專利名稱：：粘膜發(fā)酵菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動(dòng)物用生物制品及其制備方法，特別是指一種動(dòng)物用的粘膜發(fā)酵菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：在傳統(tǒng)的畜禽生產(chǎn)過(guò)程中，需要大量地使用抗生素來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和防病治病。作為^^防性用藥，飼津+廠或養(yǎng)殖戶一4^l安1%~2%的比例將抗生素添加到飼料中。其作用主要有削弱胃腸內(nèi)有害微生物；抑制、殺死致病菌，增強(qiáng)抗病能力；同時(shí)，使動(dòng)物腸壁變薄，有利于養(yǎng)分的滲透和吸收，提高飼料利用率；增進(jìn)食欲，同時(shí)刺激動(dòng)物腦下垂體分泌激素，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，從而加快增重速率。大量研究i正明，這種傳統(tǒng)的飼養(yǎng)方法導(dǎo)致了嚴(yán)重的藥物殘留的危害。目前，在動(dòng)物飼料中普遍加入頭孢、土霉素、四環(huán)素類藥物，實(shí)際上等于持續(xù)低劑量用藥，有利于致病微生物的獲得性抵抗力或"先天性4氐抗力"的產(chǎn)生，成為抗藥菌抹。長(zhǎng)期食用有抗生素殘留的畜禽產(chǎn)品，可造成人體中一些非致病菌的死亡，使菌群平衡失調(diào)或引起核黃素缺乏癥和紫癜性損傷，從而對(duì)人類的生命健康產(chǎn)生威脅。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)屢屢發(fā)生大規(guī)模的食品安全事件，如瘋牛病、豬口^帝疫、禽流感、以及在多國(guó)流行的具有多重抗藥性的傷寒沙門氏菌病等。這一系列突發(fā)事件涉及的國(guó)家范圍，危及健康的人群，以及給相關(guān)食品國(guó)際間貿(mào)易帶來(lái)的危機(jī)使食品安全問(wèn)題受到了歷史上空前的關(guān)注。時(shí)常攝入含有抗生素的食品，可使某些菌株產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌林又能將耐藥因子傳遞給其他敏感細(xì)胞，使其他異種菌林變成耐藥菌抹，從而帶來(lái)預(yù)防與治療某些人畜疾病的困難，如，人感禽流感和人類非典型性肺炎等。另一方面，目前世界各國(guó)人類食源性疾病的發(fā)生均呈上升趨勢(shì)。其主要分為兩類，一類是由食品中的生物或化學(xué)因素引起的食物中毒，另一類是由于食品中的生物因素引起的感染性腹瀉。發(fā)達(dá)國(guó)家每年約有30%的人深受其害。而在發(fā)展中國(guó)家，該問(wèn)題更加普遍。食源性疾病按其病原分類，主要分為孩支生物性(細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲)，化學(xué)性和有毒動(dòng)植物性。無(wú)論是國(guó)際或國(guó)內(nèi)的資料都表明，食品中微生物的污染所引起的急性食物中毒是食品安全中最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)食用畜禽肉、禽蛋類產(chǎn)品較多，以沙門氏菌導(dǎo)致的食物中毒最多。近年來(lái)，國(guó)際報(bào)道并關(guān)注較多的病原菌主要有出血性大腸桿菌0157:H7，單增李斯特氏菌，多重耐藥性沙門氏菌，空腸彎曲菌。已報(bào)道的食源性疾病致病因子有250種之多，其中腸道致病菌(約IO種)是食源性疾病中最常見(jiàn)的生物致病因素，感染后可引起細(xì)菌性食物中毒和多種感染性腹瀉。沙門氏菌(禽、畜肉)是我國(guó)生物性食物中毒事件中最常見(jiàn)的重要致病菌之一。防范人類食源性疾病要從農(nóng)產(chǎn)品的源頭估文起，對(duì)于消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，健康的生活方式和良好的飲食習(xí)慣也很重要。針對(duì)上述問(wèn)題，目前我國(guó)正在全面致力于實(shí)施"無(wú)公害食品行動(dòng)計(jì)劃，，，加大農(nóng)產(chǎn)品源頭污染的治理力度，推進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)區(qū)的建設(shè)，開展多種形式的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管。努力構(gòu)建從農(nóng)田到餐桌的食品安全法律法規(guī)體系。深入開展禽畜產(chǎn)品違禁藥物濫用、藥物殘留專項(xiàng)整治，基本解決"餐桌污染"問(wèn)題。因此，如何在畜禽生產(chǎn)過(guò)程中在減少抗生素^f吏用的同時(shí)，又減少人類食原性疾病的發(fā)生率，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)亟待解決的重要研究課題之一。近年來(lái)，粘膜性竟?fàn)幮耘懦鈩?duì)病原菌的抑制作用在很多公開的文獻(xiàn)中者卩有描述。例如，美國(guó)專利第5，451，400號(hào)所^>開的一種用于保護(hù)家禽免受沙門氏菌和空腸彎曲菌感染的竟?fàn)幮耘懦鈩┑姆椒?，其具有抑制沙門氏菌和空腸彎曲菌在家禽腸道內(nèi)的增值作用。運(yùn)用這種粘膜性竟?fàn)幮耘懦鈩﹣?lái)降低禽肉、蛋產(chǎn)品中人類食源性疾病致病菌的污染，已成為一種有^t的解決方案。^f旦是因?yàn)樵摲椒?f又才尋的4乃,然是不石角定的動(dòng)凈為灃占月莫纟且合4勿(undefinedanimalmucosalmixture),無(wú)法明確分離功能菌和雜菌，因:t匕無(wú)法明確主要菌群的組成以及其比例，產(chǎn)品的穩(wěn)定性較差，會(huì)明顯導(dǎo)致小動(dòng)物腸道的應(yīng)激反應(yīng)，比如腹瀉等現(xiàn)象。由于目前該技術(shù)運(yùn)用領(lǐng)域內(nèi)尚存在若干需要解決的問(wèn)題，例如，產(chǎn)品抗菌作用的穩(wěn)定性，產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性，以及保證產(chǎn)品的發(fā)揮最佳抗菌作用所對(duì)應(yīng)的、具體的產(chǎn)品使用方法等，因此，需要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題開發(fā)一種抗菌作用穩(wěn)定性高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性高，不會(huì)導(dǎo)致小動(dòng)物腸道應(yīng)激反應(yīng)的，能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的，能保證畜禽產(chǎn)品的食品安全的新產(chǎn)品及其生產(chǎn)工藝。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有穩(wěn)定的抗菌作用和產(chǎn)品性能的動(dòng)物用生物制劑,具體來(lái)講即一種粘膜發(fā)酵菌劑，可替代常規(guī)用于畜禽的飼養(yǎng)和保Y建的抗生素，既改善畜禽的整體健康，又降低畜禽產(chǎn)品上的人類食源性疾病的發(fā)生率，并減少藥物殘留的對(duì)人類的危害，以保障消費(fèi)者的食品安全。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所^是供的粘膜發(fā)酵菌劑，包括基料、輔料和菌種，其特征在于所述基料包含預(yù)先還原的厭氧細(xì)菌培養(yǎng)基、葡萄糖、氮化物、以及還原劑；所述菌種為選自于乳酸桿菌、乳酸片球菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、雙歧桿菌中的一種或者其多種的組合，其中的乳酸桿菌還可以包含選自于才直物乳桿菌(丄ac/o6(3c/〃w51//aw似rww)、戊^f唐孝L斗干菌(jL""o6"c/〃ws/e"^wws)、彎曲享'L牙干菌(丄acto6ac/〃wscwrv^us")、嗜酉吏享1^干菌(Z^cfo6ac77/wsacz't/o//z7i^)、干酸孝L才干菌(Z^"o6acz'〃wsccwez')中的一種或者其多種的組合。本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑的優(yōu)點(diǎn)在于，基于其所包含的正常菌種在腸道中的優(yōu)先占位和底物竟?fàn)幍脑?，起到了排斥其他病原菌的定才直的效果，并通過(guò)細(xì)菌間的相互作用產(chǎn)生了相應(yīng)的抑菌性，更為有利的是，本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑還分離去除了部分影響其抗菌作用穩(wěn)定性的雜菌，從而保證了抗菌作用及產(chǎn)品性能的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述粘膜發(fā)酵菌劑的輔料中還包括用于防止病原菌交叉感染的抑制劑，所述抑制劑優(yōu)選的是天然細(xì)菌素(bacteriocin)，通過(guò)天然細(xì)菌素的抑菌作用對(duì)菌群的平衡起到均衡作用，從而穩(wěn)定產(chǎn)品的性能以及抗菌作用。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述粘膜發(fā)酵菌劑還包括揮發(fā)性脂肪酸，其選自于丁酸、乙酸、丙酸、異戊酸、異丁酸、戊酸、和異己酸中的一種或者其多種的組合。有利的是，所述揮發(fā)性脂肪酸可以改變腸道內(nèi)環(huán)境的酸石A/變，以達(dá)到抑制細(xì)菌定才直的作用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種制備所述粘膜發(fā)酵菌劑的方法，包含如下步驟步驟一，從無(wú)特定性病原菌感染的動(dòng)物體內(nèi)取出一部分腸道，并進(jìn)4亍清洗去除腸道內(nèi)容物；步驟二，在厭氧環(huán)境中，從清洗過(guò)的腸道上切取一段腸粘膜；步驟三，將所取得的腸粘膜置于預(yù)先還原的厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行初級(jí)培養(yǎng)；其特征在于步驟四，將步驟三獲得的培養(yǎng)物置于一系列厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行多級(jí)次培養(yǎng)以分離雜菌和獲得菌種。其中所述多級(jí)次培養(yǎng)步驟可包括將步驟三培養(yǎng)的混合物置于馬血漿培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以分離雜菌；將步驟三培養(yǎng)的混合物置于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以分離出乳酸菌、乳酸片球菌；以及將步-豫三培養(yǎng)的混合物順序置于SBA培養(yǎng)基、血瓊脂和bileesculin瓊脂等進(jìn)4亍多級(jí)次培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑的制備方法，有利地對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行了多級(jí)培養(yǎng)，通過(guò)在一系列不同的次級(jí)培養(yǎng)基中進(jìn)行次培養(yǎng)分別分離掉了雜菌、獲耳又了所需的有用菌種，從而防止了病源菌交叉感染，使菌種的比例更為平衡和穩(wěn)定，抗菌作用得以提高。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種粘膜發(fā)酵菌劑，用于在畜禽飼養(yǎng)過(guò)程中代替抗生素的使用，其成分主要包括基料、輔料和用于抑制病原菌的正常菌種。其中所述基料主要包含預(yù)先還原的厭氧細(xì)菌培養(yǎng)基、葡萄糖、氮化物以及還原劑等，該培養(yǎng)基可以是預(yù)先還原的心腦浸液的提取物，該提取液可以在市場(chǎng)上購(gòu)得。根據(jù)本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑，所述菌種選自于乳酸桿菌、乳酸片球菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳S臾腸球菌、戊糖片3求菌中的一種或者其組合。8其中所述乳酸4干菌還可以包含選自于才直物乳桿菌(Zac纟o&c/77i^p7a"fari//77)、戊并唐孝L才干菌(^acfo6ac//7us1pe/3fosi/s)、彎曲享L4干菌(^acto6ac/7/i;51cwrratiAS")、口耆酸吝'L^干菌(丄acto6ac/7/i/51a"do;/z/7"s1)、干酪乳^干菌(Za"o6ac/7/t/scase/)中的一個(gè)或者其組合。才艮據(jù)本發(fā)明粘膜發(fā)酵菌劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，其中至少包含六種以上所述菌種的組合。根據(jù)本發(fā)明粘膜發(fā)酵菌劑的又一個(gè)實(shí)施例，該輔料中還可以加入其他添加劑，例如用于調(diào)節(jié)菌群比例穩(wěn)、定性的添力口劑，以及防止病原菌交叉感染的抑制劑等。所述抑制劑包括，^旦不〗義限于，天然細(xì)菌素(bacteriocin)，如尼生素(nisin)、小球菌素(pediocin)等經(jīng)-i正明可應(yīng)用于食品的細(xì)菌素。最新研究表明，細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，雖然細(xì)菌素是4氐抗i者如單核細(xì)月包增生李斯特氏菌(丄.mow20cytoge"es)等病原菌的抑菌劑，它們并不同于青霉素等抗生素；傳統(tǒng)的多肽抗生素是由細(xì)胞多酶復(fù)合體催化形成的，不存在結(jié)構(gòu)基因，而細(xì)菌素由基因編碼，可以通過(guò)基因工程的手加以改造。它們的合成及作用才莫式與臨床^f吏用的抗生素不同。而且只于抗生素顯示纟元性的樣i生物通常不對(duì)細(xì)菌素顯示交叉抗性，且與抗生素的抗性不一才羊，細(xì)菌素抗性通常不是由遺傳決定的。經(jīng)i正明天然細(xì)菌素具有特定的抗菌活性，本發(fā)明利用其特定的抗菌作用，在制備過(guò)程中調(diào)節(jié)主要細(xì)菌組成成分的平衡。與此同時(shí)，本發(fā)明還利用了天然細(xì)菌素的抗菌活性，有效的抑制了特定病原菌的污染，如單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。優(yōu)選的是，本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑中還包括揮發(fā)性脂肪酸，該揮發(fā)性脂肪酸由丁酸、乙酸、丙酸、異戊S吏、異丁酸、戊酸、異己酸中的一個(gè)或者其組合組成。揮發(fā)性脂肪酸在本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑中所起到的作用在于改變腸道內(nèi)環(huán)境的酸堿度，以達(dá)到抑制細(xì)菌定才直的作用。另外，本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑中還包括其他輔料，舉例來(lái)說(shuō)，所述輔#+中可以加入適當(dāng)?shù)母纳颇c道功能的if唐類，如寡并唐(oligosaccharides);又3口還可以加入適當(dāng)用于防止菌劑在速凍過(guò)禾呈中被破壞的冷凍保護(hù)劑等。試一險(xiǎn)證明，將本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑運(yùn)用于畜禽飼養(yǎng)中，對(duì)畜禽的細(xì)菌性腸道和呼吸道病原菌的定才直和增長(zhǎng)具有抑制作用，改善了畜禽的整體健康，改善了畜禽的生產(chǎn)指標(biāo)，降低了畜禽的生產(chǎn)成本，促進(jìn)了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，同時(shí)，降低畜禽產(chǎn)品上的人類食源性疾病的發(fā)生率，減少藥物殘留的對(duì)人類的危害，保障了消費(fèi)者的食品安全。其基本的作用機(jī)制是利用細(xì)菌間的占位和底物竟?fàn)幍脑韥?lái)排斥病原菌的定植，并且通過(guò)增加腸道內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸的含量，從而降低內(nèi)環(huán)境的酸減度，以及通過(guò)細(xì)菌間的相互作用產(chǎn)生相應(yīng)的抑菌性。下面通過(guò)本發(fā)明的一些實(shí)驗(yàn)實(shí)例來(lái)說(shuō)明其產(chǎn)品性能、抗菌作用及其穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)實(shí)例一方法一曰齡的雛雞從商品孵化廠運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，放在27立方英尺帶金屬絲底的隔離雞籠中，地面平養(yǎng)，正壓通風(fēng)并過(guò)濾空氣。用來(lái)運(yùn)雞的紙墊都進(jìn)^f于了細(xì)菌培養(yǎng)，以—驗(yàn)i正沒(méi)有攜帶來(lái)源于孵化廠的沙門氏菌。每個(gè)雞籠力欠8-12只雛雞，自由采食々欠水，室溫維持在攝氏35度，5天的i式馬全期內(nèi)持續(xù)光照。鼠傷寒沙門氏菌(&0^力//7",2'"邁)，蒙;f尋維的亞沙門氏菌(義/Ho/^ewVeo)和加里福尼壓沙門氏菌(cah'/ori^'a)的耐萘咬酸菌林經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)，然后耳又同量的培養(yǎng)物混合，供攻毒〗吏用。這些菌抹都是在家禽上已知的可定植菌。試-驗(yàn)分四個(gè)組，三個(gè)處理組和一個(gè)正對(duì)照組；每試-瞼組有三個(gè)重復(fù)小組，每個(gè)小組有12只雞。每組雞隔離飼養(yǎng)。三個(gè)處理組包4舌1)用全自動(dòng)噴霧箱對(duì)雞進(jìn)行均勻噴霧；2)直接強(qiáng)飼到雞的嗉嚢中；3)兩者結(jié)合使用。小雞到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，在一個(gè)小時(shí)內(nèi)用粘膜發(fā)酵菌劑處理。再過(guò)4個(gè)小時(shí)，就用沙門氏菌對(duì)每只雞進(jìn)行攻毒。第五天把試驗(yàn)雞的盲腸被無(wú)菌摘取，把盲腸及其內(nèi)容物溶解在緩沖溶液中。將樣品稀釋后，涂布在含萘啶酸的BGSulfa瓊脂(BGSN)表面，在攝氏37度培養(yǎng)20小時(shí)，計(jì)算菌落數(shù)。使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型和最小二乘法來(lái)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，處理內(nèi)的誤差作為隨機(jī)誤差，顯著性為P<0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果粘膜發(fā)酵菌劑對(duì)于小雞的沙門氏菌定植頻率和保護(hù)系數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注解"肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)1沙門氏菌陽(yáng)性樣品/總的檢測(cè)樣品數(shù)量2保護(hù)系數(shù)=將對(duì)照小雞的IFM皇除以每個(gè)處理的IF值"F-—個(gè)處理中所有雞的每克盲腸內(nèi)容物中的沙門氏菌數(shù)量的幾何平均數(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)例二方法一日齡的小公雞從商品孵化廠運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，地面平養(yǎng)，正壓通風(fēng)，過(guò)濾空氣。用來(lái)運(yùn)送雞只的紙墊都進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)，以驗(yàn)證沒(méi)有攜帶來(lái)源于孵化廠的沙門氏菌。鼠傷寒沙門氏菌(&^p/n'mwrz'ww)，蒙4尋纟焦6勺亞妙、門氏菌(S.mo"tevzYfeo)和力口里3畐尼壓沙門氏菌(5*.ca/z/om/a)的耐萘啶酸菌株經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)的次培養(yǎng)菌作為攻毒菌抹。飼料由喬治亞大學(xué)家禽科學(xué)系配制并提供的。本試驗(yàn)使用的是標(biāo)準(zhǔn)的肉雞開食料(石皮碎料)和中雛料(顆粒料)，分別在孵化后的前三周和接下來(lái)的三周使用，自由釆食。每個(gè)雞籠大小為2.1米x2.4米，安裝無(wú)縫鋼4反壁和門。試-驗(yàn)開始前，飼養(yǎng)籠全面消毒，并在不4秀鋼地面上鋪上大約IO厘米厚的松木屑。舍溫由正壓過(guò)濾的循環(huán)空氣來(lái)調(diào)控。日光燈持續(xù)照明，直到試-驗(yàn)結(jié)束。隨機(jī)選擇108只小雞，在到達(dá)后一小時(shí)內(nèi)用粘膜發(fā)酵菌劑處理。處理方法是采用噴霧和在第一次々大水中添加的方法。噴霧時(shí)，平均劑量為0.5毫升/只。處理組和對(duì)照組的小雞分開運(yùn)送。一個(gè)處理組占兩個(gè)雞籠，每籠54只。用自來(lái)水將粘膜發(fā)酵菌劑稀釋后裝在一個(gè)消過(guò)毒的塑料壺中，；故在處理組雞籠的地上，六個(gè)小時(shí)后取走。以后就通過(guò)乳頭々欠水器自由々夂用自來(lái)水。兩個(gè)獨(dú)立的雞籠分別用來(lái)隔離和飼養(yǎng)24只接種雞和12只未接種的雞。接種雞是在一日齡時(shí)用沙門氏菌進(jìn)行攻毒的。攻毒24小時(shí)后，粘膜發(fā)酵菌劑處理組和正對(duì)照組的每個(gè)雞籠中都方欠入6只接種過(guò)的雞。所以，每籠中就有同日齡的雞60只。每個(gè)負(fù)對(duì)照組的雞籠中則》文入6只未4妄種過(guò)的雞。為了加以區(qū)別，這些雞都作了顏色標(biāo)記。攻毒4天后，用棉拭在泄殖腔取樣分析，以確定所有的接種過(guò)的雞都定植了沙門氏菌。通過(guò)在第7天和第42天的糞樣分析來(lái)確定各組是否定植了沙門氏菌。42天時(shí)，對(duì)每籠雞逐個(gè)稱重，并按籠結(jié)料，計(jì)算每組的平均體重和平均飼料效率。飼料效率等于每籠雞的總體重與總耗料量的比值。分別在第7天和第42天時(shí)，隨才幾在每個(gè)雞籠的地面上耳又10個(gè)糞才羊，用含萘啶酸的BGSulfa瓊脂選擇性分離三種耐萘啶酸的沙門氏菌，并計(jì)算其數(shù)量。使用一般線性模型進(jìn)行變量分析，試驗(yàn)使用完全隨機(jī)的分組設(shè)計(jì)，用以檢驗(yàn)粘膜發(fā)酵菌劑對(duì)體重和飼料轉(zhuǎn)化率的主要作用。處理內(nèi)的i吳差作為隨才;U吳差，顯著'f生為P<0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第7天和第42天各組的沙門氏菌定才直水平(logl。)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注解ab肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P〈0.05)第42天各組雞的平均體重和飼料效率(體重/一€^"量)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注解*MCE處理組=用MCE處理過(guò)的處理正3于照組=只用沙門氏菌-丈毒過(guò)的處理負(fù)只十照組-;殳有經(jīng)過(guò)以上兩種處理的處理**標(biāo)準(zhǔn)差ab肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)實(shí)驗(yàn)實(shí)例三方法入雛凄t量34800只，分六棟祠養(yǎng)。粘力莫發(fā)酵菌劑使用方法在入雛前三天投服常規(guī)抗生素；停藥后12個(gè)小時(shí)內(nèi)，飲水使用粘膜發(fā)酵菌劑。防疫程序1曰齡..ND+AI-K頸皮下注射；ND+IB-L噴霧；9曰齡ND+IB-L飲7jc;15曰齡IBD-L飲水；20曰齡ND+IB飲水。用藥考呈序1日齡頭孑包注射；1-3曰齡普桿仙；10-12日齡增歲支對(duì)每里米先；22-24日齡'隻呼快好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果交雞成績(jī)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本次飼養(yǎng)過(guò)禾呈中沒(méi)有發(fā)生過(guò)4壬4可腸道疾病，也沒(méi)有4吏用任何防治腸道疾病的藥物。因此，粘力莫發(fā)酵菌劑的^f吏用只于預(yù)防腸道疾病的發(fā)生起到了明顯的效果，增強(qiáng)了雞群體質(zhì)，4是高了雞群的抗病能力，減少了抗生素及其他藥物的使用，減輕了工作人員的工作強(qiáng)度。通過(guò)減少藥物4吏用，降低了該場(chǎng)的生產(chǎn)成本。下面介紹本發(fā)明的粘膜發(fā)酵菌劑產(chǎn)品的具體制備方法。根據(jù)本發(fā)明，該粘膜發(fā)酵菌劑的制備方法包括以下步驟步驟一以無(wú)菌的方法，從無(wú)特定性病原菌感染的雄性動(dòng)物體內(nèi)取出一l殳小腸，并用生理鹽水徹底清洗去除腸道內(nèi)容物；步驟二在厭氧環(huán)境中，用特制粘膜刮取器從清洗過(guò)的腸道上刮取一段的粘膜層組織；步驟三將所取得的腸粘膜置于一種特定的厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行初級(jí)培養(yǎng)，該特定的厭氧培養(yǎng)基為預(yù)先還原的心腦浸液的提取物。步驟四將步驟三培養(yǎng)的混合物置于一系列相應(yīng)的厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行次級(jí)培養(yǎng)、進(jìn)行雜菌分離并獲取所需菌種；步驟五將步驟四所獲得的培養(yǎng)物在厭氧環(huán)境中，在攝氏30到40度下培養(yǎng)6至12個(gè)小時(shí)，優(yōu)先的是在^[氏38度下培養(yǎng)8小時(shí)左右；步驟六在步-驟五荻得的培養(yǎng)物中添加適量的輔并+和其它添加劑；步驟七將步驟六獲得的產(chǎn)物在厭氧環(huán)境里進(jìn)行速凍、保存。在上述生產(chǎn)工藝過(guò)程中，無(wú)特定性病原菌感染的雄性動(dòng)物是指三代內(nèi)沒(méi)有感染過(guò)特定性病原菌(如，沙門氏菌、空?qǐng)鰪澢?、產(chǎn)氣梭菌、溶血性大腸桿菌等)的成年雄性動(dòng)物，比如公雞。可選擇的是，在步驟四中，可將步驟三培養(yǎng)的混合物置于馬血漿培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以分離雜菌，還可以將步驟三培養(yǎng)的混合物置于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以分離乳酸菌、乳酸片3求菌，以及還可以將步驟三培養(yǎng)的混合物順序置于SBA培養(yǎng)基、血瓊脂和bileesculin瓊脂中培養(yǎng)以分離糞鏈球菌。有利的是，通過(guò)這一系列次級(jí)培養(yǎng)，可以在分離所需菌種的同時(shí)有效地去除培養(yǎng)物中的病原性或非病原性-徵生物及有害物質(zhì)，從而4呆證產(chǎn)品的抗菌作用和產(chǎn)品性能的穩(wěn)定性。在進(jìn)4于步驟五之前，每次培養(yǎng)均需要對(duì)培養(yǎng)物先進(jìn)行化驗(yàn)，以防出現(xiàn)沙門氏菌，空腸彎曲菌等病原菌?？梢允褂矛F(xiàn)有的所有有效的微生物學(xué)方法來(lái)進(jìn)行，比如，系列特定培養(yǎng)基的稀釋法等。在步驟六中，添加適量的輔料包括寡糖類和有才幾酸等，有利于減少小動(dòng)物腸道的應(yīng);敫反應(yīng)，-床護(hù)小動(dòng)物腸道的正常功能。所添加劑還可以包括防腐劑和抗凍劑等，防腐劑可有利于防止生產(chǎn)過(guò)程中的雜菌污染，防凍劑可以防止在產(chǎn)品冷凍{呆存過(guò)#呈中石皮^b菌種的活性。特別是，還可以包括特殊的天然添加劑，天然細(xì)菌素，有利于穩(wěn)、定和平4軒產(chǎn)品的細(xì)菌比例。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同更換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種粘膜發(fā)酵菌劑，包括基料、輔料和菌種，其特征在于所述基料包含預(yù)先還原的厭氧細(xì)菌培養(yǎng)基、葡萄糖、氮化物和還原劑；以及所述菌種為選自于乳酸桿菌、乳酸片球菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、雙歧桿菌中的一種或者其多種的組合，其中的乳酸桿菌還可以包含選自于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)中的一種或者其多種的組合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘膜發(fā)酵菌劑，其特征在于所述粘膜發(fā)酵菌劑的輔并+包括用于防止病原菌交叉感染的抑制劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的粘膜發(fā)酵菌劑，其特征在于所述抑制劑為天'然纟田菌素(bacteriocin)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘膜發(fā)酵菌劑，其特征在于所述粘膜發(fā)酵菌劑還包括揮發(fā)性脂肪酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的粘膜發(fā)酵菌劑，其特征在于所述揮發(fā)性脂肪酸選自于丁酸、乙酸、丙酸、異戊酸、異丁酸、戊酸、和異己酸中的一種或者其多種的組合。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的粘膜發(fā)酵菌劑，其特征在于所述粘膜發(fā)酵菌劑的輔料包括能改善腸道功能的糖類。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的粘膜發(fā)酵菌劑，其特征在于所述糖類為寡糖(oligosaccharides)。8.—種制備粘膜發(fā)酵菌劑的方法，包含以下步驟步驟一/人無(wú)特定性病原菌感染的動(dòng)物體內(nèi)取出一部分腸道，并徹底清洗去除腸道內(nèi)容物；步驟二在厭氧環(huán)境中，從清洗過(guò)的腸道上切耳又一^a腸粘膜；步驟三將所:取得的腸粘膜置于預(yù)先還原的初級(jí)厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行初級(jí)i咅養(yǎng)以《尋到4刀級(jí);;昆合物；其凈爭(zhēng)4正在于步驟四將步驟三培養(yǎng)的初級(jí)混合物置于一種以上次級(jí)厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行次培養(yǎng)以分離雜菌并獲得菌種。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備粘膜發(fā)酵菌劑的方法，其特征在于所述次培養(yǎng)步驟包括將步驟三培養(yǎng)的初級(jí)混合物置于馬血漿培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以分離雜菌。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備粘膜發(fā)酵菌劑的方法，其特征在于所述次培養(yǎng)步艱《包括將步驟三培養(yǎng)的初級(jí)混合物置于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以分離出乳酸菌、乳酸片J求菌。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備粘膜發(fā)酵菌劑的方法，其特征在于所述次培養(yǎng)步驟包括將步驟三培養(yǎng)的混合物順序置于SBA培養(yǎng)基、血瓊脂和bileesculin瓊月旨中i咅養(yǎng)以分離出糞鏈王求菌。12.根據(jù)權(quán)利要求8至11所述的任意一項(xiàng)的制備粘膜發(fā)酵菌劑的方法，其特4正在于還包4舌下面步驟將步驟四所獲得的培養(yǎng)物在厭氧環(huán)境中在攝氏30到40度的溫度下培養(yǎng)6至12個(gè)小時(shí)。全文摘要本發(fā)明涉及一種粘膜發(fā)酵菌劑及其制備方法。該粘膜發(fā)酵菌劑包括基料、輔料和菌種，其中基料包含預(yù)先還原的厭氧細(xì)菌培養(yǎng)基、葡萄糖、氮化物、以及還原劑；菌種為選自于乳酸桿菌、乳酸片球菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、雙歧桿菌中的一種或者其多種的組合。該制備粘膜發(fā)酵菌劑方法主要包含步驟一，從無(wú)特定性病原菌感染的動(dòng)物體內(nèi)取出一部分腸道并徹底清洗；步驟二，在厭氧環(huán)境中，從清洗過(guò)的腸道上切取一段腸粘膜；步驟三，將所取得的腸粘膜置于一種特定的厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行初級(jí)培養(yǎng)；步驟四，將步驟三獲得的培養(yǎng)物置于一系列厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行多級(jí)次培養(yǎng)以分離雜菌并獲得所需菌種。本發(fā)明方法有利地獲得了具有穩(wěn)定抗菌作用和產(chǎn)品性能的新粘膜發(fā)酵菌劑。文檔編號(hào)C12R1/225GK101294142SQ20071030145公開日2008年10月29日申請(qǐng)日期2007年12月28日優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日發(fā)明者陳明偉申請(qǐng)人:北京惠眾安達(dá)生物技術(shù)有限公司