專利名稱：：一種酶法制備乳鐵蛋白抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酶法制備乳鐵蛋白抗菌肽的方法，具體涉及以乳鐵蛋白為原料，采用豬胃蛋白酶水解乳鐵蛋白，以及以大腸桿菌為測試菌種，檢測抗菌肽的活性。屬于乳鐵蛋白抗菌肽制備
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景現(xiàn)代生物代謝研究發(fā)現(xiàn)人類攝取的蛋白質(zhì)經(jīng)過消化道的多種酶水解后，不像以前認(rèn)為的那樣僅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽的形式直接吸收。其中某些小肽不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，且同時具有重要的生理功能，如促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、防止肝病腦病、抗菌、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活力、降低血管膽固醇含量、提高人體免疫力的功能等。這些小肽被人們稱為活性肽。活性肽按獲取方法不同可以分為四類(一)從天然生物體中提取(如肽類抗生素、激素等)；(二)化學(xué)合成法；(三)DNA重組法；(四)體外酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生。不同的方法適合不同的目的，取決于目的肽的長短、數(shù)量及用途。每種方法各有其優(yōu)缺點。天然的生物活性肽的含量很少，可提取其中的生物活性肽進(jìn)行研究，但不可能大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用?；瘜W(xué)合成法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)高價的藥理級肽，但是它的成本高，而且副產(chǎn)品對人體有害。重組DNA技術(shù)適用于長鏈多肽和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中，但與其它方法相比較發(fā)展尚未成熟。酶法生產(chǎn)功能肽有很多優(yōu)點，如生產(chǎn)條件溫和、產(chǎn)品安全性高且可定位生產(chǎn)特定的肽，成本低，已成為生物活性肽最主要的生產(chǎn)方法?？咕氖且活悓岱€(wěn)定的堿性小肽，分子量約為4KD，等電點8.9-10.7。具有廣譜高效的抗菌活性(一般抑殺濃度均在微摩爾級)，對多種革蘭氏陰性(G')細(xì)菌和革蘭氏陽性(G+)細(xì)菌，特別是耐藥性菌株有較強的抑殺作用，也可抑殺某些真菌、病毒及原蟲，并對多數(shù)癌細(xì)胞及動物實體瘤有明顯的殺傷作用?？咕鷻C理獨特，對正常的哺乳動物細(xì)胞和酵母無裂解作用，不會使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性和交叉性。有希望成為新一代抗菌劑?？咕倪€與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物不同，不會對造血系統(tǒng)造成損害，從而避免了對肌體抗腫瘤免疫造成的損害。大多數(shù)抗菌肽本質(zhì)上幾乎都是陽離子型，也叫陽離子肽。由于具有廣譜抗菌作用，能殺死抗生素耐藥菌株，且殺菌機制使病原菌不易產(chǎn)生耐藥性突變，以及能抑殺一些真菌、病毒、寄生蟲及腫瘤細(xì)胞和實體瘤等特點，抗菌肽有望開發(fā)成為新一代抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和抗癌藥物。由于其應(yīng)用前景廣闊，現(xiàn)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點。目前，國外已有10多種抗菌肽作為治療細(xì)菌、病毒性感染和腫瘤的新藥進(jìn)入人體臨床實驗。隨著人們生活水平的提高，人們對食品的要求也越來越高，攝取食品不僅僅是為了解決溫飽問題，也不僅僅是為了獲得必需的營養(yǎng)以維持生存，而且還要求它具有一定的調(diào)節(jié)生理活動的功能。目前，功能性食品已成為食品行業(yè)的一個研究熱點，被譽為21世紀(jì)的食品，代表當(dāng)代食品發(fā)展的潮流。從生理活動物質(zhì)的研究出發(fā)，或從特定的消費者特殊要求出發(fā)，進(jìn)行新型功能性食品的開發(fā)，是目前功能性食品的發(fā)展方向。對于來源于天然、在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景的生物活性蛋白，乳鐵蛋白值得人們更多的關(guān)注。1992年以來，有關(guān)乳鐵蛋白的國際研討會議已經(jīng)召開了多次，歷屆會議就乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生理活性以及在臨床上的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛探討。這表明乳鐵蛋白特有的生物學(xué)意義已受到世界范圍的廣泛重視。近代研究證明，乳鐵蛋白雖然具有抗菌活性，但其耐熱性較差，乳肽不僅溶解性好、消化吸收率高、耐酸、耐熱，而且具有多種生理調(diào)節(jié)功能。發(fā)朋內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種以乳鐵蛋白為原料制備抗菌性較強的抗菌肽的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種酶法制備乳鐵蛋白抗菌肽的方法，以乳鐵蛋白為原料，采用豬胃蛋白酶水解乳鐵蛋白，以及以大腸桿菌為測試菌種，檢測抗菌肽的抑菌活性。將質(zhì)量濃度2%-3.5%的乳鐵蛋白溶液加入恒溫反應(yīng)容器中不斷攪拌，達(dá)到40-50。C后，保溫5min，用1.0mol/L的HC1調(diào)節(jié)pH2.0-2.5,加入豬胃蛋白酶，加酶量為底物乳鐵蛋白質(zhì)量的1%-2%，在反應(yīng)過程中不斷攪拌，并滴加1.0mol/LHC1以維持pH恒定不變，在40-50'C下酶解2-2.5h,控制DH值10%-12%為反應(yīng)終點，停止攪拌，并將溫度迅速升到80°C，維持15min以鈍化酶，添加1.0mol/LNaOH調(diào)整pH至7.0，15000xg冷凍離心30min，上清液冷凍干燥，得到的凍干粉即為乳鐵蛋白抗菌肽，其分子量大多分布在200-6000Da。優(yōu)化的工藝條件為將質(zhì)量濃度3%的乳鐵蛋白溶液加入恒溫反應(yīng)容器中不斷攪拌，達(dá)到45'C后，保溫5min，用1.0mol/L的HC1調(diào)節(jié)pH2.5。加入豬胃蛋白酶，加酶量為底物乳鐵蛋白質(zhì)量的1%。在反應(yīng)過程中不斷攪拌，并滴加1.0mol/LHCl以維持pH恒定不變。在45。C下酶解2h，控制DH值10%-12%為反應(yīng)終點，停止攪拌，并將溫度迅速升到80°C，維持15min以鈍化酶。添加1.0mol/LNaOH調(diào)整pH至7.0，15000xg冷凍離心30min。上清液冷凍干燥，得到的凍干粉即為乳鐵蛋白抗菌肽，其分子量大多分布在200-6000Da。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明流程簡單，實用性強，所得到的乳鐵蛋白抗菌肽抗菌性較強，是一種廣譜抗菌肽，能抑制包括致病性大腸桿菌在內(nèi)的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，對真核細(xì)胞沒有影響，是一種功能性抗菌肽，其溶解性好、消化吸收率高、耐酸、耐熱，而且具有多種生理調(diào)節(jié)功能，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明對于促進(jìn)乳制品的深加工及初乳資源的綜合利用，提高我國人民特別是嬰幼兒的健康水平，研究和開發(fā)功能性食品配料都具有重要的意義。分析方法1、水解度的測定取0.25mL酶解液，加入到10mL含有1%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液的試管中，在75"C水浴中保溫15min，并不斷震蕩試管，然后用SDS稀釋至所需的濃度，取此稀釋液0.25mL，加2mL0.21mol/L、pH8.20的磷酸鹽緩沖溶液和1.0mL0.1。/。的三硝基苯磺酸(TNBS)溶液，放入50。C恒溫水浴鍋，避光反應(yīng)1h后，加入4mL0.1。/。的HCl中止反應(yīng)，室溫放置30min，340nm比色。水解度公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中ht。t-底物中肽鍵總數(shù)(mmol/g)，約為8.3。2、抗菌活性的測定抑菌率的測定采用平板計數(shù)法。將保存的菌種接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上(若干支)，于37T:培養(yǎng)24h，連續(xù)活化2次。經(jīng)2次活化的實驗菌種，加無菌生理鹽水洗滌后，轉(zhuǎn)移至無菌試管并振蕩使菌體分布均勻。根據(jù)吸光度值(A56()nm)與菌液濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，將菌液調(diào)至10、fU/mL。取裝有4mL肉湯蛋白胨培養(yǎng)基(蛋白胨1%、牛肉浸膏0.3Q/anNaC10.5X)的試管，分別編號，各試管加入菌濃為106cfu/mL的菌液0.5mL，然后在實驗組試管中分別加入不同酶解條件下乳鐵蛋白水解肽溶液0.5mL，然后置于37士rC搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)6h后，平板計數(shù)。抑菌性大小用Y表示，計算公式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>氨基酸自動分析儀法將不同酶解條件下乳鐵蛋白水解肽溶液樣品置于水解管中，加入6mol/L的HCl溶液，真空封口，在110。C下水解24h，冷卻后定容、過濾、蒸干，再加入0.02mol/L的HCl溶液在空氣中放置30min，上機測定氨基酸含量。結(jié)果見表l。表1乳鐵蛋白及其抗菌肽的氨基酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4、相對分子質(zhì)量分布的測定用高效液相排阻色譜(highperformancesizeexclusionchromatography,HPSEC)檢測乳鐵蛋白多肽的相對分子質(zhì)量分布。儀器Waters600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器(波長220nm)和M32工作站)；色譜柱TSKgel2000SWXL300nmx7.8mm流動相體積比乙醇水氯乙酸=45:54:1;檢測波長220nm;流量0.5mL/min;柱溫30°C;樣品制備吸取樣品2mL于10mL容量瓶中，用流動相稀釋到刻度，用微孔過濾膜過濾后進(jìn)樣。所測樣品分子量大多分布在200-6000Da。工藝條件的確定1、單因素試驗酶的篩選分別選用537酸性蛋白酶、胃蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶、胰蛋白酶5種蛋白酶水解乳鐵蛋白，并用分析方法l、2測不同時間水解度，以及最后水解產(chǎn)物的抑菌率。酶解時間的確定DH隨著水解時間的延長不斷升高，但不同反應(yīng)時間反應(yīng)趨勢明顯不同。DH在開始的15min內(nèi)顯著升高，隨著水解的進(jìn)行，DH的增加趨勢減緩，但仍呈上升趨勢。24h增加趨勢更加平緩，變化很小。因此，將乳鐵蛋白的水解時間定為2-2.5h。酶解溫度的確定溫度從蛋白酶催化反應(yīng)速度及蛋白酶的穩(wěn)定性兩個方面影響酶解反應(yīng)的效率。胃蛋白酶的最適溫度一般在35°(:~551:之間，隨底物的不同而有所不同。在pH2.0，加酶量([E]/[S])3%,[S]50mg/mL的條件下，酶解2h，測定不同溫度下的DH。結(jié)果顯示，溫度對乳鐵蛋白的水解有較大影響，隨著溫度升高，DH先增大后減小。在35°C~40°C時DH上升很慢，但在40°C~45°C酶具有較強的活性，DH上升最快。在45。C55'C時，DH迅速下降。因此，溫度在40-50'C較為適宜。底物濃度的確定在pH2.0，[E]/[S]為3。/。，溫度為45'C的條件下酶解2h，測定不同[S]對DH的影響。結(jié)果顯示，在酶濃度恒定條件下，當(dāng)[S]很小時(10mg/mL，20mg/mL)，隨著[S]濃度的增加，DH也逐漸增加。在[S]為30mg/mL時，DH達(dá)到最大值。隨著[S]繼續(xù)增大，DH迅速下降。因此，確定[S]為20-35mg/mL,優(yōu)選[S]為30mg/mL。酶與底物濃度比在pH2.0，[S]30mg/mL，溫度45°C的條件下酶解2h,測定不同[E]/[S]條件下的DH,結(jié)果顯示，在[E]/[S]為0.5X時，DH較小，在[E]/[S]為1X4X時，DH增加不明顯。因此，選擇同/[S]為P/。-2。/。較為合適。優(yōu)選[E]/[S]為1%。2、響應(yīng)面回歸分析Adler-Nissen認(rèn)為影響酶解反應(yīng)主要變量是溫度、pH、[E]/[S]。所以選用胃蛋白酶水解LF，確定[S]為30mg/mL、水解時間為2h，對酶解溫度(X!)、酶與底物濃度比(X2)及酶解pH(X3)進(jìn)行二次回歸設(shè)計試驗和分析，以DH、抑菌率(Y/%)為響應(yīng)值。采用Box-Behnken設(shè)計對酶解條件進(jìn)一步優(yōu)化，見表2、表3。表2酶解工藝優(yōu)化的因素水平<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>酶解溫度45'C、酶與底物濃度比1。/。及酶解pH2.5為優(yōu)選的工藝水平。該工藝條件下的重復(fù)試驗(試驗序號13-15)，顯示平均DH值為13%，抑菌率為96%。圖1最優(yōu)水解條件下的水解進(jìn)程曲線和對應(yīng)的抗菌性。具體實施方式實施例1按照說明書上述工藝路線，將質(zhì)量濃度3%的乳鐵蛋白溶液加入恒溫反應(yīng)容器中不斷攪拌，達(dá)到45。C后，保溫5min，用1.0mol/L的HC1調(diào)節(jié)pH2.5。加入豬胃蛋白酶，加酶量為底物乳鐵蛋白質(zhì)量的1%。在反應(yīng)過程中不斷攪拌，并滴加1.0mol/LHCl以維持pH恒定不變。在45'C下酶解2h，反應(yīng)到終點，測得的DH值為13。/。，停止攪拌，并將溫度迅速升到80'C,維持15min以鈍化酶。添加1.0mol/LNaOH調(diào)整pH至7.0，15000xg冷凍離心30min。上清液冷凍干燥，得到的凍干粉即為乳鐵蛋白抗菌肽，抑菌率為96%。權(quán)利要求1、一種酶法制備乳鐵蛋白抗菌肽的方法，其特征是以乳鐵蛋白為原料，采用豬胃蛋白酶水解乳鐵蛋白；將質(zhì)量濃度2％-3.5％的乳鐵蛋白溶液加入恒溫反應(yīng)容器中不斷攪拌，達(dá)到40-50℃后，保溫5min，用1.0mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH2.0-2.5，加入豬胃蛋白酶，加酶量為底物乳鐵蛋白質(zhì)量的1％-2％，在反應(yīng)過程中不斷攪拌，并滴加1.0mol/LHCl以維持pH恒定不變，在40-50℃下酶解2-2.5h，控制DH值10％-12％為反應(yīng)終點，停止攪拌，并將溫度迅速升到80℃，維持15min以鈍化酶，添加1.0mol/LNaOH調(diào)整pH至7.0，15000×g冷凍離心30min，上清液冷凍干燥，得到的凍干粉即為乳鐵蛋白抗菌肽，其分子量大多分布在200～6000Da。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是優(yōu)選的工藝條件為；將質(zhì)量濃度3%的乳鐵蛋白溶液加入恒溫反應(yīng)容器中不斷攪拌，達(dá)到45"C后，保溫5min，用1.0mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH2.5，加入豬胃蛋白酶，加酶量為底物乳鐵蛋白質(zhì)量的1%，在反應(yīng)過程中不斷攪拌，并滴加1.Omol/LHC1以維持pH恒定不變，在45'C下酶解2h，控制DH值10n/。-12。/。為反應(yīng)終點，停止攪拌，并將溫度迅速升到80。C，維持15min以鈍化酶，添加1.0mol/LNaOH調(diào)整pH至7.0，15000xg冷凍離心30min，上清液冷凍干燥，得到的凍干粉即為乳鐵蛋白抗菌肽，其分子量大多分布在200~6000Da。全文摘要一種酶法制備乳鐵蛋白抗菌肽的方法，屬于乳鐵蛋白抗菌肽制備
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以乳鐵蛋白為原料，采用豬胃蛋白酶在一定條件下對乳鐵蛋白進(jìn)行水解，最終得到具有較強抗菌活性的乳鐵蛋白抗菌肽混合物。本發(fā)明流程簡單，實用性強，所得到的乳鐵蛋白抗菌肽抗菌性較強，是一種廣譜抗菌肽，能抑制包括致病性大腸桿菌在內(nèi)的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，對真核細(xì)胞沒有影響，是一種功能性抗菌肽，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明對于促進(jìn)乳制品的深加工及初乳資源的綜合利用，提高我國人民特別是嬰幼兒的健康水平，研究和開發(fā)功能性食品配料都具有重要的意義。文檔編號C12P21/02GK101235408SQ200710190609公開日2008年8月6日申請日期2007年11月27日優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日發(fā)明者盧蓉蓉,張文斌,楊瑞金,王新保申請人:江南大學(xué)