專利名稱：：用于檢測大腸癌的新的基因組合及其基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，尤其是用于大腸癌檢測的基因及其基因芯片。
背景技術(shù)：
：大腸癌是常見惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤發(fā)病率中居第5位，且呈現(xiàn)出"發(fā)病率上升，發(fā)病年齡提前，誤診率高"三個新特點。近年來大腸癌的發(fā)病率逐年升高，巳從20世紀(jì)70年代的第六位上升到90年代的第三位，而且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢。目前用于診斷大腸癌的方法有多種CEA(癌胚抗原)作為大腸腫瘤復(fù)發(fā)的臨床監(jiān)測價值遠(yuǎn)大于早期診斷的價值，因其在其他腫瘤中也有較高的表達(dá)，缺乏特異性；大便潛血試驗(RPHA-FOBT)仍為檢測早期大腸癌的重要手段，但由于早期大腸癌無出血者占有較大的比例，仍有漏診率；國外推出的大腸癌檢測試劑盒，主要采用免疫組化技術(shù)，針對手術(shù)后病理標(biāo)本進(jìn)行檢測，其靈敏度都在30%左右。到目前為止，尚沒有一種有關(guān)大腸腫瘤的特異性免疫標(biāo)志物可供臨床上用于大腸腫瘤的早期篩檢，誤診率高達(dá)70%以上?；蛐酒?GeneChip)是將大量的寡核苷酸分子固定于固相載體上形成DNA微點陣，借助核苷酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效解讀和分析?；蛐酒鹪从?0世紀(jì)80年代，近年來得到了迅猛的發(fā)展，但主要是應(yīng)用于醫(yī)藥和研究領(lǐng)域，應(yīng)用于大腸癌的早期檢測在我國尚屬首次，這將會極大促進(jìn)大腸癌早期診斷的發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的為提供一種特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確率高的用于檢測大腸癌的新基因組合o本發(fā)明的目的之二為提供應(yīng)用該新的基因組合的用于檢測大腸癌的基因芯片。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為用于檢測大腸癌疾病的新的基因組合，該基因組合包括30個基因片段(如表1所示)，其中第30種基因片段為質(zhì)控基因。這30個基因片斷是針對大腸癌的30個指標(biāo)而設(shè)計的，利用30個基因片段共同來檢測大腸癌基因表達(dá)譜的改變，進(jìn)而對大腸癌進(jìn)行偵檢和預(yù)后監(jiān)控。這30種基因片段如下表所示:表l30種基因片段<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>一種應(yīng)用用于檢測大腸癌的新的基因組合的基因芯片，其特征為芯片包括U)用于檢測大腸癌的新的基因組中前29種基因片斷作為檢測寡核苷酸探針和第30種質(zhì)控制基因作為質(zhì)量控制寡核苷酸探針；(2)寡核苷酸探針通過手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列?？捎糜谠摶蛐酒械奶结槝?biāo)記技術(shù)有:核素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、地高辛標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、膠體鐵標(biāo)記、膠體金標(biāo)記、聯(lián)合標(biāo)記及其他可用的標(biāo)記技術(shù)。該基因芯片可用于各種類型大腸癌的檢測，尤其可用于早期大腸癌的檢測。該基因芯片可對大腸癌進(jìn)行快速偵檢并分期分型。另外，本基因芯片的檢測樣本可以為大腸癌新鮮組織，也可以為大腸癌患者的糞便。為保證芯片的質(zhì)量，應(yīng)注意以下事項1、樣品核酸的提取提取的核酸必須具有較高的純度(OD260/0D280比值應(yīng)大于1.50)和一定的量(lOng-lOOng)，以保證標(biāo)記的質(zhì)量和特異性擴(kuò)增，如果純度不夠，可能導(dǎo)致后面的雜交出現(xiàn)非特異點。2、樣品核酸的標(biāo)記摻入的標(biāo)記物必須達(dá)到一定的濃度(每個反應(yīng)摻入的標(biāo)記物為0.1-lug)，以保證雜交點的靈敏度，若濃度不夠，雜交結(jié)果常會出現(xiàn)假陰性。3、同源核酸雜交應(yīng)掌握雜交溫度控制在42'C左右，溫度過低，會出現(xiàn)非特異雜交點，使特異性降低，溫度過高，則往往出現(xiàn)假陰性。大腸癌早期診斷基因芯片和常規(guī)檢測疾病的方法向比較具有以下優(yōu)點-1、準(zhǔn)確，基因芯片設(shè)有陽性和陰性對照，可避免環(huán)境和人為因素造成的錯誤的診斷。2、快速，常規(guī)檢測需要一周的時間，而芯片只需8個小時左右。3、靈敏，芯片的靈敏性(O.lpg)可比PCR技術(shù)高1000倍。4、信息量大PCR—次只檢一種指標(biāo)，而芯片一次可檢測2030種指標(biāo)。圖1為芯片樣式設(shè)計圖圖2為芯片檢測結(jié)果圖3為基因芯片重復(fù)性檢測結(jié)果具體實施例方式實施例1應(yīng)用用于檢測大腸癌的新的基因組合的基因芯片的制備1、材料和方法1.1材料1.1.1試劑主要試劑RNA提取試劑(TrizolReagent)、飽和酚、DEPC、DNAmarker、Oligod(T)18購自上海生工。逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNaseH-)、Taq酶、AgaroseGel，M-MLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)、RNA酶抑制劑、瓊脂糖(Agarose)均購自大連寶生物公司。DNA純化試劑盒購自上海華舜生物工程公司；DIGDNA標(biāo)記試劑盒、地高辛雜交檢測試劑盒購自購自深圳依諾金生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.2臨床資料(1)大腸癌新鮮組織樣本組織標(biāo)本取自來自甘肅省腫瘤醫(yī)院和甘肅省人民醫(yī)院在2005年10月-2006年4月期間手術(shù)切除的新鮮大腸癌標(biāo)本，前均未做化療或放療，術(shù)后經(jīng)病理證實，同時距腫瘤邊緣5—10cm以上切取正常組織(術(shù)后病理證實無癌細(xì)胞侵潤)作為對照。標(biāo)本離體后5min內(nèi)即投入液氮罐內(nèi)凍存。腫瘤病理類型均為腺癌。(2)大腸癌患者糞便樣本檢測樣本為甘肅省腫瘤醫(yī)院和甘肅省人民醫(yī)院病2006年10月-2007年IO月期間大腸癌及正常人糞便樣本的150例糞便檢測樣本(其中大腸癌樣本50例)分別用潛血和芯片方法進(jìn)行對比檢測，保存于-8(TC。1.1.3儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備PCR儀購自杭州郎基；點樣器；雜交儀；掃描儀均為自行設(shè)計，委托生產(chǎn)廠家制造。2.引物設(shè)計通過genebank分別査找到大腸癌腫瘤標(biāo)志物各數(shù)條序列，然后使用DNAStar分析設(shè)計出這些引物。引物見表l。1.3基因芯片的制作1.3.1大腸癌核酸的提取(大腸癌新鮮組織樣本)(1)從液氮中取出凍存的新鮮組織200mg,在液氮預(yù)冷的研缽中研碎組織，采用Trizol法提取組織總RNA,測定總RNA純度并用01igodT纖維素層析法純化mRNA。(2)使用TaKaRa的M-MLVRtasecDNAsynthesisKit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，用于制備探針模板。1.3.2核酸探針的擴(kuò)增(1)以1.3.1所獲得的核酸為模板，使用表l所設(shè)計的引物，分別擴(kuò)增出片斷，以作為探針。(2)PCR反應(yīng)體系50.0UL，包括lOXBuffer5.0uL，25mmo1dNTPmixtureO.5,TaqDNA酶1.0iiL,目的引物上下游各l.OuL，cDNA模板1.0yL，三蒸水38.5yL，反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min;94'C預(yù)變性30s,55'C退火30s,72°C延伸60s,30個循環(huán)；72°C10min后終止反應(yīng)。(3)利用小片段DNA純化試劑盒對獲得的30種基因片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。1.3.3點膜通過微量點樣器將所獲得的探針點在預(yù)處理的尼龍膜上。根據(jù)圖l所示芯片樣式設(shè)計圖，用手動點樣儀進(jìn)行芯片點樣。操作程序(l)GAPDH，ACTIN，CYCLINDl等30種基因的點樣液在10(TC變性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。(2)尼龍膜(購自Amersco公司，帶正電荷)用滅菌雙蒸水浸泡10min，懸空晾干。(3)每點llU把上述探針片段點在尼龍膜上(每張尼龍膜面積大約20cm2)(4)濕膜在紫外燈下照5min，取出讓膜自然干燥。1.4樣品的處理1.4.1核酸的提取(大腸癌患者糞便樣本)(1)大腸癌新鮮組織樣本方法同1.3.1，使用引物5'-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3，和5'-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT加n—n-3'反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。(2)采用Trizol法提取大腸癌患者糞便樣本總RNA，使用引物5'-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3，和5'—AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT(地n-'n-3'反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。1.4.2核酸的擴(kuò)增(1)以1.4.1所獲得的核酸為模板，使用設(shè)計的通用引物5'-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3擴(kuò)增出基因片段，以作為檢測樣品。(2)PCR反應(yīng)體系25.0nL,包括10XBuffer2.5uL，10,1dNTPmixture0.5ul,地高辛-ll-dUTP0.5ul，TaqDNA酶0.5uL,通用引物上下游各0.5uL,cDNA模板5.0uL，三蒸水12.5uL，反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min;94。C預(yù)變性30s，65。C退火30s,68。C延伸500s,30個循環(huán)；72°C10min后終止反應(yīng)。1.5雜交加500ul預(yù)雜交液于基因芯片上，42。C處理40min。取20ul1.4.2的產(chǎn)物于1.5ml的離心管內(nèi)，IO(TC變性lOmin.-2CTC冷卻5min，加雜交液450ul，混勻，于基因芯片上，42。C雜交lh。分別用2XSSC，.1XSDS和0.1XSSC，0.1XSDS各洗三次，加400ul3%BSA，42。C封閉30min，450ul緩沖液中加1.6ulAV-AP,42。C酶聯(lián)20min，先用洗滌液洗膜三次，后加入顯色液(450ul底物液+1.6ulBCIP+l.6ulNBT),常溫或42。C顯色3~5min。用蒸餾水或自來水沖洗，終止顯色。1.6雜交結(jié)果的分析將雜交完畢晾干的DNA陣列用自制的芯片掃描儀進(jìn)行掃描分析，根據(jù)大量樣品的分析，設(shè)置讀數(shù)0.05以下為陰性，0.l以上為陽性，兩者之間為可疑。打印斷報告。樣品同時進(jìn)行PCR或RT-PCR和其他檢測方法進(jìn)行比較。陽性和陰性對照分為人的GAPDH，ACTIN,CYCLIND1基因片段，加入反應(yīng)系統(tǒng)，以監(jiān)視標(biāo)記和雜交、顯色系統(tǒng)是否有效。2結(jié)果2.1準(zhǔn)確率檢測的結(jié)果我們針對性的對分別GAPDH，ACTIN，CYCLIND1等30種基因進(jìn)行了檢測，雜交結(jié)果30張芯片分別出現(xiàn)GAPDH,ACTIN，CYCLIND1等30種基因特異性雜交點，檢測結(jié)果皆為陽性，沒有非特異性雜交點的出現(xiàn)。同時陽性對照明顯,讀數(shù)大于0.3，陰性對照則小于0.05。(如圖2)2.2重復(fù)性檢測結(jié)果同時各取1個樣本進(jìn)行3次重復(fù)性檢測。結(jié)果如圖3。2Z3檢出率的檢測結(jié)果利用我們研制的大腸癌基因診斷芯片對50例患者的糞便脫落細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)48例檢測為陽性，l例為弱陽性，l例為陰性；其特異性達(dá)95%、敏感性達(dá)95%、臨床符合率(準(zhǔn)確率)達(dá)95%，基本上達(dá)到設(shè)計要求。2.4消化道腫瘤樣本的檢測ll例消化道腫瘤患者糞便檢測結(jié)果(見表2)。表211例消化道腫瘤患者糞便檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>正常人群48例，其中隱血陽性正常人群2例(見表3)權(quán)利要求1、用于檢測大腸癌的新的基因組合，其特征為包括30個基因片段，其中的30種基因片段分別為(1)以VIP5’-CTCCTTGTGCTCCTGAC-3’和5’-CTGCTCCTCTTTCCATTC-3’為引物合成的長度為200bp的基因片段1；(2)以C25’-TGCTCCTGGACTGTTCG-3’和5’-GCTTCACTCCTGTGGGT-3’為引物合成的長度為395bp的基因片段2；(3)以Survivin5’-AGGTGCCTGTTGAATCTG-3’和5’-GACGCTTCCTATCACTCTATT-3’為引物合成的長度為318bp的基因片段3；(4)以IL-25’-AAGACCCAGGGACTT-3’和5’-GGTTGCTGTCTCATCA-3’為引物合成的長度為280bp的基因片段4；(5)以Granulysin5’-CTGCGTGATGAGGAGAAA-3’和5’-GGGTCGCAGCATT-3’為引物合成的長度為400bp的基因片段5；(6)以FAK5’-TCCACCAAAGAAACCG-3’和5’-TCTGTGCCATCTCAATCT-3’為引物合成的長度為500bp的基因片段6；(7)以IL-15’-CGCCTGACAGAAACCA-3’和5’-GCGAATGACAGAGGGT-3’為引物合成的長度為300bp的基因片段7；(8)以IL-85’-CAGCCTTCCTGATTTC-3’和5’-AACCCTCTGCACCCA-3’為引物合成的長度為300bp的基因片段8；(9)以Cox-15’-ATCCAGAAACAGTGGCTCG-3’和5’-CAACCAATGGCGTG-3’為引物合成的長度為248bp的基因片段9；(10)以C-myc5’-ACGCCGCTCGGAAGGAAT-3’和5’-TCCACCGTGACCACATCG-3’為引物合成的長度為300bp的基因片段10；(11)以VEGF5’-CCCACCCACATACATACA-3’和5’-CCTCCCAACTCAAGTCC-3’為引物合成的長度為230bp的基因片段11；(12)以Stufen5’-GCTGCGAAACACGATGCT-3’和5’-CTGGGCCAGTCGGCTAAT-3’為引物合成的長度為300bp的基因片段12；(13)以C10orf465’-TTTGGCTCCGCTTTCTCG-3’和5’-CTCCCAGTTGTTGTGGTTCT-3’為引物合成的長度為550bp的基因片段13；(14)以Ki-675’-TTGCCTCCTAATACGC-3’和5’-CTTCCGAAGCACCACT-3’為引物合成的長度為280bp的基因片段14；(15)以Granulysin5’-CTGCGTGATGAGGAGAAA-3’和5’-GGGTCGCAGCATT-3’為引物合成的長度為320bp的基因片段15；(16)以TOP2B5’-GACAATGCCCTCACC-3’和5’-CCAGGCTCCTTCTTC-3’為引物合成的長度為500bp的基因片段16；(17)以MTHFR5’-ACCGCCGTGAACTACTGT-3’和5’-GCCTCCCTCCTCCTCTT-3’為引物合成的長度為350bp的基因片段17；(18)以PCNA5’-CAAGGACCTCATCAACG-3’和5’-GACTTTCTCCTGGTTTGG-3’為引物合成的長度為400bp的基因片段18；(19)以P155’-TGGACCTGGTGGCTACGAAT-3’和5’-GCCGCTAGGGCCTAAGTTGT-3’為引物合成的長度為200bp的基因片段19；(20)以IGF-15’-TGAAGAACGCAAGTAGAGG-3’和5’-AAAGGTTATGAAGGGAGG-3’為引物合成的長度為400bp的基因片段20；(21)以HIF-1α5’-CCAGCAACTTGAGGAA-3’和5’-GGTGGGTAATGGAGACA-3’為引物合成的長度為300bp的基因片段21；(22)以FAK5’-TCCACCAAAGAAACCG-3’和5’-TCTGTGCCATCTCAATCT-3’為引物合成的長度為600bp的基因片段22；(23)以CD445’-CTCCTCCCTGTCTACCCT-3’和5’-GACCTCCCTTATTTCTATC-3’為引物合成的長度為211bp的基因片段23；(24)以CyclinD25’-ACAGAAGTGCGAAGAAGAGG-3’和5’-TGGAGTTGTCGGTGTAAATG-3’為引物合成的長度為200bp的基因片段24；(25)以IGF-15’-TGAAGAACGCAAGTAGAGG-3’和5’-AAAGGTTATGAAGGGAGG-3’為引物合成的長度為500bp的基因片段25；(26)以uPA5’-GGAACCCAGACAACCG-3’和5’-TGTAGATGGCCGCAAA-3’為引物合成的長度為400bp的基因片段26；(27)以FAP5’-GAGTTGCCACCTCTGC-3’和5’-AGGCGACCAGCATAA-3’為引物合成的長度為200bp的基因片段27；(28)以DKFZp586G15175’-CACCGCTGCCAATAACT-3’和5’-CAAAGCACCTGTCACCC-3’為引物合成的長度為300bp的基因片段28；(29)P275’-GACCCTCCCAAACCAA-3’和5’-AGCGTCAAGGCTTCAGT-3’為引物合成的長度為600bp的基因片段29；(30)cyclinD1，Actin和GAPDH為基因片段30；其中基因片段30為質(zhì)控基因。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測大腸癌的新的基因組合，其特征為可應(yīng)用于生物芯片技術(shù)。3、一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的用于檢測大腸癌的新的基因組合的基因芯片，其特征為-芯片包括(1)用于檢測大腸癌的新的基因組合中前29種基因片段作為檢測寡核苷酸探針和第30種質(zhì)控制基因作為質(zhì)量控制寡核苷酸探針；(2)寡核苷酸探針通過手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片可用于檢測各種類型大腸癌。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片可用于檢測早期大腸癌。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征為檢測樣本可以為大腸癌新鮮組織，也可以為大腸癌患者的糞便。全文摘要本發(fā)明為用于檢測大腸癌的新的基因組合，該基因組合包括30個基因片段，其中第30種基因片段為質(zhì)控基因。本發(fā)明還提供了應(yīng)用該新的基因組的基因芯片。由于現(xiàn)有技術(shù)中對于大腸癌的檢測只是針對其中一個或幾個指標(biāo)檢測，特異性差、靈敏度低、準(zhǔn)確率低。本發(fā)明針對大腸癌的30個指標(biāo)設(shè)計了30個基因片段，這30個基因片段共同用來檢測大腸癌，并且應(yīng)用基因芯片技術(shù)，提供了一種特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確率高的檢測大腸癌的基因芯片。文檔編號C12Q1/68GK101624616SQ20071019579公開日2010年1月13日申請日期2007年12月17日優(yōu)先權(quán)日2007年12月17日發(fā)明者徐進(jìn)章,琳李,車團(tuán)結(jié),陳小蘭申請人:蘭州百源基因技術(shù)有限公司