專利名稱：：靶向wnt-1基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學及醫(yī)學基因治療研究、應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：Wnt-l基因，wnt-l(wingless-typeMMTVintegrationsitefamilymember1)，最早來源于Int-l，1991年NusseA.第一次提出將Int-l命名為Wnt-l，因為lnt-l與wnt基因家族具有同源性。Wnt-l基因由805個腺嘌呤、1523個胞嘧啶、1320個鳥嘌呤、874個胸腺嘧啶組成。目前有些研究成果證明Wnt-1蛋白是控制細胞生長、增殖的關(guān)鍵分泌信號分子，可傳遞細胞間相互調(diào)控信息，該基因在干細胞分化，神經(jīng)發(fā)育中起著重要作用。Wnt-l基因表達的的高低與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。但是wnt-l基因的功能尚未完全清楚。為了清楚的了解該基因在細胞生物學當中的功能，可以為人類許多疾病的治療開辟新的道路。2006年美國加利福尼亞大學YouL.等學者認為WNT-1信號是一個潛在的腫瘤治療靶向基因。目前運用RNA干涉的方法研究基因功能逐漸成為基因功能研究的主流，但是針對wnt-l基因的RNA干涉研究不是很多。僅有的一些研究大多采用化學合成的siRNA片段轉(zhuǎn)染細胞進行干涉，還有一部分采用針對wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞進行研究，但是這些質(zhì)粒缺少標記報告基因和抗性基因，對于轉(zhuǎn)染效率的檢測和篩選穩(wěn)定干涉的細胞株帶來不便。而我們采用的pGPU6/GFP/Neo載體既有還有綠色熒光蛋白的標記報告基因，可以同步檢測質(zhì)粒在細胞內(nèi)表達效率，同時又有Kan/G418的耐受基因，可以方便的篩選穩(wěn)定干涉的細胞株。因此我們插入靶向wnt-l的siRNA片段可以成為研究該基因一個有力的工具。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于構(gòu)建一種可以用于靶向wnt-l、具用標記報告基因和抗性基因的耙向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明將靶向wnt-l基因的siRNA片段插入pGPU6/GFP/Neo載體中，構(gòu)建成靶向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒。本發(fā)明改善了目前針對wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的沒有標記、沒有篩選基因的不足，使針對wnt-l基因進行RNA干涉的質(zhì)粒同時具有上述兩個標記，使得研究wnt-l基因的功能提供更加可靠和便捷的方法。將來為開發(fā)以針對wnt-l相關(guān)的基因治療藥物提供可能。本發(fā)明包括以下具體步驟1)將耙向wnt-l基因的siRNA片段反轉(zhuǎn)錄；2)將反轉(zhuǎn)錄的靶向wnt-l基因的siRNA片段與原靶向wnt-l基因的siRNA片段用loop結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA相連接，再連接轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)形成正義鏈；3)將上述正義鏈反轉(zhuǎn)錄形成反義鏈；4)將正義鏈模板的5'端添加CACC片段，可與Bbsl酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5'端添加GATC片段，可與BamHI酶切后形成的粘端互補。5)將所述正義鏈和反義鏈的寡核苷酸溶液退火反應(yīng)，形成shRNA模板；6)將shRNA模板插入線性的pGPU6/GFP/Neo載體構(gòu)建成耙向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒。為避免形成終止信號，shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA,shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。所述耙向wnt-l基因的siRNA片段為wnt-l誦l:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3?；騱nt-1-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC匿3。圖1pGPU6/GFP/Neo的圖譜圖2重組載體的酶切鑒定圖3重組載體的測序報告具體實施例方式1、根據(jù)人wnt基因的全序列選擇兩個siRNA片段制備shRNA寡核苷酸的合成-根據(jù)人wnt基因(Homosapienswingless-typeMMTVintegrationsitefamily,member1，NM—005430)的全序列選擇兩個siRNA片段,分別命名為wnt-l-l、wnt-1-2:wnt-1-1:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3wnt-1-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC-3(1)根據(jù)設(shè)計的wnt-l-l設(shè)計化學合成耙向wnt-1shRNA的wnt-l-l正義鏈和反義鏈先將wnt-l-l:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3反轉(zhuǎn)錄；形成3國GGACGAATGTCTGAGGTTCTC-5。再將以上兩片段用loop結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA連接，再連接轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)形成wnt-l-l正義鏈GTAAGCAGGTTTTTTG-3經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，形成wnt-l-l反義鏈GAGTCTGTAAGCAGGC-3(2)根據(jù)設(shè)計的wnt-1-2設(shè)計化學合成靶向wnt-1shRNA的wnt-1-2正義鏈和反義鏈先將wnt-l-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC-3反轉(zhuǎn)錄；形成3誦TGCCGCAAATAGAAGCGATAG隱5。再將以上兩片段用loop結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA連接，再連接轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)形成wnt-l-2正義鏈AACGCCGTTTTTTTG-3經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，形成wnt-l-2反義鏈AAGATAAACGCCGTC隱3并在兩個正義鏈模板的5'端分別添加了CACC，與Bbsl酶切后形成的粘端互補；在反義鏈模板的5'端分別添加了GATC，與BamHI酶切后形成的粘端互補。(3)制備shRNA模板將DNA寡核苷酸單鏈分別用TE(pH8.0)溶解，濃度為100uM。取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈寡核苷酸溶液，按照如下配比配置退火反應(yīng)體系。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>在PCR儀上按照如下程序進行退火處理95。C5min;85°C5min;75°C5min;70。C5min;4。C保存。退火處理后得到兩組濃度為10uM的shRNA模板。將所得模板分別溶液稀釋500倍，終濃度為20nM，用于連接反應(yīng)。2、耙向wnt-l基因pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構(gòu)建(1)pGPU6/GFP/Neo載體的線性化如圖1所示pGPU6/GFP/Neo的圖譜取2ugpGPU6/GFP/Neo載體，按照如下體系進行酶切處理:<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>37。C酶切l(wèi)小時，瓊脂糖電泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0(TaKaRa)回收，電泳檢測估算濃度，稀釋濃度至50ng/ul。(2)按照如下體系分別進行兩個載體的連接反應(yīng):<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>22。C連接一個小時。(3)每個連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細胞，涂布到Kanamycin抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37攝氏度培養(yǎng)18小時，各挑取6個菌落，接種到含50ug/mlKanamycin的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用BamHI,PstI分別酶切鑒定。陽性重組載體應(yīng)該可以被BamHI切開，而不能被PstI切開。3、鑒定結(jié)果所有質(zhì)粒用BamHI，PstI分別酶切鑒定。陽性重組載體應(yīng)該可以被BamHI切開，而不能被PstI切開。酶切鑒定質(zhì)粒均為陽性重組載體，每一種載體選擇兩個克隆進行測序鑒定(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。經(jīng)測序設(shè)計的靶向wnt-l基因的shRNA完整被插入pGPU6/GFP/Neo載體。如圖2所示重組載體的酶切鑒定結(jié)果M:lamda/Eco1301，最左側(cè)1-6為wnt-l-l(l-6)Pstl酶切結(jié)果，其右側(cè)l-6為wnt-l-2(l-6)Pstl酶切結(jié)果，其右側(cè)1-6為wnt-l-l(l-6)5謹HI酶切結(jié)果，最右側(cè)1-6為wnt-l-2(l-6)S"附HI酶切結(jié)果。在Marker的左側(cè)所有質(zhì)粒清楚顯示三條帶，說明質(zhì)粒沒有被切開，而Marker的右側(cè)所有質(zhì)粒均被切開，出現(xiàn)一條明亮條帶。如圖3所示A為靴向wnt-l基因的質(zhì)粒wnt-1-1的測序圖，B為耙向wnt-1基因的質(zhì)粒wnt-1-2的測序圖。用通用引物T3PromotorPrimer測序，A圖顯示從268bp開始至330為完整插入的wnt-1-1正義鏈序列，A圖顯示從268bp開始至330為完整插入的wnt-1-2正義鏈序列。<110>揚州大學<120>靶向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法<160>9<210>1<211〉21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人wnt基因的全序列產(chǎn)siRNA片段wnt-l-l<400>1cctgcttacagactccaagag<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人wnt基因的全序列產(chǎn)siRNA片段wnt-l-l的反轉(zhuǎn)錄<400>2ggacgaatgtctgaggttctc<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>loop結(jié)構(gòu)<400>3<210〉4<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-l正義鏈<400>4caccgcctgcttacagactccaagagttcaagagactcttggagtctgtaagcaggtttt60ttg<210>5<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-l反義鏈<400>5gatccaaaaaacctgcttacagactccaagagtctcttgaactcttggagtctgtaagca60ggc<210〉6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人wnt基因的全序列產(chǎn)siRNA片段wnt-l-2<400>6acggcgtttatcttcgctatc<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人wnt基因的全序列產(chǎn)siRNA片段wnt-l-2的反轉(zhuǎn)錄<400>7tgccgca犯t3g肌gcg3teg<210>8<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-2正義鏈<400>8caccgacggcgtttatcttcgctatcttcaagagagatagcgaagataaacgccgttttt60ttg<210>9<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>wnt-l-2反義鏈<400>9gatccaaaaaaacggcgtttatcttcgctatctctcttgaagatagcgaagataaacgcc60gtc權(quán)利要求1.靶向wnt-1基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于將靶向wnt-1基因的siRNA片段插入pGPU6/GFP/Neo載體中，構(gòu)建成靶向wnt-1基因的RNA干涉質(zhì)粒。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)將靶向wnt-l基因的siRNA片段反轉(zhuǎn)錄；2)將反轉(zhuǎn)錄的靶向wnt-l基因的siRNA片段與原靶向wnt-l基因的siRNA片段用loop結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA相連接形成正義鏈；3)將上述正義鏈反轉(zhuǎn)錄形成反義鏈；4)將所述正義鏈和反義鏈的寡核苷酸溶液退火反應(yīng)，形成shRNA模板；5)將shRNA模板插入線性的pGPU6/GFP/Neo載體構(gòu)建成耙向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述靶向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于正義鏈模板的5'端添加CACC片段；反義鏈模板的5'端添加GATC片段。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述靶向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述耙向wnt-l基因的siRNA片段為wnt-1-1:5-CCTGCTTACAGACTCCAAGAG-3。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向wnt-l基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述耙向wnt-l基因的siRNA片段為wnt-1-2:5-ACGGCGTTTATCTTCGCTATC-3。全文摘要靶向wnt-1基因的RNA干涉質(zhì)粒的構(gòu)建方法，屬于分子生物學及醫(yī)學基因治療研究、應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
。將靶向wnt-1基因的siRNA片段插入pGPU6/GFP/Neo載體中，構(gòu)建成靶向wnt-1基因的RNA干涉質(zhì)粒。本發(fā)明改善了目前針對wnt-1基因的RNA干涉質(zhì)粒的沒有標記、沒有篩選基因的不足，使針對wnt-1基因進行RNA干涉的質(zhì)粒同時具有上述兩個標記，使得研究wnt-1基因的功能提供更加可靠和便捷的方法。將來為開發(fā)以針對wnt-1相關(guān)的基因治療藥物提供可能。文檔編號C12N15/65GK101368186SQ200710302590公開日2009年2月18日申請日期2007年12月27日優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日發(fā)明者武永康,段曉春,倫董申請人:揚州大學