專利名稱：水牛屬產(chǎn)品分子診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水牛屬產(chǎn)(制)品的檢驗(yàn)、診斷用的試劑盒，屬于分 子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景當(dāng)前鑒別水牛屬產(chǎn)(制)品所采用的主要方法是通過(guò)觀察(肉眼 或顯微鏡)和氣味辨別。在鑒別與水牛同為牛亞科的其它牛種產(chǎn)(制) 品時(shí)，上述幾種方法均無(wú)法區(qū)分，這是由于動(dòng)物的表型由編碼蛋白的 基因所決定，牛亞科內(nèi)物種間同源蛋白差異極小，它們的產(chǎn)(制)品 外觀、氣味甚至紋理極其相似。在科分類及以上物種產(chǎn)(制)品間鑒別，如牛羊源性成分的鑒別檢測(cè)，已有與本發(fā)明類似的PCR鑒別過(guò)程，但所采用的基因位點(diǎn)無(wú)法應(yīng)用于亞科內(nèi)物種間的鑒別；而且，科分類 及以上物種產(chǎn)(制)品間表型差異較大，其鑒別工作，除了無(wú)法觀察 或其它感官鑒別的情形，可以通過(guò)觀察和氣味辨別替代。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有鑒別水牛屬產(chǎn)(制)品的方法存在的不 足，提供一種檢出率高、假陽(yáng)性率低，使用方便的水牛屬產(chǎn)(制)品 分子診斷試劑盒。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的水牛屬產(chǎn)品分子診斷試劑盒，包括 盒體，其特征是盒體內(nèi)設(shè)有以水牛屬特異性基因位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的水牛屬特異性引物對(duì)和PCR體系。所述的水牛屬特異性引物對(duì)，即上游: 5' -GCGCTCCACAGAATCTCGA-3 ，，下游5' -GAGTGCAGCAGGGGCCAGC-3 ，的 部分或全部。所述的PCR體系中Mgcl2濃度為lmM， Taq酶1U/25W，退火溫度60-64°C。本發(fā)明科學(xué)合理，通過(guò)大量的測(cè)序工作和比對(duì)分析，獲得屬間物 種特異性基因位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)方法解決了屬間物種產(chǎn) (制)品的鑒別難題。試劑盒所采用的分子生物學(xué)試劑均為商品化產(chǎn) 品，對(duì)水牛屬產(chǎn)(制)品鑒別檢出率很高，假陽(yáng)性率低，結(jié)果穩(wěn)定， 重復(fù)性好。經(jīng)過(guò)對(duì)29個(gè)水?；蚪M模板進(jìn)行PCR反應(yīng)試驗(yàn)，均檢出特 異性擴(kuò)增條帶，檢出率很高，在3次水牛、黃牛和牦牛基因組樣本的 混合檢測(cè)試驗(yàn)中，均檢出水牛樣本，并且未出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。水牛屬 產(chǎn)(制)品分子診斷試劑盒，應(yīng)用于食品檢驗(yàn)領(lǐng)域和畜牧技術(shù)領(lǐng)域。


圖1是以水牛、黃牛和牦牛基因組樣本同批混合檢測(cè)，用特異性 引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果獲得指示劑位置(200 bp左右)附近的水牛 特征條帶(203bp)，而黃牛和牦?；蚪M樣本未見(jiàn)特征條帶的圖片(采 用其它條件時(shí)，三種基因組樣本均出現(xiàn)較多條帶)，圖中1，2道為 水牛樣本；3，4，5道為黃牛樣本；6，7，8道為牦牛樣本。圖2是對(duì)29個(gè)水牛樣本進(jìn)行超過(guò)40次PCR檢測(cè)，均檢出特征條帶 的圖片，圖中l(wèi)-13道為不同水牛個(gè)體樣本。
具體實(shí)施方式
1、 基因組樣本的制備參考商品化成套試劑說(shuō)明和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 手冊(cè)；2、 根據(jù)所制備的不同樣本的DNA模板，用本發(fā)明中的特異性引物 和試劑按說(shuō)明要求進(jìn)行PCR反應(yīng)；3、 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(需PCR儀和相應(yīng)設(shè)施)，在指示劑 位置(200 bp左右)檢測(cè)到PCR條帶的樣本可判定為水牛來(lái)源。圖1所示，以水牛、黃牛和牦?；蚪M樣本同批混合檢測(cè)，用特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果獲得指示劑位置(200 bp左右)附近的 水牛特征條帶(203bp)，而黃牛和牦?；蚪M樣本未見(jiàn)特征條帶(采 用其它條件時(shí)，三種基因組樣本均出現(xiàn)較多條帶)，1,2道為水牛樣 本；3，4，5道為黃牛樣本；6，7，8道為牦牛樣本。圖2所示，對(duì)29個(gè)水牛樣本進(jìn)行超過(guò)40次PCR檢測(cè)，均檢出特征 條帶，1-13道為不同水牛個(gè)體樣本。
權(quán)利要求
1、一種水牛屬產(chǎn)品分子診斷試劑盒，包括盒體，其特征是盒體內(nèi)設(shè)有以水牛屬特異性基因位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的水牛屬特異性引物對(duì)和PCR體系。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛屬產(chǎn)品分子診斷試劑盒，其特征是 所述的水牛屬特異性引物對(duì)，即上游5'-GCGCTCCACAGAATCTCGA-3'，下 游5'-GAGTGCAGCAGGGGCCAGC-3'的部分或全部。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛屬產(chǎn)品分子診斷試劑盒，其特征是 所述的PCR體系中Mgcl2濃度為lmM, Taq酶1U/25W，退火溫度60-64°C 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水牛屬產(chǎn)品分子診斷試劑盒，包括盒體，其特征是盒體內(nèi)設(shè)有以水牛屬特異性基因位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的水牛屬特異性引物對(duì)和PCR體系。原理是通過(guò)測(cè)序和比對(duì)分析，獲得屬間物種特異性基因位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)方法解決了牛亞科內(nèi)水牛屬與其它屬間物種產(chǎn)(制)品的鑒別難題。試劑盒所采用的分子生物學(xué)試劑均為商品化產(chǎn)品，對(duì)水牛屬產(chǎn)(制)品鑒別檢出率很高，假陽(yáng)性率低，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可應(yīng)用于食品檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域和畜牧技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101215603SQ20071019237
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者冀德君, 孫辰晨, 洪 常, 常春芳, 楊章平 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)