(kuò)增方案二利用引物l、引物2擴(kuò)增單鏈DNA文庫采用不對稱PCR，引物 1/引物2濃度比100: 1,擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性3min，然后94°C 變性30s， 65""C退火45s， 72'C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72。C延 伸7min。將獲得的產(chǎn)物(主要為ssDNA)于95。C作用3min,于冰中 2min，室溫放置10min,即為ssDNA文庫。(2)反篩與篩選100pmo1隨機(jī)ssDNA文庫和5nmo1 (tRNA+鮭魚精DNA)加入10 n 1 Protein A—瓊脂糖反篩，在100ul結(jié)合緩沖液中室溫孵育lhr;然后轉(zhuǎn)移液體，與鼠源IgG—Protein A—瓊脂糖25。C結(jié)合lhr，用沖 洗緩沖液洗6次，洗去未結(jié)合的ssDNA，再加洗脫緩沖液于8(TC作用 10min，洗脫下與鼠源IgG結(jié)合的ssIJNA,經(jīng)酚一氯仿抽提、乙醇沉 淀。將ssDNA溶解于20pl TE緩沖液中，用作擴(kuò)增的模板，進(jìn)行下 一輪篩選，重復(fù)篩選20輪。— (3)克隆及陽性克隆的序列測定以第20輪篩選所得文庫為模板，以引物1和引物^進(jìn)行PCR，瓊 脂糖電泳后回收81bp處片斷，與T載體4'C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5 a感 受態(tài)細(xì)胞，涂板(Amp+， IPTG誘導(dǎo)，X—gal為底物)，37'C培養(yǎng)16h 后，挑取單克隆白斑，置Amp+液體培養(yǎng)基搖菌過夜，提取質(zhì)粒，如 圖l所示質(zhì)粒電泳圖。以質(zhì)粒為模板，以引物l，引物4擴(kuò)增，如圖 2所示在81bp左右處有擴(kuò)增出的目標(biāo)條帶，將有目的條帶的陽性克隆進(jìn)行序列測定。 實(shí)施例3點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測一種鼠源IgG核酸適配子與鼠源IgG的結(jié)合將不同量鼠源IgG (0， 1， 2， 3， 4ng;體積均為10ul)點(diǎn)在硝 酸纖維素膜上，待吸收完全，將膜以3%BSA和100 ix 1鮭魚精DNA室 溫封閉l一l. 5h，然后將獲得的5'標(biāo)記生物素的一種鼠源IgG核酸 適配子lOOpmol以TBS稀釋至適當(dāng)體積，與膜雜交，室溫lh, TBST 洗后雜交辣根過氧化酶標(biāo)記的鍵親和素，發(fā)光顯跡，結(jié)果陽性，并呈 現(xiàn)梯度。表明篩選得到的一種鼠源IgG核酸適配子與鼠源IgG存在特 異性結(jié)合。實(shí)施例4 Western Blot法測定鼠源IgG將Hs578T細(xì)胞裂解液與加樣緩沖液混合，采用Bio-rad的 mini-VE電泳系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳，分離膠濃度12%，濃縮 膠5%，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用鼠源抗GSTn抗體與 膜孵育，洗滌后用5，標(biāo)記生物素的一種鼠源IgG核酸適配子與生物 素標(biāo)記的抗鼠IgG的特異性抗體分別癡交，繼而與辣根過氧化酶標(biāo)記 的鏈親和素孵育，洗滌后用發(fā)光顯跡液發(fā)光，暗室內(nèi)X光片曝光，X光片顯影定影。結(jié)果均顯示明顯的條帶，表明一種鼠源IgG核酸適配 子可替代抗體用于鼠源IgG的檢測。 實(shí)施例5組織化學(xué)法檢測鼠源IgG以 篩 選 的 阮，觀U 序 列 為 ATCCGCCTGATTAGCGATACTCAGTCACTCTGTGTTTMG板，以引物3和引物4進(jìn)行不對稱PCR，引物3 (lOOpmol) /引物4 濃度比200: 1,擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性3min,然后94。C變性30s， 65。C退火45 s， 72。C延伸lmin,循環(huán)35次，最后72°。延伸7min。 反應(yīng)產(chǎn)物主要為5'生物素標(biāo)記的DNA適配子，將其于95'C作用3min， 于冰中2min，室溫放置10min，'作為檢測試劑備用。人乳腺癌病理切 片常規(guī)脫蠟至水，0. 3%仏02-甲醇溶液作用30min封閉內(nèi)源性過氧化物 酶，TBS洗5min，與鼠源抗GSTn抗體孵育后再與制備好的DNA適配 子室溫孵育lh，設(shè)立空白對照組，TBS洗3X5min。切片與辣根過氧 化物酶標(biāo)記的親和素(1: 1000稀釋)孵育30min, DAB顯色液(50mg 溶于100ml TB液中，臨用前加入10pl 30% H202)中顯色5-10min, 鏡下觀察控制顯色程度。結(jié)果空白對照組無明顯棕黃色沉淀，而與鼠 源IgG核酸適配子孵育的乳腺癌組織顯示明顯的棕黃色沉淀，表明篩 選得到的核酸適配子能與鼠源IgG特異結(jié)合，從而可用于鼠源IgG的 檢測和分離純化。 ' 實(shí)施例6 …一種鼠源IgG核酸適配子，具有序列表中SEQ ID No. 19 SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列之一。SEQ ID No. 19所述的核苷酸序列.5'CAGTCACTCT GTGTTTAAGC CCAGTkcCT CTTCA 3， 35SEQ ID No. 20所述的核苷酸序列5，CCCTMCGCA CGCATGTCM CAGACGTCCG CTGC 3' 34SEQ ID No. 21所述的核苷酸序列5'GTAGCGACAG ACGCMTCCC CACGCGCATC GAGGC 3' 35SEQ ID No. 22所述的核苷酸序列5'GACCCAAGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3， 35 SEQ ID No. 23所述的核苷酸序列^ 5'GCGGCAGCGA TAGAGCCATC ATCCcfccCCC ACCC 3， 34 SEQ ID No. 24所述的核苷酸序列 5'CCCTCACACC GTCATTGATC CTCCGACACA AGCTA 3， 35 SEQ ID No. 25所述的核苷酸序列 ， 5'TCCCTCAGCA CCCAGACCCC GCTTCTCCCA CATTC 3， 35 SEQ ID No. 26所述的核苷酸序列 5'ACCCGTTACC CMCCGATTT CCTTACGCCG CMTT 3， 35 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列 5，CGCCCCACM CACACTGTCC CGCTGCCATC CCGTCA 3， 36 SEQ ID No. 28所述的核苷酸序列 5，GTGGCCCCGC TCTCTCCTAC CTCTlltACC ACGAC 3' 35 SEQ ID No. 29所述的核苷酸序列 5，TGTATGCTGA GTGTACCAGC CCTTCTCTCA CCCTA 3， 35 SEQ ID No. 30所述的核苷酸序列 5，GCGCCGAACC ATCTCGATCC CCAGCTGGGA CTAC 3' 34 SEQ ID No. 31所述的核苷酸序列 5'CCMCATCCG GCTTCCCGCG TACiXGCGTT GTGAC 3， 35 SEQ ID No. 32所述的核苷酸序列 5'GACCCMGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3， 35 SEQ ID No. 33所述的核苷酸序列 5，TGCCMTCCC CCMGGTTCC TCCA竹ACAT CCGAC 3， 35 SEQ ID No. 34所述的核苷酸序列 5'CAMCGCCCC ATACCGTCTT CACCCATCCG CCCTC 3， 35 SEQ ID No. 35所述的核苷酸序列 5，TGAGCCCATC ACCTGCAGGG GACCCCGGAT TC 3， 32 SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列 5'GCACCTGGM MGCATAGCT TGAAACATCG CACAA 3， 35 SEQ ID No. 19所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 1所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 20所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 2所述的核苷酸 序列第22至55的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 #SEQ ID No. 21所述的核苷寧序列% SEQ ID No. 3所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一遂，這兩個序列所示的^種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 'SEQ ID No. 22所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 4所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 23所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 5所述的核苷酸 序列第22至55的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 24所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 6所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩'個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。力" ？SEQ ID No. 25所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 7所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 26所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 8所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一惡這兩個序列所示的一種鼠源IgG核酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 9所述的核苷酸 序列第22至57的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 "SEQ ID No. 28所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 10所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 29所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 11所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致,這兩'個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 30所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 12所述的核苷酸 序列第22至55的堿基順序一致，這裔個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 31所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 13所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。 ，SEQ ID No. 32所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 14所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 33所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 15所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。
；、、.SEQ ID No. 34所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 16所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 35所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 17所述的核苷酸 序列第22至53的堿基順序二致，這^個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQ ID No. 36所述的核苷酸序列與SEQ ID No. 18所述的核苷酸 序列第22至56的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種鼠源IgG核 酸適配子具有相同的功能。SEQUENCE LISTING<110>國家納米技術(shù)與工程研究院<120>鼠源IgG核酸適配子及其制備方法和/^用<130> 2007101880615<140> 2007101880615 <141> 2007-U-23<150> 200610130352.4 <151> 2006-12-15<160> 36< 170> Patentln version 3.4<210> 1<211> 81<212> DNA<213> 人.r序列<400> 1atccgcctga ttagcgatac tcagtcactc tgtgtttaag cccagtaccc tcttcaactt 60gagcaaaatc acctgca鵬g 81<210> 2<211> 8'0<212> DNA<213> 人工序列<400>. 2atccgcctga ttagcgatac tccctaacgc acgcatgtca acagacgtcc gctgcacttg 60 agcaaaatca cctgcagggg 80<210> 3<211> 81<212> DNA<213> ^工序列<400> 3atccgcctga ttagcgatac tgt^cgaca gacgcaatcc ccacgcgcat cgaggcactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 4 <211> 81 <212> DNA<2i3>人i:序列<400> 4atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 5<2U> 80<212> pNA <213>人工序列<400> 5atccgcctga ttagcgatac tgcggcagcg atagagccat catccccccc cacccacttg 60 agcaaaatca cctgcag^g 80<210> 6<211> 81<212> DNA <213>人工序列<40O> 6atecgc魄a ttagcgatac tccctcac^;敏cattgat cctccgacac aagctaactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g<210> 7<211> 81<212> DNA <213>人.l:序列81<400> 7atccgcctga ttagcgatac ttcccte^c acccagaccc cgcttctccc acattcactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 8<211> 81<212> DNA<213> 人丄序列<400> 8atccgcctga ttagcgatac tacccgttac ccaaccgatt tccttacgcc gcaattactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 9<211> 82<212> DNA <213>人工序列<400> 9atccgcctga ttagcgatac tcgccccaca acacactgtc ccgctgccat cccgtcaact 60 ,tgagcaaaat cacctgcagg gg 82<210> 10<211> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 10atccgcctga ttagcgatac tgtggccccg ctctctccta cctotttcac cacgacactt 60 gagcaaaatc acctgc^gg g 81'<210> 11<211> 81<212> DNA <213>'人工序列<400> 11atccgcctga ttagcgatac ttgtatgctg agtgtaccag cccttctctc accctaactt 60gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 12 <2U> 80<212> DNA <213> 人工序列<400> 12atccgcctga ttagcgatac tgcgccgaac catctcgatc cccagctggg actacacttg 60 agcaaaatca cctgcagggg 80<210> 13<211> 81<212>' DNA <213>人T序列<400> 13atccgcctga ttagcgatac tccaacatcc ggcttcccgc gtacgcgcgt tgtgacactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 14<211> 81.<212> DNA <213>人工序列<400>' 14atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt 60 g堪caaaate acctgcaggg g 81<210> 15<2H> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 15atccgcctga ttagcgatac ttgcc幼tcc ccca^gttc ctccattaca tccgacactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 16<211> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 16atccgcctga ttagcgatac tcaaacgccc cataccgtct tcacccatcc gccctcactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 17<211> 7.8<212> DNA.<213> 人工序列<400> 17atccgcttga ttagcgatac ttgagcccat cacctgcagg ggaccccgga ttcacttgag 60 caaaatcacc tgcggggg 78<210> 18<211> 81<212> DNA <213>人工序列<400> 18.atccgcctga ttagcgatac tgcacc^ga aaagcatagc ttgaaacatc gcacaaactt 60 gagcaaaatc acctgcaggg g 81<210> 19<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 19cagtcactct gtgtttaagc ccagtaccct cttca 35'<210> 20<211> 34<212> DNA <213>人工序列<400> 20ccctaacgca cgcatgtcaa cagacgtccg ctgc 34<210> 21<211>' 35 <212> DNA <213>人工序列<40O 21gtagcgacag acgcaatccc cacgcgcatc gaggc 35<210> 22<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 22gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca 35<210> 23<211> 34<212> DNA <213>人工序列<400> 23gcggcagc扭tagagccatc atcccccccc accc 34<210> 24<211>， 35<212> DNA <213>人工序列<400> 24cccteacacc gtcattgate ctccgacaca. agcta 35<210> 25<211> 35<212> t)NA <213>人工序列<400> 25tccctcagca cccagacccc gcttctocca cattc 35<210> 26 <211> 35 <212> DNA<213> 人工序列 <400> 26acccgttacc caaccgattt ccttacgccg caatt 35<210> 27<2rf> 36<212> DNA <213>人工序列<400> 57cgccccacaa cacactgtcc cgctgccatc ccgtca 36<210>. 28<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 28gtggccccgc tctctcctac ctctttcacc acgac 35<210> 9<211> 35.<212> DNA <213>人工序列<400> 29tgtatgctga gtgtaccagc ccttctctca cccta 3 5<210> 30<211> 34<212> DNA <213>人工序列<400> 2|0gcgccgaacc atctcgatcc cc堪ctg^a ctac 34<210> 31<211>' 35<212> DNA <213>人工序列<400> 31 》 .ccaacatccg gcttcccgcg tacgcgcgtt gtgac 35<210> 32<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 32gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca 35<210> 33.<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 33tgccaatccc ccaaggttcc tccattacat ccgac 35<210> 34<211> 35<212> DNA <213>人工序列<400> 34'caaacgcccc ataccgtctt cacccatccg ccctc 35<210>' 35<211> 32<212> DNA<213> 人工序列<400> 35tg呢cccatc acctgcaggg gaccccggat te 32<210> 36<2U> 35<212> DNA<213> 人工序列<400> 36gcacctggaa aagcatagct tgaaacatcg cacaa 3權(quán)利要求
1. 一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在于，它是具有序列表中SEQ IDNo.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在于所說的 SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18的核智酸序列具有下述結(jié)構(gòu)之一
3.<image>image see original document page 3</image>3、 .根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在于所說的 核苷酸序列也可以與SEQ ID No. 1廣SEQ ID No. 18中的一種鼠源IgG核酸適 配子的核苷酸序列之一同源序列占60%以上，使其具有相同功能。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在于所說的拔-竹Ef酸序列也可以與SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18一種鼠源IgG核酸適合匕配子的核苷酸序列之一雜交的寡核苷酸序列，使其具有相同功會
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在于所說的 核苷酸序列也可以用SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 18中的一種鼠源IgG核酸適 '配子的核苷酸序列之一轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在于所說的 核苷酸序列的不少于一個位置的A或G或C或T或U被稀有堿基甲基化嘌呤 或二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后，使其具有相同功能。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在 于所說的核苷酸序列的不少于,一個位置進(jìn)行磷酸化或甲基化或氨基 化或巰基化或同位素化或結(jié)合生物素或結(jié)合地高辛或結(jié)合熒光物質(zhì)或結(jié)合納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記修飾，使其具有相同功能。
8、 一種上述鼠源IgG核酸適配子的篩選制備方法，其特征在于它是由以下步驟構(gòu)成U)用PCR制備ssDNA文庫；文庫擴(kuò)增方案一采用對稱PCR擴(kuò)增得到5'端帶有生物素的dsDNA文庫，后者以 鏈親和素磁珠為基質(zhì)進(jìn)行分離并變性解鏈，磁分離后經(jīng)i醇沉淀得到 后續(xù)篩選的ssDNA文庫。文庫擴(kuò)增方案二-采用不對稱PCR，獲得ssDNA文庫。(2) 反篩與篩選以Protein A—瓊脂糖為基質(zhì)，反篩去掉ssDNA文庫中的非特異 結(jié)合部分，篩選得到與鼠源IgG特異結(jié)合的ssDNA;(3) 克隆及陽性克隆的序列測定擴(kuò)增數(shù)輪篩選后所得次級文庫，回收目標(biāo)片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化， 挑取單克隆白斑，對PCR反應(yīng)鑒定的陽性克隆進(jìn)行序列測定。
9、 一種上述鼠源IgG核酸適配子的應(yīng)用，其特征在于在實(shí)驗(yàn)室、 臨床及工業(yè)化的應(yīng)用，包括用于鼠源IgG的檢測、鼠源IgG的分離純 化。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所說的一種鼠源IgG核酸適配子的應(yīng)用，其 特征在于所說的具有序列表中SEQ ID No.l9 SEQ ID No.36的核苷 酸序列之一，用于實(shí)驗(yàn)室、臨床及工業(yè)化，包括鼠源IgG的檢測和/ 或鼠源IgG的分離純化。
全文摘要
一種鼠源IgG核酸適配子，其特征在于它是具有序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一；制備方法包括(1)用PCR制備ssDNA文庫、(2)反篩與篩選、(3)克隆及陽性克隆的序列測定；應(yīng)用其特征在于在實(shí)驗(yàn)室、臨床及工業(yè)化的應(yīng)用，包括用于鼠源IgG的檢測、鼠源IgG的分離純化。本發(fā)明的優(yōu)越性本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；具有比抗體更高的親和性和特異性；便于標(biāo)記且可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記；重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對高溫和劇烈條件不敏感；因此，SELEX技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景，特別是在抗體工程領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/13GK101275137SQ20071018806
公開日2008年10月1日 申請日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者吳淑慶, 弓景波 申請人:國家納米技術(shù)與工程研究院